摘 要： 旨在探究褪黑素對(duì)棕櫚酸（palmitic acid， PA）誘導(dǎo)的牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（bovine endometrial epithelial cells， BEECs）線粒體動(dòng)力學(xué)的影響及機(jī)制。本試驗(yàn)以BEECs為研究對(duì)象，分為3組：對(duì)照組、PA組和褪黑素組，其中，對(duì)照組添加0.2 mmol·L-1 BSA溶劑，PA組添加0.2 mmol·L-1 PA，褪黑素組同時(shí)添加0.2 mmol·L-1 PA和100 nmol·L-1褪黑素。本研究通過CCK8法（n=4）和Annexin V-FITC/PI雙染法（n=3）檢測(cè)細(xì)胞活力和凋亡情況；利用細(xì)胞流式術(shù)檢測(cè)細(xì)胞線粒體內(nèi)的ROS水平（n=3）；進(jìn)一步使用Seahorse XFe96細(xì)胞代謝呼吸動(dòng)態(tài)分析儀檢測(cè)耗氧率、基礎(chǔ)呼吸值、ATP合成能力等線粒體呼吸功能的相關(guān)指標(biāo)（n=4）；qRT-PCR法檢測(cè)線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)基因MFN1、DRP1和PGC1-α的mRNA表達(dá)變化量（n=3）；最后通過Western-Blot法檢測(cè)線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)蛋白MFN1、p-DRP1、DRP1和PGC1-α的表達(dá)變化量（n=3）。結(jié)果顯示：與PA組相比，1）添加褪黑素能顯著降低BEECs線粒體ROS水平（P＜0.05），并顯著提高BEECs活力和顯著降低BEECs凋亡率（P＜0.05）；2）Seahorse結(jié)果提示，添加褪黑素能顯著提高線粒體基礎(chǔ)呼吸值、ATP產(chǎn)量和最大耗氧量（P＜0.05），此結(jié)果表明褪黑素能改善線粒體功能，促進(jìn)線粒體有氧呼吸，增加ATP產(chǎn)量；3）qRT-PCR結(jié)果表明，添加褪黑素能顯著降低MFN1、DRP1的mRNA表達(dá)量，顯著提高PGC1-α的mRNA表達(dá)量（P＜0.05）；4）Western-Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)褪黑素組中MFN1蛋白表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），p-DRP1/DRP1和PGC1-α蛋白表達(dá)量顯著上升（P＜0.05）。綜上，本研究表明褪黑素可能通過改善BEECs線粒體動(dòng)力學(xué)功能，從而緩解PA誘導(dǎo)下的線粒體氧化應(yīng)激和提高線粒體呼吸功能，最終增強(qiáng)BEECs活力和降低BEECs凋亡；本研究初步探究了褪黑素對(duì)PA誘導(dǎo)BEECs損傷的作用機(jī)制，為提高嚴(yán)重NEB奶牛低繁殖力提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 褪黑素；棕櫚酸；牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞；線粒體動(dòng)力學(xué)；凋亡

中圖分類號(hào)：S823.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)： 0366-6964（2024）09-3978-10

Melatonin Alleviates Palmitic Acid-induced Damage in Bovine Endometrial Epithelial

Cells by Improving Mitochondrial Dynamics

WANG" Yi， GONG" Jianfei， HENG" Nuo， HU" Yingfan， WANG" Rui， WANG" Huan， ZHU" Ni， HE" Wei， HU" Zhihui， HAO" Haisheng， ZHU" Huabin， ZHAO" Shanjiang*

