摘 要： 分別采用1-乙基-（3-二甲氨基丙基） 碳酰二亞胺（EDC） 和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS） 交聯(lián)法、甲基丙烯酸酐（MA） 修飾光聚合交聯(lián)法和苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基磷酸鋰（LAP） 光交聯(lián)法制備了3 種膠原基支架材料，并對其微觀結構、理化性能和生物學性能進行了評價。結果表明：這 3 種交聯(lián)法制備的膠原基支架材料的孔洞結構具有顯著差異，其孔徑范圍均為50～250 μm，符合組織修復材料對孔徑的需求。此外，通過MA 復合光交聯(lián)所得的膠原基支架材料（Col-MA），其抗壓強度可達2.17 MPa，滿足組織工程理想支架材料對力學性能的基本要求。生物相容性實驗結果表明，這3 種支架材料均能夠為細胞生長提供合適的空間以及供應足夠的營養(yǎng)物質。

關鍵詞： 膠原；組織工程；支架材料；交聯(lián)；多孔結構；生物材料

中圖分類號： Q819 文獻標志碼： A

人體皮膚[1]、角膜[2] 和血管[3] 等組織器官容易因機械損傷、疾病等原因而使正常功能紊亂。目前臨床常用的治療手段是通過自體或異體組織移植來進行修復或替換[4]。然而，可供患者選擇的高質量供體器官嚴重缺乏[5]，遠不能滿足臨床實際需求。因此，國內外研究者嘗試通過組織工程方法在體外構建與天然組織具有相似成分、結構與功能的仿生支架材料應用于不同組織修復[6，7]。膠原蛋白作為一種天然高分子材料，因具有良好的理化性能和卓越的生物學性能[8]，被廣泛應用于組織工程領域。然而，膠原分子往往因力學性能不足而限制了其在特定環(huán)境下的應用[9]，因此常需通過各種交聯(lián)方法來提高膠原基支架材料的理化性能。鑒于此，針對不同組織器官的修復重建，探索構建結構及性能與體內微環(huán)境更匹配的組織工程膠原基支架材料具有重要的研究意義。

針對具有特定需求的組織缺損修復，國內外研究者們嘗試通過不同交聯(lián)方法構建了多種膠原基支架材料。Koz?owska 等[10] 通過脫水熱交聯(lián)制備所得的膠原/磷酸鈣（ Col/Cap） 復合支架相較于未交聯(lián)制備的Col/Cap 復合支架，力學強度顯著提高，可應用于骨組織工程。Scialla 等[11] 采用京尼平交聯(lián)法制備的膠原基支架可促進人間充質干細胞軟骨分化，從而實現(xiàn)支架材料對軟骨受損組織的修復與治療。Heo 等[12] 通過核黃素光交聯(lián)制得透明質酸-膠原基復合材料，顯著提高了純膠原基支架材料的力學性能和降解速率。此外，Mu 等[13] 以具有可生物降解性和抗病毒活性[14，15] 的二醛淀粉為交聯(lián)劑制備出一種新的膠原基支架材料，該種材料具有良好的熱穩(wěn)定性和保濕性，可用于皮膚組織工程研究。Gu 等[16] 以聚磷酸鹽為交聯(lián)劑制備的復合膠原基支架，在健康大鼠模型中體現(xiàn)出優(yōu)良的止血性能，該研究為牙周組織修復提供了一種選擇方案。

雖然國內外學者們嘗試通過各種交聯(lián)方式制備膠原基支架材料用于組織修復，但是，如何通過最優(yōu)的途徑獲得與特定組織結構與性能更匹配的膠原基支架材料仍有待進一步研究。本文選擇具有不同特性和交聯(lián)效果的3 種交聯(lián)方法： 1-乙基-（3-二甲氨基丙基） 碳酰二亞胺（EDC） 和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS） 交聯(lián)法（EDC/NHS 交聯(lián)）、甲基丙烯酸酐（MA） 修飾光聚合交聯(lián)法和苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基磷酸鋰（LAP） 光交聯(lián)法分別制備了3 種膠原基支架材料（Col-EDC/NHS 支架、Col-MA 支架和Col-LAP 支架），并對其微觀結構、理化性能和生物相容性進行綜合評價。通過對比研究，篩選出組織工程膠原基支架材料的幾種重要材料學因素，為未來膠原基支架材料的應用提供一些理論和技術支撐。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與儀器

