摘 要： 旨在探究槲皮素（quercetin）修復(fù)脂磷壁酸（lipoteichoic acid， LTA）誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞（mammary alveolar cells-large T antigen， MAC-T）緊密連接損傷的作用機(jī)制。本試驗(yàn)以MAC-T為研究對(duì)象，設(shè)置不同濃度的LTA組（0、0.1、1、10 μg·mL-1）、不同濃度的槲皮素組（0、5、10、20 μmol·L-1）、空白組，檢測(cè)不同濃度LTA和槲皮素對(duì)MAC-T細(xì)胞活力的影響。設(shè)置對(duì)照組（不做任何處理）、低、中、高濃度LTA組（0.1、1、10 μg·mL-1），篩選LTA最佳作用濃度；設(shè)置對(duì)照組（不做任何處理）、高濃度LTA+低濃度槲皮素（5 μmol·L-1）、高濃度LTA+中濃度槲皮素組（10 μmol·L-1）、高濃度LTA+高濃度槲皮素組（20 μmol·L-1），篩選槲皮素最佳作用濃度。在自噬與緊密連接關(guān)系的研究中，將細(xì)胞分為對(duì)照組（不做任何處理）、高濃度LTA組、高濃度LTA+中濃度槲皮素組、高濃度LTA+自噬抑制劑氯喹（chloroquine，CQ）組（50 μmol·L-1）。每組均進(jìn)行3次重復(fù)，槲皮素與氯喹均在LTA作用前加入，即使用槲皮素和氯喹分別孵育細(xì)胞3 h后，再加入10 μg·mL-1 LTA繼續(xù)培養(yǎng)12 h，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)不同濃度LTA和槲皮素對(duì)MAC-T活力的影響，利用Western blot和免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞緊密連接蛋白（Occludin、ZO-1、Claudin-1）和自噬相關(guān)蛋白（Beclin-1、LC3、P62）的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，中、高濃度LTA對(duì)MAC-T活力有顯著影響，但細(xì)胞活性維持在90%以上，不同濃度槲皮素對(duì)MAC-T活力均無(wú)顯著影響。此外，LTA誘導(dǎo)后的MAC-T中緊密連接蛋白表達(dá)降低，自噬水平升高；槲皮素作用MAC-T后，細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)升高，自噬水平降低；自噬抑制劑CQ作用后，自噬水平被抑制，緊密連接蛋白表達(dá)升高。LTA可導(dǎo)致MAC-T自噬過(guò)度激活，破壞緊密連接功能，而槲皮素可通過(guò)抑制自噬恢復(fù)緊密連接功能。該研究結(jié)果為奶牛乳腺炎的治療提供了新的研究思路和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 槲皮素；奶牛乳腺上皮細(xì)胞；脂磷壁酸；自噬；緊密連接

中圖分類號(hào)： S823.91

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 0366-6964（2024）09-3887-10

Quercetin Inhibits Autophagy to Restore LTA-induced Tight Junction Function in Mammary

Alveolar Cells-large T Antigen

LI" Xiangchen， WANG" Linnan， YU" Zhengqing， ZHANG" Li， YANG" Chenchen， SONG" Liangli*

（College of Animal Science and Technology， Ningxia University， Yinchuan 750021，" China）

