摘 要： 旨在探討MKRN3基因在野生型豬和克隆豬中的印記狀態(tài)及其DNA甲基化水平。本研究利用西方豬種（杜洛克豬）與本地豬種（巴馬豬或榮昌豬）中存在的種間單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），檢測MKRN3基因在3只足月出生0天的野生型雜交豬中的印記狀態(tài)。利用MethPrimer網(wǎng)站預(yù)測MKRN3啟動子區(qū)附近的CpG島，并在卵母細(xì)胞和精子基因組中驗(yàn)證CpG島是否為差異甲基化區(qū)域（differentially methylated region，DMR）。對3只野生型雜交豬和兩只克隆豬基因組DNA進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后測序，檢測MKRN3-DMR在野生型豬和克隆豬的甲基化狀態(tài)，并分析其甲基化狀態(tài)與基因表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果表明，在MKRN3基因的編碼區(qū)域，西方豬種（杜洛克豬）與本地豬種（巴馬豬和榮昌豬）之間存在一個(gè)SNP： A/G；RT-PCR測序結(jié)果顯示，MKRN3在其中1只野生型個(gè)體（杜洛克豬與巴馬豬雜交后代：DB2）的心臟組織呈雙等位基因表達(dá)，在肝臟、脾臟、肺等器官和腦組織中均為單等位基因表達(dá)，且均表達(dá)父本來源的等位基因。MKRN3-DMR在精子中表現(xiàn)為低甲基化（0%），在卵母細(xì)胞中表現(xiàn)為高甲基化（70.9%）。雜交豬6個(gè)組織中的MKRN3-DMR平均甲基化水平分別為：心臟（43.1%）、肝臟（46.2%）、脾臟（48.4%）、肺（45.6%）、腎臟（48.5%）、腦（44.3%）；在新生克隆豬的大部分組織中，MKRN3表達(dá)父本來源等位基因，MKRN3-DMR甲基化水平與野生型雜交豬相近。而在NT201和NT207脾臟中，其甲基化水平分別為79.0%和80.1%，SNP測序結(jié)果也表明在兩個(gè)克隆豬脾臟中，MKRN3不再維持印記狀態(tài)，提示克隆豬脾臟組織中MKRN3印記異常。綜上所述，MKRN3在野生型豬肝臟、脾臟、肺、腎和腦組織中呈母本印記、父本表達(dá)，在心臟為非印記狀態(tài)；克隆豬部分組織中，MKRN3印記表達(dá)和甲基化狀態(tài)均為異常；啟動子的DMR調(diào)控MKRN3表達(dá)。

關(guān)鍵詞： DNA甲基化；豬；DMR；基因組印記

中圖分類號： S828.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號： 0366-6964（2024）09-3853-11

Analysis of Imprinted Expression and DNA Methylation Status of the Porcine MKRN3

Gene

CHEN" Nanzhu， LI" Junliang， YU" Dawei， ZHOU" Xinyi， WANG" Jing， ZOU" Huiying*， DU" Weihua*

（Institute of Animal Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract：" The aim of this study was to investigate the imprinting status of the MKRN3 gene and its DNA methylation level in wild type and cloned pigs. The imprinting status of the MKRN3 gene in the 3 wild-type crossbred pigs， which were born at full term， were examined using interspecies single nucleotide polymorphism（SNP） present in Western （Duroc） and local （Bama or Rongchang） pig breeds. CpG islands near the MKRN3 promoter region were predicted using the MethPrimer website， and CpGs were verified as differentially methylated region （DMR） in oocyte and sperm genomes. The genomes of the 3 wild-type hybrid and 2 cloned pigs were sequenced after bisulfite transformation to detect the methylation status of MKRN3-DMR in wild-type and cloned pigs， and to analyze the relationship between methylation status and expression. The results showed that a single nucleotide polymorphism （SNP） existed in the coding region of the MKRN3 gene between Western （Duroc） and local （Bama and Rongchang） pig breeds： A/G; RT-PCR sequencing showed that MKRN3 was bi-allelic expressed in the heart tissue of one of the wild-type individual （offspring of a cross between Duroc pig and Bama pig： DB2）， and monoallelic expressed in organs such as liver， spleen， lungs， and brain tissues， and all of them expressed the allele from paternal origin. MKRN3-DMR showed hypomethylation （0%） in spermatozoa and showed hypermethylation （70.9%） in oocytes. The average methylation levels of MKRN3-DMR in the six tissues of hybrid pigs were： heart （43.1%）， liver （46.2%）， spleen （48.4%）， lung （45.6%）， kidney （48.5%）， and brain （44.3%）， respectively. In most tissues of the newborn cloned pigs， MKRN3 was expressed as the allele of paternal origin， and the level of MKRN3-DMR methylation was similar to that of the wild-type crossbred pigs. While MKRN3-DMR methylation assay results showed that the methylation levels were 79.0% and 80.1% in spleen and spleen of NT201 and NT207， respectively， SNP sequencing results also indicated that the imprinted state was no longer maintained in the two cloned pig spleens. It is suggested that MKRN3 imprinting status was abnormal in cloned pig spleen tissues. In summary， MKRN3 was maternally imprinted and paternally expressed in liver， spleen， lung， kidney and brain tissues of wild-type pigs， and was in a non-imprinted state in the heart; MKRN3 imprinted expression and methylation status were abnormal in some tissues of the cloned pigs. The expression of MKRN3 was regulated by the DMR of the promoter.