Ⅰ型膠原（Col）：來源于新西蘭牛跟腱； NHS、EDC：分析純，純度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；冰醋酸：分析純，純度≥98%，國藥集團化學試劑有限公司；LAP：蘇州永沁泉智能設備有限公司；超純水：臺式實驗室純水系統(tǒng) （美國millipore 公司）；人皮膚成纖維細胞（HSF）：北納生物技術有限公司；α-MEM 培養(yǎng)基：Gibco 公司； 3- （4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四氮唑噻唑藍 （MTT）：生興生物公司；胎牛血清：Gibco賽默飛世爾科技（中國） 有限公司；4'，6-二脒基-2 苯基吲哚（DAPI）、四甲基異硫氰酸羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽（TRITC）、免疫染色通透液（Triton X-100）：上海碧云天生物技術股份有限公司；牛血清白蛋白（BSA）：蘇州瑞諾德生物科技有限公司。

LGJ-10 型冷凍干燥機（美國Labconco 公司）；IS 50 型傅里葉紅外光譜儀（FT-IR，美國Thermo-Nicolet Co公司）； JSM-IT100 型掃描電子顯微鏡（SEM，日本JEOL 公司）； 209F3 型熱重分析儀（TGA，德國耐馳公司）；ELF3200 型生物材料力學性能試驗機（美國Bose 公司）；Infinite f 50 型微孔板式連續(xù)波長酶標儀（瑞士 Tecan公司）；CELL OBSERVER 型活細胞工作站（德國蔡司公司）。

1.2 膠原基支架的制備

1.2.1 EDC/NHS 交聯(lián)

首先，將Ⅰ型膠原溶解在乙酸溶液中配制成7.5 mg/mL 的膠原溶液。然后，以質量比m（Col）∶m（EDC）∶m（NHS）=6∶1∶1 稱取EDC 和NHS，在4 ℃ 下交聯(lián)反應4 h，獲得Col-EDC/NHS 溶液體系。最后，將該溶液體系注入模具中，先在?20 ℃ 下預凍12 h，接著在?80 ℃ 條件下預凍24 h 以上，置于冷凍干燥機中凍干得Col-EDC/NHS 支架。

1.2.2 MA 修飾光聚合交聯(lián)

首先，量取1.0 mL 的MA（0.1 mol/L） 緩慢加入到50 mL 膠原溶液（7.5 mg/mL）中，在4 ℃ 下攪拌過夜，凍干得MA-膠原海綿。然后，將其溶解在乙酸溶液中，配制成7.5 mg/mL 的MA-膠原溶液。以LAP 為交聯(lián)劑，將LAP 溶于超純水中配制成體積分數(shù)為0.1% 的交聯(lián)溶液后，將其加入到MA-膠原溶液中，在4 ℃ 下攪拌交聯(lián)30 min 得Col-MA 凝膠交聯(lián)體系。隨后，將其置于波長365 nm 的紫外光下照射3 min 后成型。最后，參照1.2.1 節(jié)的梯度降溫過程凍干得Col-MA 支架。

1.2.3 LAP 光交聯(lián)

首先，按照質量比m（Col）∶m（LAP） =20∶1 稱取LAP，并將其加入到7.5 mg/mL 的膠原溶液中，在4 ℃ 下攪拌交聯(lián)30 min 獲得Col-LAP 凝膠交聯(lián)體系。隨后將其注入模具中，在波長365 nm 的紫外光下照射3 min 后成型。最后參照1.2.1 節(jié)的梯度降溫過程凍干得Col-LAP 支架。