Abstract：" The aim of this study was to investigate the mechanism of action of quercetin in repairing lipoteichoic acid （LTA）-induced tight junction damage in mammary alveolar cells-large T antigen （MAC-T） of dairy cows. MAC-T was used as the research object， and different concentrations of LTA group （0， 0.1， 1， 10 μg·mL-1）， different concentrations of quercetin group （0， 5， 10， 20 μmol·L-1）， and blank wells were set up to detect the effects of different concentrations of LTA and quercetin on the viability of MAC-T cells; A control group （without any treatment）， low， medium and high LTA concentration groups （0.1， 1 and 10 μg·mL-1） were set up to screen for the optimal concentration of LTA action; A control group （without any treatment）， a high concentration of LTA+low concentration of quercetin （5 μmol·L-1）， a high concentration of LTA+medium concentration of quercetin group （10 μmol·L-1）， and a high concentration of LTA+high concentration of quercetin group （20 μmol·L-1） were set up to screen for the optimal action concentration of quercetin. In the study of the relationship between autophagy and tight junctions， the cells were divided into a control group （without any treatment）， a high-concentration LTA group， a high-concentration LTA+medium-concentration quercetin group， and a high-concentration LTA+autophagy inhibitor chloroquine （CQ） group （50 μmol·L-1）. Each group was subjected to 3 replications， and both quercetin and chloroquine were added before the action of LTA， the cells were incubated with quercetin and chloroquine for 3 h respectively， and then 10 μg·mL-1 LTA was added to continue the incubation for 12 h. The effects of different concentrations of LTA and quercetin on the viability of MAC-T were detected by CCK-8 assay; the expression levels of cellular tight junction proteins （Occludin， ZO-1， Claudin-1） and autophagy-associated proteins （Beclin-1， LC3， P62） were detected by Western blot and immunofluorescence. The results showed that the MAC-T cell activity was maintained at 90% with the increase of LTA concentration， and 5-20 μmol·L-1 quercetin had no significant effect on MAC-T viability （Pgt;0.05）， and the optimal action concentration was further screened by a follow-up experiment on the basis of CCK-8 results. The expression of tight junction proteins of MAC-T was reduced and the level of autophagy was elevated after LTA induction; the expression of tight junction proteins of the cells was elevated and the level of autophagy was reduced after the action of quercetin on MAC-T， the expression of tight junction proteins was elevated and the autophagy level was reduced after CQ treatment. LTA can lead to over-activation of MAC-T autophagy and disruption of tight junction function， whereas quercetin can restore tight junction function by inhibiting autophagy. The results of this study provide new research ideas and theoretical basis for the treatment of mastitis in dairy cows.

Key words： quercetin; mammary alveolar cells-large T antigen; lipoteichoic acid; autophagy; tight junction

*Corresponding author：SONG Liangli， E-mail： sll2019@nxu.edu.cn

奶牛乳腺炎是奶牛最常見(jiàn)的疾病之一，是由物理、化學(xué)或微生物等因素刺激奶牛乳腺所引發(fā)的一種炎癥反應(yīng)［1］，會(huì)造成奶牛泌乳機(jī)能受損，影響產(chǎn)奶量和乳制品質(zhì)量，給奶產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2-3］。研究顯示，金黃色葡萄球菌是造成奶牛乳腺炎最廣泛的致病菌之一［4-6］，其細(xì)胞壁毒力因子脂磷壁酸（lipoteichoic acid， LTA）是金黃色葡萄球菌最主要的致病成分，可引起乳腺上皮細(xì)胞損傷，嚴(yán)重破壞乳房的免疫活性屏障和血乳屏障［7-9］。乳腺上皮細(xì)胞間的緊密連接（tight junction， TJ）作為血乳屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其需要多種蛋白質(zhì)的參與，其中ZO-1、Occludin和Claudin-1已被證實(shí)是維護(hù)上皮細(xì)胞完整性的重要物質(zhì)［10-12］。大量研究表明，炎癥會(huì)引起皮膚、乳腺、腸道等多種器官TJ蛋白表達(dá)降低［13-16］。De Benedetto等［14］在對(duì)皮膚炎癥的研究中發(fā)現(xiàn)，炎癥會(huì)導(dǎo)致特異性皮炎患者皮膚中緊密連接Claudin-1蛋白的表達(dá)顯著下降；在LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎中，小鼠乳腺上皮細(xì)胞的TJ蛋白完整性降低［17］；在腸道中的研究顯示，增強(qiáng)腸道上皮細(xì)胞緊密連接屏障，可以緩解腸道炎癥和腸上皮細(xì)胞的凋亡［18-19］。此外，更進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，自噬激活可增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞緊密連接屏障功能，減輕腸道炎癥［10-11，20-21］。然而，Deng等［22］對(duì)血腦屏障進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)度自噬會(huì)破壞細(xì)胞緊密連接功能，導(dǎo)致腦水腫疾病的惡化。因此，為探明LTA對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞（mammary alveolar cells-large T antigen， MAC-T）緊密連接及自噬功能的作用，使用LTA對(duì)MAC-T進(jìn)行誘導(dǎo)建立緊密連接功能損傷模型，建立該模型對(duì)研究奶牛乳腺炎的發(fā)病機(jī)制極其重要。

