【摘 要】目的：探討靶向核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的siRNA和甲氨蝶呤（MTX）復(fù)合納米脂質(zhì)體對膠原誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠骨破壞的影響。方法：將48只健康SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組

10只和造模組38只。造模成功的30只大鼠隨機(jī)分為模型對照組、MTX組、MTX復(fù)合納米脂質(zhì)體組

（si-MTX組），每組10只。測量各組大鼠治療前后體質(zhì)量、臟器指數(shù)、足趾腫脹度、血清中炎性因子水平，以及滑膜組織中相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：MTX和復(fù)合納米脂質(zhì)體均可顯著降低膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)、足跖腫脹度，降低血清中炎癥因子水平，調(diào)節(jié)滑膜組織中相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)（P < 0.05），且si-MTX組作用更強(qiáng)（P < 0.05）。結(jié)論：復(fù)合納米脂質(zhì)體發(fā)揮作用的機(jī)制可能是阻斷了NF-κB通路，減少促炎因子釋放，抑制骨吸收，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，且靶向性、安全性更高。

【關(guān)鍵詞】 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；siRNA；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；甲氨蝶呤；納米；脂質(zhì)體；骨破壞

The Effects of siRNA Targeting Nuclear Transcription Factor-κB and Methotrexate Nanoliposomes on Bone Destruction in Rheumatoid Arthritis Rats

DUAN Wei-feng，ZHANG Jing-wei，LU Yan-yan，DU Zhi-jun

【ABSTRACT】Objective：To investigate the effects of siRNA targeting nuclear transcription factor-κB and methotrexate nanoliposomes on bone destruction in rheumatoid arthritis rats.Methods：Forty-eight healthy SD rats were randomly divided into a blank control group of 10 rats and a model group of 38 rats.Thirty successfully modeled rats were randomly divided into a model control group，an MTX group，and an MTX composite nanoliposome group（si-MTX group），with 10 rats in each group，measuring the body mass，organ index，toe swelling，serum inflammatory factor levels，as well as the expression levels of related genes and proteins in synovial tissue of rats in each group before and after treatment.Results：Both MTX and composite nanoliposomes can significantly reduce thymus index，spleen index，and plantar swelling in collagen induced arthritis rats，lower serum levels of inflammatory factors，regulate the expression of related genes and proteins in synovial tissue

（P < 0.05），and the si-MTX group has a stronger effect（P < 0.05）.Conclusion：The mechanism by which composite nanoliposomes exert their effects may be by blocking the NF-κB pathway，reducing the release of pro-inflammatory factors，inhibiting bone resorption，and protecting articular cartilage;and it has higher targeting and safety.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;siRNA;nuclear transcription factor-κB;methotrexate;nanometre;liposomes;

bone destruction

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，病理特征表現(xiàn)為關(guān)節(jié)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤、滑膜細(xì)胞增生，以及軟骨細(xì)胞破壞和骨質(zhì)侵蝕［1］。目前，藥物治療的主要目標(biāo)是緩解臨床癥狀，降低疾病活動度，并最大限度地防止關(guān)節(jié)畸形和破壞［2］。歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）和美國風(fēng)濕病學(xué)會（ACR）均建議將甲氨蝶呤（MTX）作為治療RA的首選藥物［3-4］。然而，長期大量使用MTX可能引發(fā)一系列不良反應(yīng)，包括胃腸道、肝腎功能和心臟相關(guān)的不良反應(yīng)［5-8］。

納米載體能夠?qū)⑺幬镏苯幼饔糜陉P(guān)節(jié)炎癥部位，這不僅降低了不良反應(yīng)，還顯著提高了療效［9］。為了更深入地理解靶向治療的細(xì)胞信號通路和分子靶點(diǎn)，筆者推測將siRNA與MTX聯(lián)合使用，可能會產(chǎn)生協(xié)同作用，從而在減少M(fèi)TX劑量的同時，降低不良反應(yīng)的發(fā)生率［10］。鑒于核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號通路在滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤，以及軟骨細(xì)胞和骨質(zhì)破壞過程中的關(guān)鍵作用，筆者設(shè)計了針對NF-κB家族成員p65的siRNA與MTX復(fù)合納米脂質(zhì)體。這一創(chuàng)新設(shè)計的目的是驗證其在膠原誘導(dǎo)的RA模型大鼠中的治療優(yōu)勢，以期為未來的臨床應(yīng)用提供有力支持。