1.3 測試與表征

1.3.1 紅外光譜表征

分別取3 組支架樣品與溴化鉀均勻混合后裝入模具中壓片，在4 500～500 cm?1 掃描波數(shù)范圍以2 cm?1 分辨率進行測試。

1.3.2 形貌特征

將3 種支架樣品制備成圓柱狀后，置于掃描電子顯微鏡樣品臺上，噴金處理，隨后在10 kV的加速電壓下觀察樣品的微觀結構。

1.3.3 支架的孔隙率（RP）

采用乙醇置換法測定膠原基支架的孔隙率。比重瓶中裝入無水乙醇稱重mE；將干態(tài)多孔膠原基支架（mS）浸沒于無水乙醇中，吸去超出刻度線的無水乙醇后稱重（m1）；超聲脫氣后取出支架，將容器和剩余乙醇稱重（m2）。RP 按公式（1）計算，每種樣品取3 個平行樣進行測定。

Rp = [（m1 -m2 -ms）=（mE -m2）]×100% （1）

1.3.4 吸水率（RA）

用天平稱取支架樣品 （m3） 并將其浸泡在磷酸鹽緩沖液（PBS）中，在特定時間取出并用濾紙快速吸去表層水，吸水后支架的質量記為。RA 按公式（2）計算，每組支架重復測3 次。

RA = [（m′3-m3）／m3]×100% （2）

1.3.5 體外降解率（RD）

將支架樣品切塊、稱重（m4）后浸在 5 mL PBS 中，放置于 37 ℃ 培養(yǎng)箱里振蕩，每天更換新鮮的PBS。按照擬定的時間間隔，取出浸泡在PBS 里的支架，擦干支架表面水分并稱重（m′4）。RD 按公式（3）計算，每組樣品測試3 次。

RD = [（m4 -m′4）／m4]×100% （3）

1.3.6 熱重分析

稱取膠原基支架6～10 mg，氮氣保護，起始溫度設為25 ℃，控制升溫速率為10 ℃/min，升溫至800 ℃。根據(jù)溫度和質量分數(shù)，繪制熱重曲線。

1.3.7 力學性能表征

將支架樣品裁成 14 mm× 14 mm×12 mm 并浸泡在PBS 中，通過生物材料力學性能試驗機對其濕態(tài)樣品進行力學性能測試。以0.5 mm/min 的加載速率進行單軸壓縮試驗以獲得恒定的應變速率。根據(jù)應力-應變數(shù)據(jù)計算抗壓強度和楊氏模量，每組測試3 個樣品。

1.4 支架材料生物相容性測試

1.4.1 MTT 法測定細胞毒性

首先對HSF 進行消化并計數(shù)，以每孔5 000 個細胞的密度將細胞接種于96 孔板中，置于37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h 后，棄去原培養(yǎng)液用PBS 清洗并更換培養(yǎng)基。然后加入各組支架浸提液各100 μL 繼續(xù)培養(yǎng)1， 3，5 d 后取出培養(yǎng)板，棄去原培養(yǎng)液，并向每孔中加入100 μL 的培養(yǎng)基和10 μL 的 MTT檢測液，放回恒溫箱里孵育4 h 后終止培養(yǎng)。最后棄去原有液體，加入100 μL DMSO 振蕩15 min，采用微孔板式連續(xù)波長酶標儀測定溶解液在波長490 nm 下的吸光度 （A）。

1.4.2 熒光染色

首先使用無菌PBS 清洗紫外滅菌后的3 種支架材料樣品，接著向裝有支架材料的24 孔板中注入100 μL 細胞懸液并補加150 μL 培養(yǎng)基后置于培養(yǎng)箱里。分別在第1，2，3 d 取出孔板并用質量分數(shù)為4% 的多聚甲醛固定支架30 min，接著，使用體積分數(shù)為1% 的 TritionX-100 溶液通透處理，再用質量分數(shù)為5% 的BSA 封閉30 min 后用PBS 沖洗。最后使用Pha-TRITC 對細胞骨架染色1 h 后使用DAPI 染色5 min，通過活細胞工作站觀察支架材料中染色的HSF 生長狀態(tài)。