Key words： DNA methylation; porcine; DMR; genomic imprinting

*Corresponding authors：DU Weihua， E-mail：duweihua@caas.cn; ZOU Huiying， E-mail：zouhuiying@caas.cn

基因組印記是一種獨(dú)特的遺傳現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為基因轉(zhuǎn)錄活性僅局限于來自單親的等位基因，而對應(yīng)另一個(gè)親本來源的等位基因則處于轉(zhuǎn)錄沉默的狀態(tài)，這類基因被定義為印記基因［1］。印記基因不僅在胚胎發(fā)育階段發(fā)揮重要作用，其表達(dá)異常還會對個(gè)體出生后的代謝功能、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等方面產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響［2-3］。印記基因偏好成簇存在，并且接受順式作用元件的調(diào)控［4-5］。印記基因表達(dá)的調(diào)控區(qū)域受到多種表觀遺傳修飾的影響，包括DNA甲基化、組蛋白修飾以及各類轉(zhuǎn)錄因子的相互作用；其中，DNA甲基化起主導(dǎo)作用［6-10］。與印記基因表達(dá)的親本特異性一致，調(diào)控區(qū)域的甲基化狀態(tài)同樣具有親本來源特異性，即父源或母源染色體上調(diào)控區(qū)域的甲基化狀態(tài)不同，因此被稱為差異甲基化區(qū)域（differentially methylated region，DMR）［11］。在受精后發(fā)生的表觀遺傳重編程進(jìn)程中，DMR甲基化的動態(tài)建立與擦除可分為兩個(gè)階段性過程。受精后，早期胚胎的父源基因組發(fā)生主動去甲基化，而母源基因組則發(fā)生被動去甲基化；然而，印記基因DMR區(qū)域的甲基化狀態(tài)保持穩(wěn)定，不受去甲基化過程的影響。其次，在多能性細(xì)胞分化成原始生殖細(xì)胞（primordial germ cell，PGC）后，PGC中印記基因的DMR和轉(zhuǎn)座子等區(qū)域發(fā)生甲基化的擦除和重建［12］。

MKRN3基因位于調(diào)控普拉德維利綜合征（Prader Willi syndrome，PWS）的印記簇上，已在多個(gè)物種如小鼠、人、牛和羊中被證明是母源印記、父源表達(dá)［13-15］。該基因編碼的MKRN3蛋白含有鋅指結(jié)構(gòu)域，能夠?qū)⒓谆Y(jié)合蛋白3（methyl-DNA binding protein 3， MBD3）泛素化。MDB3蛋白能夠與促性腺激素釋放激素（gonadotropin releasing hormone，GnRH）啟動子結(jié)合，并募集去甲基化酶（ten-eleven-translocation protein，TET）擦除GNRH啟動子區(qū)域的甲基化修飾，從而調(diào)節(jié)GNRH的表達(dá)。在人生長發(fā)育過程中，MKRN3基因的過度表達(dá)會導(dǎo)致泛素化的MBD3蛋白水平升高，進(jìn)而引發(fā)GNRH表達(dá)量減少，這種生理變化與兒童身材矮小、智力發(fā)育遲滯的呆小癥癥狀密切相關(guān)［16-17］。此外，MKRN3基因與人中樞性早熟（central precocious puberty，CPP）的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。小鼠MKRN3蛋白的過表達(dá)會致使雌性小鼠的青春期延遲，而牛MKRN3基因在青春期前后表達(dá)水平存在顯著差異［18］。