1 實(shí)驗材料

1.1 實(shí)驗動物 48只健康雌性SPF級SD大鼠，6周齡，體質(zhì)量（140±15）g，由斯貝福（北京）生物科技有限公司提供，實(shí)驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2024-0001。分籠飼養(yǎng)在河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心SPF級實(shí)驗室。實(shí)驗室環(huán)境保持恒溫（23～25 ℃）和恒濕（60%～65%）。在實(shí)驗開始前，所有大鼠進(jìn)行1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，期間自由飲食飲水。實(shí)驗動物使用許可證號SYXK（豫）2021-0015。

1.2 實(shí)驗藥品和試劑 MTX（上海畢得醫(yī)藥科技有限公司，批號BD137723）；siRNA（上海吉瑪基因股份有限公司，批號39755）；siRNA和MTX復(fù)合納米脂質(zhì)體（上海舜納納米科技有限公司，批號041523LPD）；完全弗氏佐劑（美國Sigma公司，批號F5881）；免疫源性牛Ⅱ型膠原（美國Chondrex公司，批號CAT20022）；Trizol（美國Ambion公司，批號15596-026）；VEGFA抗體

（英國Abcam公司，批號ab155944）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒、白細(xì)胞介素（IL）-1β ELISA試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒、NF-κB受體激活因子配體（RANKL）ELISA試劑盒、骨保護(hù)素（OPG）ELISA試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，批號分別為JYM0635Ra、JYM0419Ra、JYM0646Ra、JYM0391Ra、JYM0510Ra）。

1.3 實(shí)驗儀器 激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司，型號Mastersizer 3000）；透射電子顯微鏡（日本電子株式會社，型號JEOL2010）；高效液相色譜儀（美國安捷倫公司，型號Aligent 1200）；垂直蛋白電泳槽及轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司，型號1658003）；凝膠成像系統(tǒng)（以色列DNR公司，型號Micro Chemi 4.2）；分析天平（波蘭Radwag公司，型號AS220）；切片機(jī)（德國Leica 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，型號RM 2016）；顯微鏡（尼康Fi3型生物顯微鏡，型號DS Fi3）。

2 方 法

2.1 動物模型制作 48只健康SD大鼠隨機(jī)篩選出10只作為空白對照組，剩余納入造模組。采用Ⅱ型膠原誘導(dǎo)法構(gòu)建模型，將0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.5%的冰醋酸加水得到摩爾濃度為

0.1 mol·L-1的溶液，將2 mg天然牛Ⅱ型膠原蛋白溶解于10 mL冰醋酸中，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｔ谧⑸洚?dāng)天，取出7 mL膠原溶解物與等體積的CFA混合，在冰水浴中充分乳化。隨后在小鼠尾根部進(jìn)行多點(diǎn)皮內(nèi)注射。在第21天，再次進(jìn)行注射以加強(qiáng)免疫。在剔除8只模型制作未成功的個體后，將模型制作成功的30只SD大鼠按完全隨機(jī)分組法分為模型對照組、MTX組和復(fù)合納米脂質(zhì)體組（si-MTX組），每組10只。

2.2 siRNA和MTX復(fù)合納米脂質(zhì)體制備 取

2 mg甲氨蝶呤與20 mg DOTAP及適量膽固醇混合加入茄型瓶中，加2 mL三氯甲烷充分溶解，50 ℃旋蒸30～35 min。成膜后先用N2吹盡痕量三氯甲烷，加適量去離子水震搖水化（水浴超聲15 min），后依次過400 nm、200 nm、80 nm

聚碳酸酯膜，制得載MTX陽離子脂質(zhì)體溶液

（2 mL）。將20 μg的siRNA純水溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)50 μg·mL-1）與上述脂質(zhì)體4 ℃混合，獲得載RNA的MTX陽離子脂質(zhì)體，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 給藥方法 自模型建立并驗證成功之日起開始給藥。按照人與動物間劑量換算標(biāo)準(zhǔn)，MTX組給予1 mg·kg-1 MTX尾靜脈注射，si-MTX組則按照0.2 mg·kg-1納米復(fù)合脂質(zhì)體的劑量尾靜脈注射；空白對照組和模型對照組給予2 mL生理鹽水尾靜脈注射，每周1次，連續(xù)給藥3周。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 體質(zhì)量及臟器指數(shù)觀察 給藥前和給藥后第1，2，3周，對大鼠稱重并詳細(xì)記錄。給藥周期結(jié)束后處死動物，完整摘除大鼠的胸腺和脾臟，使用電子秤進(jìn)行稱重。