1.4.3 統(tǒng)計分析

本實驗所有數(shù)據(jù)均以平均值±方差表示，且使用 Origin 2021 軟件對數(shù)據(jù)和圖像進行處理。

2 結果與討論

2.1 支架材料的紅外表征

3 種膠原基支架材料的紅外光譜測試結果如圖1所示。從圖1 能夠觀察到膠原酰胺 A 帶在2 855～3 800 cm?1 處有一個寬吸收峰，代表了N―H 的伸縮振動；3 200～3 400 cm?1 處是―OH 的特征峰；酰胺B 帶為―CH2―的伸縮振動峰，其特征峰對應于2 775～2 970 cm?1 處；其中在1 491～1 660 cm?1 處的峰位歸屬于酰胺 Ⅰ 帶的C=O 伸縮振動；酰胺 Ⅱ 帶代表C―N 的伸縮振動，在1 519～1 559 cm?1 處可見其峰位；酰胺Ⅲ帶對應1 096～1 237 cm?1 處的峰位，代表N―H 的彎曲振動。3 種膠原基支架均具有膠原蛋白的特征吸收峰。值得注意的是，與Col-EDC/NHS 支架的酰胺特征峰相比，Col-MA 支架在1 635 cm?1 處無 C=C 特征吸收峰出現(xiàn)，這說明MA 被成功修飾到膠原蛋白分子鏈上并發(fā)生了自由基聚合反應。 綜上所述，3 種膠原基支架材料被成功構建。

2.2 支架材料的形貌

從3 種膠原基支架材料的掃描電鏡圖（圖2） 中可以觀察到，3 種樣品均呈現(xiàn)出良好的多孔洞結構且孔隙相連。Col-EDC/NHS 支架凍干后呈立體多孔結構，且孔徑為50～80 μm。Col-MA 支架內部呈現(xiàn)出立體網(wǎng)格狀多孔結構且孔洞相互聯(lián)通，孔徑為 150～200 μm。這可能是因為MA 的引入使得膠原蛋白分子間形成新的化學鍵合，從而形成孔洞結構致密的多孔膠原基支架[17]。Col-LAP 支架內部呈多邊形，且孔徑為100 μm。LAP 作為新的化學交聯(lián)成分使得聚合物分子間發(fā)生交聯(lián)反應，從而改變膠原纖維的排列和結構重組，而呈現(xiàn)出與前兩者不同的孔洞結構。綜上所述，不同交聯(lián)方法對膠原基支架材料的多孔結構產生了影響，合適的孔徑范圍適應不同的組織修復需求，提供合適的細胞環(huán)境和力學支持，促進組織再生和修復過程的進行[18， 19]。

2.3 支架材料的孔隙率

合適的孔隙率對于膠原基支架促進組織再生以及細胞黏附和生長發(fā)揮著重要作用[20]。圖3 所示為3 種膠原基支架的孔隙率。Col-EDC/NHS、Col-MA 和Col-LAP 支架的孔隙率分別為（76.7±1.4）%、（88.6±1.2）% 和（90.9±1.2）%。此外，與Col-EDC/NHS 支架相比，Col-MA 和Col-LAP 支架的孔隙率得到了提升。這可能歸因于Col-MA 支架和Col-LAP 支架的孔徑更加均一，孔洞分布更加均勻，且孔與孔之間連通性良好。進一步說明不同的交聯(lián)方式對支架的孔徑、孔洞數(shù)量、孔與孔的連通性和孔洞是否均勻分布均有影響，從而影響膠原基支架的孔隙率。

2.4 支架材料的吸水性能

良好的吸水性能可以使膠原基支架材料維持人體組織的正常生理環(huán)境，同時促進細胞附著和增殖以及細胞外基質的形成。3 種膠原基支架的吸水率如圖4 所示。隨著時間的增加，3 種膠原基支架的吸水率隨之增加，且在第24 h 吸水率均達到飽和并趨于穩(wěn)定。膠原中包含―OH、―COOH、―NH2 等大量親水基團，在這些親水基團作用下，膠原基支架可大量吸收水分子。此外，與Col-EDC/NHS 支架相比，Col-MA 和Col-LAP支架的吸水性能得到提升。