在體細(xì)胞核移植后，供體細(xì)胞核會經(jīng)歷一次表觀重編程。體細(xì)胞基因組特有的甲基化、組蛋白修飾會被重編程，X染色體重新激活；而在這個(gè)過程中，印記基因需要維持原有的表觀修飾狀態(tài)［19-20］。諸多研究表明，克隆個(gè)體中印記基因的表達(dá)模式常發(fā)生偏差，且這種偏差與DMR的異常甲基化水平相關(guān)［21］。在猴體細(xì)胞核移植胚胎中，全基因組的DNA甲基化水平下降，母源印記基因的印記狀態(tài)丟失［22］。在克隆豬中，調(diào)控DLK1-DIO3區(qū)域的DMR表現(xiàn)高甲基化，同時(shí)該區(qū)域的基因如GTL2等表達(dá)異常［23］。本研究利用不同豬種間存在的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），對野生型豬和克隆豬不同組織中的MKRN3進(jìn)行印記狀態(tài)分析，并探究MKRN3 DMR甲基化狀態(tài)，揭示MKRN3在野生型豬和克隆豬中的印記表達(dá)規(guī)律，為提高克隆豬效率提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)使用的3只野生型雜交豬（DB1、DB2和DB3）是由杜洛克豬（公豬）和巴馬豬（母豬）雜交獲得的?？寺∝iNT201和NT207的體細(xì)胞為妊娠30 d的杜洛克豬（公豬）與榮昌豬（母豬）雜交后代（RD）的胎兒成纖維細(xì)胞。試驗(yàn)用到的組織樣本包括心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟等器官和腦組織，分別來自出生0 d的野生型雜交仔豬和新生克隆仔豬。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同組織基因組提取

獲得的野生型豬和克隆豬不同組織保存于液氮中，基因組提取步驟參照QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN）制造商提供的標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行處理，提取后取1 μL檢測濃度并記錄。

1.2.2 不同組織RNA提取和RT-PCR

在組織樣本中加入1 mL Trizol（Invitrogen）和適量研磨磁珠，使用超低溫研磨儀研磨8 min。隨后加入200 μL氯仿進(jìn)行相分離，收集上層水相，加入600 μL異丙醇進(jìn)行沉淀。沉淀物用1 mL乙醇洗滌后，溶解于20 μL DEPC處理過的水中，并儲存在－80℃條件下。RT-PCR反應(yīng)試劑來自PrimeScript RT reagent Kit（TaKaRa），按照制造商的說明進(jìn)行操作。

1.2.3 SNP檢測

在ENSEMBL數(shù)據(jù)庫檢索Sus scrofa 11.1基因組，獲取MKRN3基因外顯子區(qū)域的序列。設(shè)計(jì)特異性引物（表1），對不同品種豬MKRN3外顯子進(jìn)行全長的分段PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送往北京華大六合進(jìn)行測序。分析測序結(jié)果中峰圖的雙峰位置：在雜交豬測序中表現(xiàn)為雙峰，但是父母本中為單峰的即為候選SNP。擴(kuò)增體系（25 μL）：KOD OneTM PCR Master Mix 12.5 μL，H2O 9.5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，模板1 μL。擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性3 min；98℃變性，55℃退火15 s，68℃延伸15 s，循環(huán)35次；68℃延伸5 min，儲存于4℃或－20℃。

1.2.4 印記狀態(tài)分析

在MKRN3基因的蛋白編碼區(qū)（coding sequence，CDS）重新設(shè)計(jì)特異性引物（表1），以野生型雜交豬和克隆豬的不同組織cDNA為模板，以25 μL體系進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物送北京六合華大測序，對測序結(jié)果中SNP的峰圖進(jìn)行分析，表現(xiàn)為父源堿基則為父源表達(dá)，母源印記，否則為父源印記。

1.2.5 亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化

取1 μg的各組織基因組DNA，加入85 μL亞硫酸氫鹽混合物和35 μL DNA保護(hù)緩沖液，按照表2中的程序進(jìn)行處理。后續(xù)洗脫步驟參照EpiTect Bisulfite Kit（QIAGEN）進(jìn)行。