槲皮素（quercetin；3， 3′， 4′， 5， 7-五羥基黃酮）是一種黃酮類化合物，廣泛存在于各種水果、蔬菜、花卉及草藥中，具有多種生物學(xué)特性，如抗氧化、抗炎、抗纖維化、抗腫瘤、抗病毒等，因此具有很高的藥用價(jià)值［23-27］。據(jù)報(bào)道，槲皮素不僅能夠恢復(fù)腸炎癥性腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)，而且能夠調(diào)控腸黏膜屏障的緊密連接蛋白和自噬，改善LPS誘導(dǎo)的十二指腸炎癥［28］。然而槲皮素是否能夠調(diào)控LTA誘導(dǎo)的MAC-T中緊密連接蛋白和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，目前尚不可知。

因此，本試驗(yàn)以LTA誘導(dǎo)的MAC-T緊密連接功能損傷模型為研究對(duì)象，探明槲皮素能否通過(guò)調(diào)控自噬恢復(fù)LTA誘導(dǎo)的MAC-T緊密連接功能。該研究結(jié)果將為奶牛乳腺炎的治療提供新的研究思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

MAC-T由實(shí)驗(yàn)室凍存；LTA（默克化工技術(shù)有限公司，貨號(hào)：L3140）；胎牛血清（Gibico，貨號(hào)：16000-044）；胰酶、雙抗、DMEM/F-12培養(yǎng)液、β-actin、FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號(hào)：G4010-100ML、G4003-100ML、G4612-500ML、GB15003-100、GB22303）；RIPA裂解液（白鯊生物，貨號(hào)：BL504A）；槲皮素（上海麥克林生化科技股份有限公司，貨號(hào)：Q817162-10g）；Occludin抗體、ZO-1抗體、Claudin-1抗體、Beclin-1抗體、LC3抗體、P62抗體（Proteintech，貨號(hào)：27260-1-AP、21773-1-AP、28674-1-AP、111306-1-AP、14600-1-AP、18420-1-AP）；Rabbit Anti-Goat IgG Hamp;L/HRP antibody（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-0294R-HRP）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)瓶中提前加入含10 mL·L-1胎牛血清、1 mL·L-1青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液，將液氮凍存的MAC-T細(xì)胞解凍后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞混合均勻后置于50 mL·L-1 CO2、37℃、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

待細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁至80%時(shí)，使用胰酶消化收集細(xì)胞，取部分細(xì)胞懸液稀釋至1×105·mL-1，傳至96孔板中，置于50 mL·L-1 CO2、37℃、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，使用不同濃度的LTA（0、0.1、1、10 μg·mL-1）、不同濃度的槲皮素（0、5、10、20 μmol·L-1）處理，均處理12 h后進(jìn)行檢測(cè)。每組重復(fù)3孔，并設(shè)置空白孔。在測(cè)量前更換培養(yǎng)液，去除藥物對(duì)OD值的影響，每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育2 h后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各孔吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.4 細(xì)胞處理

胰酶消化收集細(xì)胞，以1×106·mL-1密度接種于6孔板中培養(yǎng)，待孔內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)液。LTA 濃度篩選時(shí)，將細(xì)胞分為4組，對(duì)照組（不對(duì)細(xì)胞做任何處理）、低濃度LTA組（0.1 μg·mL-1）、中濃度LTA組（1 μg·mL-1）、高濃度LTA組（10 μg·mL-1）；槲皮素濃度篩選時(shí)，將細(xì)胞分為4組，對(duì)照組（不對(duì)細(xì)胞做任何處理）、高濃度LTA+低濃度槲皮素組（10 μg·mL-1 LTA+5 μmol·L-1槲皮素）、高濃度LTA+中濃度槲皮素組（10 μg·mL-1 LTA+10 μmol·L-1槲皮素）、高濃度LTA+高濃度槲皮素組（10 μg·mL-1 LTA+20 μmol·L-1槲皮素）；在自噬抑制研究中，將細(xì)胞分為4組，對(duì)照組（不對(duì)細(xì)胞做任何處理）、高濃度LTA組、高濃度LTA+中濃度槲皮素組、高濃度LTA+自噬抑制劑氯喹（chloroquine，CQ）組（10 μg·mL-1 LTA+50 μmol·L-1 CQ）。槲皮素組與氯喹均在LTA對(duì)細(xì)胞作用前加入，即使用槲皮素和氯喹分別孵育細(xì)胞3 h后，再加入10 μg·mL-1 LTA繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.5 Western blot檢測(cè)自噬以及緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)