（Key Laboratory of Livestock and Poultry Biological Breeding of the Ministry of

Agriculture and Rural Affairs， Institute of Animal Science， Chinese Academy of

Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract：" The aim was to investigate the effect and mechanisms of melatonin on the mitochondrial dynamics of bovine endometrial epithelial cells （BEECs） induced by palmitic acid （PA）. BEECs were used as the research subjects and divided into 3 groups： control group， PA group， and melatonin group. The control group was supplemented with 0.2 mmol·L-1 BSA as the solvent， the PA group was supplemented with 0.2 mmol·L-1 PA， and the melatonin group was supplemented with both 0.2 mmol·L-1 PA and 100 nmol·L-1 melatonin. The experiments included： assessing cell viability and apoptosis using the CCK8 method （n=4） and Annexin V-FITC/PI double staining method （n=3）; detecting the ROS levels in mitochondria using flow cytometry（n=3）; further analyzing mitochondrial respiration-related indicators such as oxygen consumption rate， basal respiration， ATP production capacity using Seahorse XFe96 cellular metabolism analysis system （n=4）; measuring the mRNA expression changes of mitochondrial dynamics-related genes MFN1， DRP1 and PGC1-α were detected by qRT-PCR （n=3）; finally， the protein expression changes of mitochondrial dynamics-related proteins MFN1， p-DRP1， DRP1 and PGC1-α were detected by Western-Blot （n=3）. The results showed that： compared with the PA group， 1） the melatonin significantly reduced the mitochondrial ROS level of BEECs， increased cell viability， and decreased apoptosis rate significantly （P＜0.05）; 2） Seahorse results indicated that melatonin significantly increased mitochondrial basal respiration， ATP production， and maximum oxygen consumption （P＜0.05）， suggesting that melatonin could improve mitochondrial function， promote aerobic respiration， and increase ATP production; 3） qRT-PCR results showed that the melatonin significantly reduced the mRNA expression of MFN1 and DRP1， while significantly increasing the mRNA expression of PGC1-α （P＜0.05）; 4） Western-Blot analysis revealed a significant decrease in MFN1 protein expression and a significant increase in p-DRP1/DRP1 and PGC1-α protein expression in the melatonin group （P＜0.05）. In conclusion， the study suggests that melatonin may alleviate PA-induced mitochondrial oxidative stress and improve mitochondrial respiration by improving mitochondrial dynamics of BEECs， which ultimately enhances the viability of BEECs and reduces apoptosis. This study preliminarily explored the mechanism by which melatonin mitigates PA-induced injury in BEECs， offering a theoretical foundation for improving the low reproductive capacity of severe NEB cows.

Key words： melatonin; palmitic acid; bovine endometrial epithelial cells; mitochondrial dynamics; apoptosis

*Corresponding author：ZHAO Shanjiang， E-mail： zhaoshanjiang@caas.cn

能量負(fù)平衡（negative energy balance， NEB）是高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后常見的代謝性疾病，主要是由于奶牛產(chǎn)后干物質(zhì)攝入無法滿足泌乳所需的能量，從而導(dǎo)致體內(nèi)能量供應(yīng)不足［1］。此時(shí)，如果奶牛不能較快且平穩(wěn)的度過NEB，那么奶牛會(huì)大量動(dòng)員體內(nèi)的脂肪組織進(jìn)行供能，血液中非酯化脂肪酸（NEFA）濃度升高，但當(dāng)脂肪組織分解過多時(shí)，肝臟可能無法完全消化全部的NEFA，導(dǎo)致NEFA在血液中積累，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生脂毒性［2-3］。研究表明，過量的NEFA也會(huì)在子宮中過度沉積，以棕櫚酸（palmitic acid， PA）為代表的高濃度NEFA已被證實(shí)會(huì)對(duì)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（BEECs）的活力和增殖產(chǎn)生負(fù)面影響，包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［4-5］。但是子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞是胚胎與子宮內(nèi)膜“對(duì)話”的第一步，其結(jié)構(gòu)和功能的正常維持對(duì)胚胎的成功附植至關(guān)重要。研究表明，嚴(yán)重NEB奶牛繁殖性能下降，其受胎率顯著低于正常組奶牛［6］。因此，探索NEFA如何影響B(tài)EECs功能和尋找治療靶點(diǎn)以及治療藥物具有重要意義。

研究表明，高濃度脂肪酸會(huì)誘發(fā)肝細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞、精子等多種類型細(xì)胞的線粒體膜電位下降、線粒體ROS水平升高和ATP合成下降，從而導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損［7-9］。線粒體是細(xì)胞內(nèi)主要的能量生產(chǎn)基地，維持線粒體質(zhì)量對(duì)細(xì)胞功能尤為重要。線粒體質(zhì)量控制的重要途徑之一是線粒體動(dòng)力學(xué)，線粒體動(dòng)力學(xué)是指線粒體進(jìn)行融合、分裂和生物發(fā)生等的動(dòng)態(tài)過程［10-12］，有助于維持健康、活躍的線粒體群，提高能量生產(chǎn)效率。然而，Wang等［13］在高脂飲食的大鼠上觀察到線粒體生物合成減少，導(dǎo)致線粒體損傷和細(xì)胞衰老。Chen等［14］的研究也表明，高脂攝入會(huì)損傷大鼠心肌組織中的線粒體生物發(fā)生和線粒體動(dòng)力學(xué)，導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡。因此，高脂脅迫可能會(huì)通過影響線粒體動(dòng)力學(xué)誘導(dǎo)線粒體功能障礙，進(jìn)而損傷細(xì)胞。但是關(guān)于高脂肪酸影響B(tài)EECs線粒體動(dòng)力學(xué)的研究較少。