1.2.6 甲基化水平分析

使用特異性甲基化測序引物（表1）對MKRN3-DMR進(jìn)行巢式擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物使用E.Z.N.A Gel Extraction Kit（Omega Bio-tek）純化。純化后的產(chǎn)物與TOPO-Blunt Cloning Mix中載體連接：37℃反應(yīng)5 min后，置于冰上。取33 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞加入以上反應(yīng)液中，置于冰上30 min，42℃熱激30 s，迅速置于冰上2 min。將大腸桿菌混合物均勻涂到帶有氨芐抗性的培養(yǎng)基上，待其吸收完后倒置于37℃培養(yǎng)箱中過夜生長。次日選取至少8個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR，將PCR產(chǎn)物送北京六合華大測序。測序結(jié)果使用"" 甲基化分析量化工具（QUMA; http：//quma.cdb.rikenjp/）分析甲基化狀態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1 豬MKRN3基因印記表達(dá)分析

2.1.1 豬MKRN3基因的SNP檢測

為探究MKRN3基因在3種豬種間是否存在SNP，針對MKRN3外顯子DNA序列設(shè)計(jì)引物（表1），使得擴(kuò)增產(chǎn)物能夠完整覆蓋CDS序列。以杜洛克（Duroc）、巴馬豬（Bama）、榮昌豬（Rongchang）及其雜交豬胎兒成纖維細(xì)胞（RD）、克隆豬（NT）和雜交豬腦組織（DB）的基因組DNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增測序，檢測MKRN3基因是否存在SNP。結(jié)果顯示，在杜洛克豬與巴馬豬、榮昌豬的基因組中鑒別出一個(gè)SNP位點(diǎn)（圖1）。該SNP位于1∶14249695（A/G變異），位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的第764 bp。

2.1.2 豬MKRN3基因在不同組織的印記狀態(tài)分析

在對雜交豬MKRN3基因印記狀態(tài)的研究中，本試驗(yàn)重新在候選SNP附近設(shè)計(jì)引物（cDNA-SNP1F和cDNA-SNP1R），對野生型雜交豬DB1、DB2和DB3的不同組織樣本進(jìn)行深入分析。首先，從各組織中提取總RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA，以此作為模板進(jìn)行擴(kuò)增包含候選SNP位點(diǎn)的169 bp片段。隨后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序以獲取序列信息。測序結(jié)果表明，在肝臟、脾臟、肺、腎臟以及腦組織中，MKRN3基因的SNP位點(diǎn)均呈現(xiàn)單一峰，表明這些組織中表達(dá)的是父本來源的等位基因（A）。然而，MKRN3基因在雜交豬DB2的心臟中表現(xiàn)為雙峰（A/G），表明存在母本等位基因的表達(dá)；而DB1和DB3個(gè)體的心臟組織中，SNP位點(diǎn)則顯示單一峰，即父本等位基因表達(dá)（A）（圖2）?？梢?，在不同個(gè)體的心臟組織中，MKRN3基因的表達(dá)模式可能存在差異。綜上所述，在野生型雜交豬的多數(shù)組織中，MKRN3基因的表達(dá)模式為父本特異性印記；而在心臟組織中，該基因的印記模式存在個(gè)體差異。

2.2 豬MKRN3基因甲基化狀態(tài)分析

2.2.1 豬MKRN3基因的CpG預(yù)測

利用Methprimer網(wǎng)站（https：//www.urogene.org/methprimer/）的在線工具，對第一外顯子上游2 000 bp以及下游3 000 bp，總計(jì)5 000 bp的區(qū)域進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MKRN3啟動子附近存在兩個(gè)CpG島，分別命名為CpG島1（－274 bp～－35 bp，239 bp）和CpG島2（－17 bp～+84 bp，102 bp）。由于兩個(gè)CpG島在基因組中的相對位置較為接近，因此合并兩個(gè)CpG島作為一個(gè)潛在的DMR進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證（圖3）。