6孔板每孔加入200 μL RIPA，冰上裂解30 min，使用BCA試劑盒調(diào)整蛋白濃度一致，加入5× Loading Buffer，95℃變性20 min，結(jié)束后放入-20℃保存。使用SDS-PAGE凝膠電泳（13.5%）分離蛋白，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉90 min后使用Occludin（1∶2 000稀釋）、ZO-1（1∶2 000稀釋）、Claudin-1（1∶1 000稀釋）、Beclin-1（1∶2 000稀釋）、LC3（1∶1 000稀釋）、P62（1∶2 000稀釋）、β-actin（1∶2 000稀釋）兔多克隆抗體4℃孵育過(guò)夜，TBST清洗3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗（1∶12 000稀釋）孵育1.5 h，TBST清洗3次，每次5 min，清洗結(jié)束使用化學(xué)發(fā)光儀曝光并采集圖像保存顯色結(jié)果，使用Image J軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析，使用β-actin作為參照，計(jì)算Occludin、ZO-1、Claudin-1、Beclin-1、LC3、P62蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 免疫熒光檢測(cè)自噬及緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)

藥物孵育完成后吸去培養(yǎng)液，PBS清洗3次，每次5 min。用提前預(yù)冷的4 mL·L-1多聚甲醛在4℃冰箱固定20 min，室溫復(fù)溫5 min后，棄掉廢液，PBS清洗。使用0.5 mL·L-1 Triton-100室溫孵育20～25 min，PBS清洗。5 mL·L-1山羊血清常溫封閉1～1.5 h后，PBS清洗。滴加Occludin（1∶500稀釋）、ZO-1（1∶2 000稀釋）、Claudin-1（1∶400稀釋）、LC3（1∶500稀釋）一抗工作液，4℃孵育過(guò)夜。次日將樣品室溫復(fù)溫30 min后，回收一抗，PBS清洗。在暗室中加入FITC標(biāo)記熒光二抗（1∶200稀釋），置于不透光的濕盒中37℃孵育1 h后，在暗室中用PBS清洗。暗室中滴加DAPI孵育10 min后，PBS清洗，滴加甘油后封片，于暗室中觀察染色結(jié)果并拍照。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用GraphPad Prism 9.5.0軟件進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)分析。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。多組比較采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，組間比較采用最小顯著差異（least significant difference，LSD）t檢驗(yàn)分析。Plt;0.05表示差異顯著，Plt;0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 LTA和槲皮素對(duì)MAC-T活力的影響

利用CCK-8法檢測(cè)LTA和槲皮素處理后的MAC-T細(xì)胞活力，如圖1所示：LTA與槲皮素處理12 h后，與對(duì)照組相比，LTA對(duì)細(xì)胞活力的影響具有劑量依賴性，隨著LTA濃度的增加，MAC-T細(xì)胞活性降低，當(dāng)LTA濃度達(dá)到10 μg·L-1時(shí)，細(xì)胞活力維持在90%以上，對(duì)細(xì)胞有一定的抑制作用而不會(huì)使細(xì)胞完全失活；5～20 μmol·L-1槲皮素對(duì)MAC-T細(xì)胞活力均無(wú)顯著影響（Pgt;0.05），證實(shí)槲皮素藥物劑量范圍對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用（圖1A、圖1B）。

2.2 不同濃度LTA對(duì)緊密連接、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

LTA對(duì)緊密連接蛋白表達(dá)的影響如圖2A-B所示，Occludin的表達(dá)隨LTA濃度升高逐漸降低，且當(dāng)LTA濃度為1 μg·mL-1、10 μg·mL-1時(shí)，Occludin的表達(dá)顯著低于對(duì)照組（Plt;0.01）；不同濃度LTA組中ZO-1的表達(dá)均顯著低于對(duì)照組，且隨LTA濃度提高，ZO-1的表達(dá)逐漸降低（Plt;0.01）；相比于對(duì)照組，Claudin-1的表達(dá)量在不同LTA處理組中的表達(dá)均顯著降低（Plt;0.01）。