2.5 支架材料的降解性能

3 種膠原基支架材料的降解性能測試結果如圖5 所示。隨著時間的延長，3 種膠原基支架材料的體外降解率均增加，其中Col-MA 和Col-EDC/NHS 的降解速率相對緩慢。推測交聯(lián)劑MA 與EDC/NHS 的引入可能與膠原中的氨基酸，如賴氨酸和羥脯氨酸反應，形成非可逆的酰胺鍵，這些酰胺鍵能夠連接多個膠原鏈，致使最終形成了穩(wěn)定的交聯(lián)網(wǎng)絡結構，Col-MA 和Col-EDC/NHS 支架材料具有穩(wěn)定可控的降解性能，該性能使膠原基支架材料的應用場景不僅可以應用于皮膚傷口愈合，還可以作為藥物或生物活性物質的載體材料[21]。

2.6 支架材料的熱重分析

3 種膠原基支架材料的TGA 曲線如圖6 所示。結果表明，在45～800 ℃ 的升溫范圍內，3 種膠原基支架材料均有3 個明顯的熱失重階段：第一階段為水分蒸發(fā)階段（45～200 ℃），這是由于溫度逐漸升高后，膠原分子內或分子間氫鍵被破壞導致物理吸附水蒸發(fā)，失重率為6%～8%。第二階段為3 種支架材料的主要失重階段（200～540 ℃），隨著膠原鏈（肽鍵） 在熱作用下發(fā)生斷裂，膠原逐漸被降解為多肽和氨基酸，最終氨基酸殘基被破壞，發(fā)生脫氨、脫水，此階段中，Col-MA 和Col-LAP 的質量變化趨勢趨于一致，在500 ℃ 左右的失重率約為45%，而Col-EDC/NHS 的失重率則接近60%，在相同溫度下失重更多，說明相較于EDC/NHS 交聯(lián)，膠原蛋白經(jīng)MA 或LAP 交聯(lián)后，膠原分子在熱作用下的肽鍵穩(wěn)定性提高，更難發(fā)生斷裂，膠原的熱穩(wěn)定性得到了較大改善。第三階段為膠原蛋白熱解產物發(fā)生炭化的煅燒階段（540～800 ℃），3 種膠原基支架材料的質量損失速率均緩慢下降并趨于平穩(wěn)。

2.7 支架材料的力學性能

由3 種膠原基支架材料的力學性能測試結果（圖7）可知，3 種膠原基支架材料的應力均隨著壓縮強度的增加而增加，當3 種支架材料同時被壓縮至50% 時，Col-MA 支架材料的抗壓強度能達到2.17 MPa，而Col-LAP 和Col-EDC/NHS 支架材料的抗壓強度則分別只能達到1.84 MPa 以及1.35 MPa。這可能是由于甲基丙烯酸酐與膠原蛋白之間可實現(xiàn)更高程度的交聯(lián)，形成緊密的網(wǎng)絡結構，使得Col-MA 支架材料具有更高的強度和剛度，能夠承受更大的壓縮力。綜上所述，3 種交聯(lián)方法會對膠原基支架材料的力學性能產生不同影響，所以在選擇膠原基支架材料時，需要根據(jù)具體的應用需求和性能要求進行綜合考慮。具有較優(yōu)力學性能的Col-MA 支架材料有可能適用于骨組織修復、關節(jié)軟骨修復、肌腱修復等需要承受較大力學載荷的組織修復領域，而Col-EDC/NHS 支架材料則可適用于軟組織修復、藥物和生物活性因子載體等方面[22， 23]。

2.8 支架材料的生物相容性機制

3 種膠原基支架材料浸提液與細胞培養(yǎng)1、3 d 和5 d后，對細胞增殖情況進行定量分析，結果如圖8 所示。

各組細胞懸液的吸光度均隨著時間的延長而增加，細胞在培養(yǎng)1 d 后，迅速增殖，并且在培養(yǎng)至5 d 時，細胞數(shù)量達到最高值。表明通過3 種不同交聯(lián)方法制得的膠原基支架材料均具有良好的生物相容性。這是由于膠原蛋白能夠與細胞表面的特定受體結合， 從而調控細胞的生理功能， 促進細胞的增殖、分化和遷移。