褪黑素（melatonin， MT）作為一種有效的自由基清除劑，能中和并清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，減少氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞和組織的損傷［15-16］。研究表明，褪黑素通過保護(hù)線粒體功能并抑制冷凍保存的人卵母細(xì)胞的氧化損傷，從而在長(zhǎng)期冷凍保存期間保持其發(fā)育能力［17］。此外，褪黑素與線粒體動(dòng)力學(xué)密切相關(guān)。研究表明，在復(fù)氧階段進(jìn)行褪黑素治療可減少線粒體活性氧（reactive oxygen species， ROS）的產(chǎn)生，提高細(xì)胞活性，促進(jìn)線粒體融合，重塑線粒體網(wǎng)絡(luò)［18］。褪黑素還會(huì)通過抑制裂變和促進(jìn)融合來恢復(fù)失衡的動(dòng)力學(xué)，從而改善肥胖糖尿病動(dòng)物的腎臟線粒體功能受損［19］。但是，添加褪黑素是否能夠緩解PA誘導(dǎo)的BEECs損傷以及可能的調(diào)控機(jī)制還未知。因此，本研究旨在探究褪黑素對(duì)PA誘導(dǎo)的BEECs損傷的影響及機(jī)理，為提高嚴(yán)重NEB奶牛繁殖力提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（BEECs）受贈(zèng)于北京農(nóng)學(xué)院郭勇教授實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司；棕櫚酸購(gòu)自西安鯤創(chuàng)科技發(fā)展有限公司（KC002）；褪黑素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司（貨號(hào)M5250）；CCK8試劑盒、Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒、增強(qiáng)型BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Beyotime公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司（C1062M）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司（6215A）；qRT-PCR試劑盒購(gòu)自ABI公司（A25742）；細(xì)胞裂解液購(gòu)自INVENT公司（IN-WB001）；MitoSOXTM線粒體超氧化物指示劑購(gòu)自Invitrogen公司（M36008）；PAGE凝膠快速制備試劑盒購(gòu)自雅酶公司；5×Loading Buffer緩沖液購(gòu)自Gene-Protein Link公司（P06M18）；抗體PGC1-α購(gòu)自Abcam公司（ab191838）；抗體DRP1（5391s）和p-DRP1（4494s）、MFN1（14739s）、辣酸根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔 IgG 二抗（7074s）購(gòu)自CST公司；高靈敏度ECL化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自Tanon公司。

ThermoFisher細(xì)胞培養(yǎng)箱；Leica共聚焦顯微鏡；BD流式細(xì)胞分析儀；ABI熒光定量PCR；TECAN酶標(biāo)儀；Tanon全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)；安捷倫Seahorse XFe96細(xì)胞代謝呼吸動(dòng)態(tài)分析儀。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、分組

經(jīng)復(fù)蘇后，BEECs呈鵝卵石狀貼附在培養(yǎng)皿底部，細(xì)胞狀態(tài)良好。BEECs于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為：90% DMEM/F12+10% FBS。本研究前期已篩選了PA處理濃度和時(shí)間，分別為0.2 mmol·L-1和12 h。通過文獻(xiàn)查閱本研究選取100 nmol·L-1褪黑素觀察其對(duì)PA處理的BEECs細(xì)胞活力的影響［20-21］。試驗(yàn)分為空白對(duì)照組（control）、棕櫚酸組（PA）、褪黑素組（PA+MT），空白對(duì)照組BEECs在含0.2 mmol·L-1 BSA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，棕櫚酸誘導(dǎo)組BEECs在含0.2 mmol·L-1 PA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，褪黑素組BEECs在含0.2 mmol·L-1 PA+100 nmol·L-1 MT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每組均培養(yǎng)12 h。

1.4 細(xì)胞活力檢測(cè)

將BEECs接種到96孔板中，加入100 μL各組培養(yǎng)基。藥物處理后在各孔加入10 μL CCK-8 溶液，在5% CO2、37℃環(huán)境中孵育1 h。同時(shí)，在等體積的空白組、PA組和褪黑素組培養(yǎng)液中加入CCK-8 溶液用作空白對(duì)照。利用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的OD值。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