2.2.2 豬MKRN3基因的甲基化狀態(tài)分析

對合并后的DMR設(shè)計(jì)兩對特異性引物（MKRN3-WF1、 MKRN3-WR1， MKRN3-NF1、 MKRN3-NR1），用以分析豬MKRN3基因的甲基化狀態(tài)。在對精子、卵母細(xì)胞以及野生型雜交豬的不同組織器官進(jìn)行基因組甲基化處理之后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，對擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物測序。研究結(jié)果揭示，在精子中MKRN3 DMR區(qū)域呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)（0%），而在卵母細(xì)胞中則觀察到高甲基化狀態(tài)（70.9%），這一現(xiàn)象與差異甲基化的特征相符合（圖4）。進(jìn)一步地，在野生型雜交豬的不同組織中，MKRN3-DMR區(qū)域表現(xiàn)出差異性的甲基化模式：一半的鏈表現(xiàn)為高甲基化的狀態(tài)，另一半的鏈表現(xiàn)為低甲基化的狀態(tài)，總體呈現(xiàn)50%左右的甲基化水平。其中，心臟組織的平均甲基化水平約為43.1%，肝臟為46.2%，脾臟為48.4%，肺為45.6%，腎臟為48.5%，腦組織為44.3%（圖4）。

精子和卵母細(xì)胞中觀察到的差異甲基化模式表明，所鑒定的CpG富集區(qū)域?yàn)樨iMKRN3基因的DMR。同時(shí)，在各種組織中DMR區(qū)域維持中等水平的甲基化狀態(tài)，這也進(jìn)一步證實(shí)該區(qū)域作為MKRN3基因調(diào)控的關(guān)鍵DMR區(qū)域。

2.3 克隆豬MKRN3基因印記異常

2.3.1 克隆豬MKRN3基因的印記狀態(tài)分析

為了探究克隆豬MKRN3基因的表達(dá)印記狀態(tài)，本研究從兩只克隆豬的不同組織中提取總RNA。將這些RNA通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)轉(zhuǎn)化為cDNA，并以此作為模板，使用特定的引物（表1）針對MKRN3基因上的SNP位點(diǎn)進(jìn)行PCR，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。測序結(jié)果表明，在肝臟、肺、腎臟和腦組織中，MKRN3基因的SNP位點(diǎn)均表現(xiàn)為單一峰（圖5），且所表達(dá)的堿基均為父本來源（A），這與野生型雜交豬中的印記模式相一致。然而，在脾臟組織中，MKRN3基因的SNP位點(diǎn)則呈現(xiàn)出雙峰（A/G），表明在克隆豬的脾臟組織中，MKRN3基因的印記狀態(tài)不同于野生型雜交豬（圖5）。因此，在克隆豬的肝臟、肺、腎臟和腦組織中，MKRN3基因的表達(dá)印記狀態(tài)得到保持，但在某些組織如脾臟中，印記狀態(tài)丟失。

2.3.2 克隆豬MKRN3基因的甲基化狀態(tài)分析

在探究印記基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的過程中，DNA甲基化被廣泛認(rèn)為是關(guān)鍵的表觀遺傳修飾方式。因此，本研究旨在在克隆豬心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺和腦組織中對MKRN3基因的DMR甲基化水平進(jìn)行系統(tǒng)檢測。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在表達(dá)異常的兩只克隆豬脾臟中，MKRN3的DMR區(qū)域出現(xiàn)異常的高甲基化現(xiàn)象（圖6A），甲基化水平分別為79%和80.1%，明顯高于野生型雜交豬脾臟組織的甲基化水平（圖6B）。然而，在心臟、肝臟、腎臟、肺和腦組織中MKRN3 DMR的甲基化水平與野生型雜交豬的相應(yīng)組織水平相當(dāng)（圖6B）。因此，克隆豬脾臟組織中MKRN3基因表達(dá)異常與DMR區(qū)域異常高甲基化相關(guān)，而其他組織中該基因的DMR甲基化狀態(tài)正常，并維持印記表達(dá)的模式。