為了更直觀地觀察HSF 細胞在Col-EDC/NHS，Col-MA 以及Col-LAP 膠原基支架內部的生長黏附情況，使用Pha-TRITC 和DAPI 對培養(yǎng)1、2 d 及3 d后的細胞進行染色（圖9）。HSF 細胞在3 種膠原基支架材料內部都表現(xiàn)出良好的黏附與增殖能力。在培養(yǎng)HSF 1 d 后，3 種膠原基支架材料中能觀察到的細胞數(shù)目較少。隨著培養(yǎng)時間的延長，膠原基支架中的細胞數(shù)量明顯增多，呈現(xiàn)典型的長梭形形態(tài)，且HSF 大多貼附著膠原基支架的孔壁纖維生長。在培養(yǎng)3 d 后，支架中的細胞數(shù)量進一步增加，整個支架中充滿了伸展狀態(tài)良好的成纖維細胞。由此說明，經(jīng)過3 種交聯(lián)方式制備得到的多孔支架仍然保持良好的細胞相容性，能為細胞提供有利于促進黏附和增殖的細胞外基質環(huán)境。同時，支架內部的多孔結構也可為營養(yǎng)物質的輸送提供足夠的空間，促使細胞不斷增殖。

3 結 論

（1） 以膠原蛋白為原材料，通過EDC/NHS 交聯(lián)法， MA 修飾光聚合交聯(lián)法和LAP 交聯(lián)法成功制備了3 種具有不同多孔結構和理化性能的組織工程支架材料。

（2） Col-EDC/NHS 膠原基支架適用于皮膚組織所需支架的理想孔徑，Col-MA 支架適用于骨組織所需支架的理想孔徑。與Col-EDC/NHS 支架相比，Col-LAP 支架具有更高的吸水性能，可促進細胞附著和增殖以及細胞外基質的形成。

（3） 具有較優(yōu)力學性能的Col-MA 支架材料適用于骨組織修復等組織修復領域。

（4）3 種膠原基支架材料均具有良好的生物相容性，可以滿足組織器官修復和重建的生物學安全要求，HSF 均可在其內部良好生長。

參考文獻：

[ 1 ]JORGENSEN A M， VARKEY M T，" GORKUN A A， ClOUSE C， XU L， CHOU Z， MURPHY S V， MOLNAR J A， LEE S J， YOO J J， SOKER S， ATALA A J. Bioprinted skin recapitulates normal collagen remodeling in full-thickness wounds [J]. Tissue Engineering： Part A，2020，26（9/10）：512-526.

[ 2 ]BARRIENTEZ B， NICHOLAS S E， WHELCHEL A， SHARIF R， HJORTDAL J， KARAMICHOS D. Corneal injury： Clinical and molecular aspects [J]. Experimental Eye Research，2019，186：107709.

[ 3 ]DEVILLARD C D， MARQUETTE C A. Vascular tissue engineering： Challenges and requirements for an ideal large scale blood vessel [J]. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology，2021，9：721843.

[ 4 ]OLI A N， ROWAIYE A B， ADEJUMO S A， ANAZODO F I， AHMAD R， SINHA S， HAQUE M， ADNAN N. Classic and current opinions in human organ and tissue transplantation [J]. Cureus，2022，14（11）：e30982.

[ 5 ]SAIDI R F， KENARI S K H. Challenges of organ shortage for transplantation： Solutions and opportunities [J]. International Journal of Organ Transplantation Medicine，2014，5（3）：87-96.

[ 6 ]LYNCH C R， KONDIAH P P D， CHOONARA Y E. Advanced strategies for tissue engineering in regenerative medicine： A biofabrication and biopolymer perspective [J]. Molecules，2021，26（9）：2518.

[ 7 ]何愷凝， 黃思齊， 褚朝陽， 崔昆明. 高強韌水凝膠的形變和破壞行為 [J]. 功能高分子學報，2023，36（3）：203-220.

HE K N， HUANG S Q， CHU Z Y， CUI K M. Deformation and fracture behavior of strong and tough hydrogels [J]. Journal of Functional Polymers，2023，36（3）：203-220.