收集處理過的細(xì)胞，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，然后加入5 μL Annexin V FITC，輕柔混勻，室溫孵育30 min。在上機(jī)之前加入5 μL碘化丙啶（PI）室溫染色5 min。同時(shí)，未染色細(xì)胞作為陰性對(duì)照，F(xiàn)ITC和PI單染色細(xì)胞作為補(bǔ)償對(duì)照。然后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)制備的細(xì)胞，使用FlowJo進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 線粒體活性氧檢測(cè)（ROS）

收集處理過的BEECs，用500 nmol·L-1 MitoSOXTM染色，在37℃避光條件下培養(yǎng)30 min。每10 min上下顛倒一次混合物。然后，用DMEM/F12洗滌BEECs三次。最后使用流式細(xì)胞儀對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，使用FlowJo進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7 線粒體功能及代謝檢測(cè)（Seahorse）

在Seahorse XF 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中以1×104個(gè)·孔-1的密度接種BEECs，在各組中加入對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基處理BEECs 12 h。加入含10 mmol·L-1葡萄糖、1 mmol·L-1丙酮酸鈉和2 mmol·L-1谷氨酰胺的測(cè)試培養(yǎng)基，在37℃，無CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞1h。在A、B、C加樣孔位中依次加入1 μmol·L-1寡霉素、1 μmol·L-1羰基-氰-對(duì)-三氟甲氧基苯肼（Fccp）以及1 μmol·L-1魚藤酮和1 μmol·L-1抗霉素A的混合物。最終按細(xì)胞數(shù)進(jìn)行歸一化。

1.8 qRT-PCR檢測(cè)線粒體動(dòng)力學(xué)關(guān)鍵基因表達(dá)水平

收集BEECs后，參照說明書提取細(xì)胞總RNA，利用RNA反轉(zhuǎn)試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后使用熒光定量試劑盒對(duì)目的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。所有引物均在NCBI primer-BLAST上設(shè)計(jì)，以β-Actin為參照基因。由華大基因公司合成引物。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃逆轉(zhuǎn)2 min，95℃預(yù)變性2 min；95℃變性1 s，60℃退火30 s，循環(huán)40次。采用2-ΔΔCT方法計(jì)算每個(gè)基因的表達(dá)水平。表1列出了引物的信息。

1.9 蛋白免疫印跡

用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，然后用增強(qiáng)型BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。把蛋白質(zhì)樣品與5×Loading Buffer緩沖液按比例混合后，在100℃下煮沸5 min。然后，利用10% SDS-PAGE分離蛋白，并將其轉(zhuǎn)移到NC膜上。用含5%脫脂奶粉的封閉液在室溫下封閉2 h，然后將膜在4℃下與一抗孵育過夜。第二天，膜在室溫下與辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗孵育2 h。最后，用高靈敏度ECL化學(xué)發(fā)光液在TANON全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)中顯色，并用ImageJ軟件進(jìn)行定量分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析均運(yùn)用SAS 9.2軟件進(jìn)行分析，結(jié)果采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）”表示。多組間采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05說明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 褪黑素對(duì)PA誘導(dǎo)的BEECs活力的影響

通過CCK8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PA組BEECs細(xì)胞活力顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），褪黑素組BEECs細(xì)胞活力顯著高于PA組（P＜0.05）（圖1）。提示0.2 mmol·L-1PA會(huì)降低BEECs活力，而褪黑素有助于緩解PA誘導(dǎo)的細(xì)胞活力損傷。

2.2 褪黑素對(duì)PA誘導(dǎo)的BEECs凋亡的影響

通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PA組的活細(xì)胞比例低于對(duì)照組，PA組的早凋和晚凋細(xì)胞比例均高于對(duì)照組；褪黑素組的活細(xì)胞比例顯著高于PA組（P＜0.05），褪黑素組的晚凋細(xì)胞比例顯著低于PA組（P＜0.05），褪黑素組的早凋細(xì)胞比例呈下降趨勢(shì)（圖2）。以上結(jié)果提示，PA會(huì)誘導(dǎo)BEECs凋亡，"" 而褪黑素有助于減少PA誘導(dǎo)的BEECs凋亡。