LTA對(duì)自噬蛋白表達(dá)的影響如圖2C-D所示，Beclin-1的表達(dá)隨著LTA濃度升高逐漸升高且均顯著高于對(duì)照組（Plt;0.01）；不同濃度LTA組中LC3的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組（Plt;0.01）；不同濃度LTA組中P62的表達(dá)均顯著低于對(duì)照組（Plt;0.01）。

故選取10 μg·mL-1 LTA作為后續(xù)試驗(yàn)條件。

2.3 槲皮素對(duì)MAC-T炎癥模型中緊密連接和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

槲皮素對(duì)MAC-T炎癥模型中緊密連接蛋白表達(dá)的影響如圖3A-B所示，相比于對(duì)照組，LTA組中Occludin、ZO-1、Claudin-1的表達(dá)均顯著降低（Plt;0.01）；不同濃度槲皮素作用后，10 μmol·L-1槲皮素處理組中緊密連接蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-1的表達(dá)均顯著高于LTA組（Plt;0.01）。圖3E-G為緊密連接蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-1細(xì)胞免疫熒光結(jié)果，結(jié)果顯示LTA處理組中緊密連接蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-1熒光強(qiáng)度減弱，而槲皮素作用后，緊密連接蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-1熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

槲皮素對(duì)MAC-T炎癥模型中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響如圖3C-D所示，相比于對(duì)照組，LTA組中P62的表達(dá)低于對(duì)照組（Plt;0.05），Beclin-1、LC3的表達(dá)均顯著升高（Plt;0.01）；不同濃度槲皮素作用后，P62的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，Beclin-1的表達(dá)顯著降低（Plt;0.01）。經(jīng)過(guò)5 μmol·L-1、10 μmol·L-1槲皮素處理，LC3的表達(dá)量均顯著低于LTA組，20 μmol·L-1無(wú)顯著差異。圖3H所示為自噬蛋白LC3細(xì)胞免疫熒光結(jié)果，結(jié)果顯示LTA處理組中自噬蛋白LC3熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，而槲皮素作用后，自噬蛋白LC3熒光強(qiáng)度減弱。

故選擇10 μmol·L-1槲皮素作為后續(xù)試驗(yàn)條件。

2.4 槲皮素對(duì)LTA誘導(dǎo)的MAC-T緊密連接功能的作用機(jī)制

如圖4A-B所示，相比于對(duì)照組，LTA組緊密連接蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-1表達(dá)量均顯著降低（Plt;0.01）。使用槲皮素作用后，相比于LTA組，緊密連接蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-1表達(dá)量均顯著升高（Plt;0.01）。使用50 μmol·L-1 CQ作用后，相比于LTA組，緊密連接蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-1表達(dá)量均顯著升高（Plt;0.01）。

如圖4C-D所示，相比于對(duì)照組，LTA組自噬蛋白LC3、Beclin-1表達(dá)量顯著上升（Plt;0.01），P62表達(dá)量顯著下降（Plt;0.01）。使用10 μmol·L-1槲皮素作用后，相比于LTA組，自噬蛋白Beclin-1、LC3表達(dá)量均顯著下降（Plt;0.01），P62表達(dá)量顯著上升（Plt;0.01）。使用50 μmol·L-1 CQ作用后，相比于LTA組，自噬蛋白Beclin-1、LC3表達(dá)量均顯著下降（Plt;0.01），P62表達(dá)量顯著上升（Plt;0.01）。

3 討 論

緊密連接蛋白通過(guò)形成細(xì)胞間的密封屏障，阻止物質(zhì)在細(xì)胞間隙中自由擴(kuò)散［29-30］。這種屏障功能使得細(xì)胞能夠?qū)ν饨绛h(huán)境進(jìn)行選擇性的物質(zhì)通透性調(diào)節(jié)，保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定；在組織中起到連接細(xì)胞的作用，使得細(xì)胞能夠緊密地排列在一起形成組織。這種組織屏障的形成，有助于維持組織的結(jié)構(gòu)完整性和功能［31］。緊密連接對(duì)于維持組織和器官功能和結(jié)構(gòu)的完整性非常重要，在上皮組織中尤其常見(jiàn)［32-33］。