3 討 論

印記基因的表達(dá)模式在不同物種間通常具有較高的保守性。例如，在人類、小鼠、牛和羊等物種中，MKRN3基因在心臟、肝臟和腦等關(guān)鍵組織器官中均表現(xiàn)為印記狀態(tài)。然而，本研究發(fā)現(xiàn)MKRN3基因在豬的不同組織中的印記狀態(tài)并不一致，特別是在心臟組織中MKNR3表現(xiàn)為非印記狀態(tài)，這種差異性可能與印記基因所具有的組織特異性表達(dá)模式相關(guān)，同時(shí)也突顯了不同個(gè)體中印記基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性。小鼠Slc38a4基因在胎盤中表現(xiàn)出印記狀態(tài)，轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)承擔(dān)轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的功能；然而牛Slc38a4基因并非印記基因［24-27］。因此，即使印記基因在進(jìn)化過程中具有一定的保守性，但其表達(dá)模式和功能在不同物種間仍存在顯著差異。對印記基因的跨物種比較研究有助于深化對其保守性和多樣性的理解。

經(jīng)典印記基因的調(diào)控機(jī)制中，差異甲基化區(qū)域扮演著至關(guān)重要的角色。小鼠和人Nespas基因的DMR被認(rèn)為是Gnas印記簇的調(diào)控中心，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)兩個(gè)反義基因Gnasxl和Gnas的表達(dá)，類似于一個(gè)“開關(guān)”［28］。在不同組織中DMR的甲基化水平可能普遍維持在中等程度，但大多數(shù)印記基因的表達(dá)具有明顯的組織特異性，表明可能有別的機(jī)制參與印記基因組織特異性的調(diào)控，如組蛋白乙酰化參與人NDN基因的組織特異的表達(dá)［29］。

本研究中，克隆豬脾臟的MKRN3 DMR甲基化出現(xiàn)異常，該基因也呈現(xiàn)出雙重表達(dá)的異常現(xiàn)象，表明DNA甲基化在MKRN3基因表達(dá)調(diào)控中的關(guān)鍵作用。在野生型豬中，MKRN3 DMR的差異甲基化狀態(tài)與其單等位基因表達(dá)的印記狀態(tài)一致，說明DMR甲基化水平是維持正常印記狀態(tài)的關(guān)鍵因素。這些結(jié)果揭示了在印記基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制中，DMR的甲基化狀態(tài)作為調(diào)控中心，精確控制父母源等位基因的表達(dá)模式［30-31］?？寺∝i和野生型豬中的發(fā)現(xiàn)提示，DMR甲基化水平的改變可能是導(dǎo)致印記狀態(tài)異常的關(guān)鍵因素，這對于理解克隆動物的發(fā)育異常和疾病發(fā)生至關(guān)重要。研究顯示，多能性基因POU5F1 DMR在克隆牛中出現(xiàn)異常高甲基化，導(dǎo)致POU5F1表達(dá)下降［32］。在克隆牛胎兒的肌肉、心臟和肝臟等組織中，IGF2R基因表達(dá)的降低引起胎兒異常增大，類似于Beckwith-Wiedemann綜合征中由IGF2基因印記異常引起的胎兒過度生長［33］?？寺∝iDLK1-DIO3的IG-DMR甲基化水平異常升高，導(dǎo)致其出生死亡［23］。另一方面，卵母細(xì)胞在去核化前已具備完整的雌性配子表觀遺傳修飾，這可能對其重編程能力產(chǎn)生影響［34］。

由于試驗(yàn)樣本有限，本研究僅能對6個(gè)組織的印記狀態(tài)進(jìn)行分析。胎盤組織是一個(gè)依賴印記基因調(diào)控生長的器官，本試驗(yàn)缺少胎盤組織，因此也不能對MKRN3在胎盤的印記狀態(tài)進(jìn)行分析［35-36］。此外，除了DNA甲基化參與印記基因表達(dá)的調(diào)控之外，各種組蛋白修飾以及染色質(zhì)開放程度等因素也是未來進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

4 結(jié) 論

在豬的肝臟、脾臟、肺、腎臟以及腦組織中，MKRN3基因表現(xiàn)為母源印記基因，即主要表達(dá)父本等位基因；然而，在心臟組織中，該基因的印記表達(dá)模式在不同個(gè)體之間不一致，并非嚴(yán)格遵循典型的母源印記模式。位于啟動子附近的CpG島為負(fù)責(zé)調(diào)控MKRN3表達(dá)的DMR；克隆豬部分組織中MKRN3的DMR甲基化異常，進(jìn)而導(dǎo)致基因的異常表達(dá)。本研究揭示了野生型豬和克隆豬中MKRN3的印記狀態(tài)，為通過修復(fù)異常的印記基因提高克隆效率提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)（References）：

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（編輯 郭云雁）