2.3 褪黑素對(duì)PA誘導(dǎo)的BEECs線粒體氧化應(yīng)激的影響

線粒體內(nèi)ROS水平是線粒體氧化應(yīng)激的重要標(biāo)志，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)照組、PA組、褪黑素組內(nèi)的ROS水平發(fā)現(xiàn)，褪黑素有助于降低PA誘導(dǎo)的BEECs線粒體超氧化物積累，降低了線粒體ROS水平。具體表現(xiàn)為：PA組BEECs的ROS水平中位值顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），褪黑素組BEECs的ROS水平中位值顯著低于PA組（P＜0.05）（圖3）。

2.4 褪黑素對(duì)PA誘導(dǎo)的BEECs線粒體呼吸功能的影響

Seahorse細(xì)胞能量代謝分析儀檢測(cè)表明，PA會(huì)損傷BEECs線粒體氧化磷酸化功能，加入褪黑素能改善線粒體氧化磷酸化功能。圖4A是對(duì)照組、PA組和褪黑素組BEECs實(shí)時(shí)耗氧率曲線圖，本試驗(yàn)分析了3組的基礎(chǔ)呼吸值（圖4B）、ATP合成（圖4C）和最大耗氧量（圖4D），結(jié)果表明，PA組的基礎(chǔ)呼吸值、ATP合成和最大耗氧量均顯著低于對(duì)"" 照組（P＜0.05），褪黑素組的基礎(chǔ)呼吸值、ATP合成和最大耗氧量均顯著高于PA組（P＜0.05），其基礎(chǔ)呼吸值和最大耗氧量甚至顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），說明褪黑素對(duì)PA誘導(dǎo)線粒體的呼吸能力降低有較大的改善作用。

2.5 褪黑素對(duì)PA誘導(dǎo)的BEECs線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)基因表達(dá)的影響

考慮到褪黑素對(duì)PA處理下BEECs線粒體呼吸功能的影響，本研究進(jìn)一步對(duì)線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)基因MFN1、DRP1和PGC1-α等進(jìn)行基因表達(dá)水平檢測(cè)。qRT-PCR結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比，PA組MFN1、DRP1和PGC1-α的基因表達(dá)量都在顯著升高（P＜0.05）；與PA組相比，褪黑素組有關(guān)線粒體融合的基因MFN1表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），褪黑素組有關(guān)線粒體分裂的基因DRP1表達(dá)量也顯著下降（P＜0.05），褪黑素組有關(guān)線粒體生物發(fā)生的基因PGC1-α表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）。

2.6 褪黑素對(duì)PA誘導(dǎo)的BEECs線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

進(jìn)一步檢測(cè)了線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果如圖6所示，與PA組相比，褪黑素組的線粒體融合蛋白MFN1的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)（P＞0.05），且顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；褪黑素組的線粒體分裂蛋白p-DRP1/DRP1的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和PA組（P＜0.05）；褪黑素組的線粒體生物發(fā)生蛋白PGC1-α的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和PA組（P＜0.05）。

3 討 論

產(chǎn)后奶牛，特別是高產(chǎn)奶牛如果不能較快且有效的度過NEB時(shí)期，則會(huì)引發(fā)體脂的過度動(dòng)員以滿足泌乳需求，導(dǎo)致血液中的NEFA濃度過高。以PA為代表的高濃度NEFA已被證實(shí)會(huì)對(duì)BEECs的活力和增殖產(chǎn)生負(fù)面影響，但是具體作用機(jī)制不明。此外PA在多種細(xì)胞中（比如牙周韌帶細(xì)胞、肌腱衍生細(xì)胞）被證明可以誘發(fā)脂質(zhì)過載［22-23］，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［24-25］。本研究也發(fā)現(xiàn)，0.2 mmol·L-1 PA處理BEECs 12 h顯著降低了BEECs的活力，增加BEECs的凋亡率。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，0.2 mmol·L-1 PA處理顯著上調(diào)了BEECs線粒體ROS水平，Seahorse結(jié)果進(jìn)一步表明，棕櫚酸在誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的同時(shí)，還會(huì)降低線粒體呼吸能力，導(dǎo)致線粒體功能障礙。這與Broniarek等［26］的研究結(jié)果一致，高濃度棕櫚酸會(huì)導(dǎo)致線粒體超氧化物的產(chǎn)生，誘導(dǎo)線粒體氧化磷酸化和解偶聯(lián)。褪黑素作為一種強(qiáng)效的廣譜抗氧化劑［27-28］，可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的侵害，發(fā)揮抗氧化作用，維持細(xì)胞的健康狀態(tài)。本研究為了緩解PA誘導(dǎo)的BEECs損傷，在PA處理BEECs的同時(shí)添加了褪黑素。與預(yù)期結(jié)果一致的是褪黑素顯著降低了PA誘導(dǎo)下BEECs的線粒體氧化應(yīng)激，從而增強(qiáng)了BEECs活力，降低了BEECs凋亡率。褪黑素是如何影響線粒體功能從而緩解棕櫚酸誘導(dǎo)的BEECs損傷呢？目前研究較少。