乳腺上皮細(xì)胞是乳房重要的免疫活性屏障和物理屏障［4］。在奶牛乳房炎中，病原菌感染會(huì)直接侵害乳腺上皮細(xì)胞，改變緊密連接的表達(dá)，從而破壞血乳屏障，影響乳腺的結(jié)構(gòu)和功能［17］。研究顯示，金黃色葡萄球菌是造成奶牛乳腺炎最廣泛的致病菌之一［4］，其細(xì)胞壁毒力因子脂磷壁酸是金黃色葡萄球菌最主要的致病成分。

正常乳腺上皮細(xì)胞中的緊密連接結(jié)構(gòu)可以防止泌乳期乳汁成分的泄漏，維持MAC-T的正常生理功能［34-35］，當(dāng)金黃色葡萄球菌入侵乳腺時(shí)，破壞了乳房組織的緊密連接結(jié)構(gòu)，引發(fā)乳腺炎［36］。本試驗(yàn)中，使用不同濃度LTA處理MAC-T后，MAC-T緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、ZO-1和Claudin-1的表達(dá)顯著低于對(duì)照組，這與宋潔［37］在MAC-T細(xì)胞中的研究結(jié)果一致，證明了炎癥會(huì)導(dǎo)致緊密連接功能受損。在腸上皮屏障功能障礙的治療中，Cui等［38］研究發(fā)現(xiàn)LPS引發(fā)的過(guò)度自噬引起小鼠腸道TJ蛋白表達(dá)降低，破壞了腸上皮屏障；在血腦屏障功能障礙的治療中，Deng等［22］研究發(fā)現(xiàn)過(guò)度自噬可導(dǎo)致小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞死亡、TJ蛋白降低，導(dǎo)致了疾病的惡化；在小鼠炎癥性腸病的治療中，Li等［39］研究發(fā)現(xiàn)過(guò)度自噬會(huì)損害上皮細(xì)胞的緊密連接，當(dāng)抑制自噬后可以恢復(fù)TJ蛋白的表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，LTA處理后，MAC-T細(xì)胞自噬水平顯著高于對(duì)照組，表明LTA對(duì)MAC-T緊密連接功能的影響可能是自噬過(guò)度激活引起的。

槲皮素作為抗炎物質(zhì)，不僅能夠恢復(fù)腸炎癥性腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)，而且能夠調(diào)控腸黏膜屏障的緊密連接蛋白和自噬改善LPS誘導(dǎo)的十二指腸炎癥［28］。有研究已證實(shí)，槲皮素對(duì)LTA誘導(dǎo)的小鼠乳腺上皮細(xì)胞炎癥的保護(hù)作用［40］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于LTA組，槲皮素處理可顯著增加緊密連接蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-1的表達(dá)，說(shuō)明槲皮素能夠恢復(fù)LTA誘導(dǎo)的緊密連接損傷。此外，Zheng等［41］研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過(guò)調(diào)控自噬，改善小鼠腸道組織緊密連接功能。本試驗(yàn)中，相比于LTA組，槲皮素處理組中P62蛋白表達(dá)水平顯著升高，Beclin-1和LC3的表達(dá)量顯著降低，這和Geng等［42］、黃超等［43］的研究結(jié)果一致，說(shuō)明LTA能夠過(guò)度激活自噬，而槲皮素能夠抑制自噬。當(dāng)使用雷帕霉素（CQ）抑制自噬水平時(shí)，發(fā)現(xiàn)槲皮素對(duì)緊密連接蛋白表達(dá)的影響和CQ是一致的，表明槲皮素是通過(guò)抑制自噬來(lái)恢復(fù)緊密連接功能。

4 結(jié) 論

LTA可使得MAC-T自噬過(guò)度激活，從而破壞緊密連接功能，而槲皮素可通過(guò)抑制自噬增加緊密連接蛋白的表達(dá)，從而恢復(fù)緊密連接功能。該研究結(jié)果為奶牛乳腺炎的治療提供了新的研究思路和理論依據(jù)。

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（編輯 郭云雁）