[ 8 ]LIN Z， TAO Y， HUANG Y， XU T， NIU W. Applications of marine collagens in bone tissue engineering [J]. Biomedical Materials，2021，16（4）：042007.

[ 9 ]GURUMURTHY B， JANORKAR A V. Improvements in mechanical properties of collagen-based scaffolds for tissue engineering[J]. Current Opinion in Biomedical Engineering，2021，17：100253.

[10]KOZLOWSKA J， SIONKOWSKA A. Effects of different crosslinking methods on the properties of collagen-calcium phosphate composite materials [J]. International Journal of Biological Macromolecules，2015，74：397-403.

[11]SCIALLA S， GULLOTTA F， IZZO D， PALAZZO B， SCALERA F， MARTIN I， SANNINO A， GERVASO F. Genipin-crosslinked collagen scaffolds inducing chondrogenesis： A mechanical and biological characterization [J]. Journal of Biomedical Materials Research： Part A，2022，110（7）：1372-1385.

[12]HEO J， KOH R H， SHIM W， KIM H D， YIM H， HWANG N S. Riboflavin-induced photo-crosslinking of collagen hydrogel and its application in meniscus tissue engineering [J]. Drug Delivery and Translational Research，2015，6：148-158.

[13]MU C， LIU F， CHENG Q， LI H， WU B， ZHANG G， LIN W. Collagen cryogel cross-linked by dialdehyde starch [J]. Macromolecular Materials and Engineering，2010，295：100-107.

[14]SKOPINSKA-WISNIEWSKA J， WEGRZYNOWSKA-DRZYMALSKA K， BAJEK A， MAJ M， SIONKOWSKA A. Is dialdehyde starch a valuable cross-linking agent for collagen/elastin based materials？ [J]. Journal of Materials Science： Materials in Medicine，2016，27（4）：67.

[15]XIAO S Y， LIU X M， TONG C Y， ZHAO L C， LIU X J， ZHOU A M， CAO Y. Dialdehyde starch nanoparticles as antitumor drug delivery system： An in vitro， in vivo， and immunohistological evaluation [J]. Chinese Science Bulletin，2012，57（24）：3226-3232.

[16]GU J T， JIAO K， LI J， YAN J F， WANG K Y， WANG F， LIU Y， TAY F R， CHEN J H， NIU L N. Polyphosphate-crosslinked collagen scaffolds for hemostasis and alveolar bone regeneration after tooth extraction[J]. Bioactive Materials， 2021， 15：68-81.

[17]YANG J， LI Y， LIU Y， LI D X， ZHANG L， WANG Q G， XIAO Y M， ZHANG X D. Influence of hydrogel network microstructures on mesenchymal stem cell chondrogenesis in vitro and in vivo [J]. Acta Biomaterialia，2019，91：159-172.

[18]ZHANG Z F， FENG Y H， WANG L， LIU D X， QIN C C， SHI Y B. A review of preparation methods of porous skin tissue engineering scaffolds [J]. Materials Today Communications，2022，32：104109.

[19]TORGBO S， SUKYAI P. Bacterial cellulose-based scaffold materials for bone tissue engineering [J]. Applied Materials Today，2018，11：34-49.

[20]JENKINS T L， LITTLE D. Synthetic scaffolds for musculoskeletal tissue engineering： Cellular responses to fiber parameters [J]. NPJ Regenerative Medicine，2019，4：15.

[21]ZHANG H， ZHOU L， ZHANG W. Control of scaffold degradation in tissue engineering： A review [J]. Tissue Engineering： Part B，Reviews，2014，20（5）：492-502.

[22] SULTANA N. Functional 3D Tissue Engineering Scaffolds[M].UK：Woodhead Publishing， 2018：1-21.

[23]ROHL L， LARSEN E， LINDE F， ODGAARD A， JORGENSEN J. Tensile and compressive properties of cancellous bone [J]. Journal of Biomechanics，1991，24（12）：1143-1149.

基金項目： 國家自然科學基金（81900814）