線粒體是脂肪酸氧化釋放能量的場(chǎng)所，主要通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP。已有研究表明，褪黑素能夠恢復(fù)肥胖小鼠的電子呼吸鏈中復(fù)合物Ⅱ的活性并使三羧酸循環(huán)正常化，從而調(diào)節(jié)線粒體呼吸功能［29］。在肥胖糖尿病大鼠的棕色脂肪中，褪黑素還可以通過降低線粒體呼吸鏈工作時(shí)的質(zhì)子泄露及提高氧化磷酸化效率來改善線粒體功能［30］，與本研究結(jié)果一致，褪黑素能夠逆轉(zhuǎn)PA誘導(dǎo)的基礎(chǔ)呼吸值、最大耗氧量和ATP合成的降低，最終提高線粒體的呼吸功能。

在機(jī)制上，本研究還發(fā)現(xiàn)褪黑素能改善PA誘導(dǎo)的線粒體動(dòng)力學(xué)。相比于PA組，添加褪黑素會(huì)顯著降低線粒體融合基因MFN1的mRNA表達(dá)量，在蛋白表達(dá)量上，MFN1呈下降趨勢(shì)，這說明褪黑素可能會(huì)抑制PA誘導(dǎo)下的線粒體融合，阻止了線粒體數(shù)量的減少［31］。添加褪黑素后，線粒體分裂基因DRP1的mRNA表達(dá)量顯著低于PA組，但是p-DRP1/DRP1蛋白表達(dá)量顯著高于PA組，說明DRP1蛋白可能在Ser616位點(diǎn)發(fā)生磷酸化。DRP1是線粒體分裂的關(guān)鍵蛋白，它能夠在線粒體外膜上形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，收縮并切割線粒體。Ser616位點(diǎn)磷酸化有助于提高DRP1蛋白的活性，促進(jìn)線粒體的分裂［32］。線粒體可以通過分裂清除受損的部分，以保持線粒體自身的健康狀態(tài)。然而在大多數(shù)情況下，褪黑素通過抑制線粒體分裂以面對(duì)外界刺激［33-34］。但是也正如Chang等［35］的發(fā)現(xiàn)一樣，在營(yíng)養(yǎng)過載時(shí)，線粒體分裂是一種儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)避免能量浪費(fèi)的一種方式，而本研究所用的PA正是一種能量物質(zhì)。考慮到添加褪黑素后線粒體融合的減少以及分裂的增加，BEECs可能更傾向于有效清除線粒體受損的部分，以維持健康的線粒體群。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)添加褪黑素后促進(jìn)線粒體生物發(fā)生基因PGC1-α的mRNA表達(dá)和其蛋白表達(dá)量均顯著高于PA組，同時(shí)PA組PGC1-α的mRNA和其蛋白表達(dá)量也均顯著高于對(duì)照組，這說明在加入棕櫚酸后，細(xì)胞就已經(jīng)在積極生產(chǎn)新的線粒體代替功能受損的線粒體，而同時(shí)添加褪黑素能進(jìn)一步推進(jìn)線粒體的合成，產(chǎn)生更多的線粒體為細(xì)胞供能［36］。以上結(jié)果表明，褪黑素參與推動(dòng)線粒體生物發(fā)生，促進(jìn)年輕線粒體的產(chǎn)生，同時(shí)通過線粒體裂變清除舊的、受損的和不可修復(fù)的線粒體。

4 結(jié) 論

綜上所述，褪黑素可以降低PA誘導(dǎo)的BEECs線粒體氧化應(yīng)激，同時(shí)還能通過改善PA誘導(dǎo)的線粒體動(dòng)力學(xué)提高線粒體的呼吸功能，最終減少PA誘導(dǎo)的BEECs凋亡。本研究初步探究了褪黑素緩解PA誘導(dǎo)BEECs損傷的作用機(jī)制，為治療NEB奶牛低繁殖力提供了理論依據(jù)。

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（編輯 郭云雁）