2.4.2 足跖腫脹度 給藥前和給藥后第1，2，3周，利用足跖容積儀對大鼠的足跖腫脹程度進(jìn)行測定。

2.4.3 標(biāo)本采集 模型制作成功當(dāng)天，各組大鼠眼眶內(nèi)取血2 mL。各組模型給藥治療后第21天，麻醉下腹主動脈取血約8 mL，室溫下靜置1 h，離心后取上層血清，置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。無菌條件下取膝關(guān)節(jié)滑膜組織，一部分行HE染色，其余部分置-80 ℃冰箱內(nèi)保存。

2.4.4 滑膜病理觀察 取膝關(guān)節(jié)滑膜組織，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片后脫蠟，蘇木素、伊紅染色，固定風(fēng)干后封片，顯微鏡下觀察各組大鼠滑膜組織病理變化情況。

2.4.5 ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和RANKL、OPG含量 于模型制作前、模型制作成功后，以及用藥治療后取大鼠血清，測定各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6和RANKL、OPG含量。

2.4.6 PCR技術(shù)檢測滑膜組織中NF-κB p65、IκB的mRNA表達(dá)水平 于模型制作前、模型制作成功后，以及用藥治療后，取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，測定各組大鼠滑膜組織中NF-κB p65、IκB的mRNA表達(dá)情況。

2.4.7 Western blot技術(shù)檢測滑膜組織中NF-κB p65、IκB蛋白的表達(dá)水平 于模型制作前、模型制作成功后，以及用藥治療后，取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，測定各組大鼠滑膜組織中NF-κB p65、IκB蛋白的表達(dá)情況。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 27.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布或近似正態(tài)分布以表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間重復(fù)資料采用重復(fù)測量方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠HE染色結(jié)果 空白對照組滑膜組織結(jié)構(gòu)清晰，滑膜細(xì)胞排列規(guī)則，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤；模型對照組滑膜細(xì)胞排列紊亂呈復(fù)層結(jié)構(gòu)，間質(zhì)內(nèi)大量結(jié)締組織增生，可見炎性細(xì)胞浸潤；MTX組滑膜細(xì)胞排列紊亂，局部呈復(fù)層結(jié)構(gòu)，可見少量炎性細(xì)胞浸潤；si-MTX組滑膜細(xì)胞輕微增生呈復(fù)層結(jié)構(gòu)，未見明顯異常，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。

3.2 各組大鼠體質(zhì)量比較 給藥前，各組大鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。給藥1，2，3周后，各組大鼠體質(zhì)量較治療前均顯著增加（P < 0.05）；與空白對照組比較，模型對照組、MTX組和si-MTX組均降低（P < 0.05）；與模型對照組比較，MTX組和si-MTX組均有所上升

（P < 0.05）。MTX組與si-MTX組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。

3.3 各組大鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)比較 與空白對照組比較，其余各組大鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)均呈現(xiàn)顯著上升趨勢（P < 0.05）。與模型對照組比較，MTX組和si-MTX組均顯著降低（P < 0.05）。MTX組與si-MTX組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。

3.4 各組大鼠足跖腫脹度比較 與空白對照組比較，其余各組大鼠在給藥1，2，3周后足跖腫脹度明顯升高（P < 0.05）；與模型對照組比較，MTX組和si-MTX組大鼠在給藥2，3周后足跖腫脹度明顯降低（P < 0.01）；MTX組與si-MTX組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。

3.5 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、RANKL、OPG含量比較 與空白對照組比較，其余各組大鼠血清TNa9033362f053d56006de3630c6f5ee4a195c4862d6cbc5075d59cb05fcd5dfefF-α、IL-1β、IL-6、RANKL含量明顯升高（P < 0.05），OPG含量明顯降低（P < 0.05）；與模型對照組比較，MTX組和si-MTX組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、RANKL含量明顯降低（P < 0.05），OPG含量明顯升高（P < 0.05）；MTX組與si-MTX組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。

3.6 各組大鼠滑膜組織中NF-κB p65、IκB mRNA表達(dá)水平比較 與空白對照組比較，其余各組大鼠滑膜組織中NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平明顯升高，IκB mRNA表達(dá)水平明顯降低（P < 0.05）；與模型對照組比較，MTX組和si-MTX組大鼠滑膜組織中NF-κB p65 mRNA的表達(dá)水平明顯降低，IκB mRNA表達(dá)水平明顯升高（P < 0.05）；MTX組與si-MTX組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2。

3.7 各組大鼠滑膜組織中NF-κB p65、IκB蛋白表達(dá)比較 與空白對照組比較，其余各組大鼠滑膜組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯升高，IκB蛋白表達(dá)水平明顯降低（P < 0.05）；與模型對照組比較，MTX組和si-MTX組大鼠滑膜組織中

NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯降低，IκB 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P < 0.05）；MTX組與si-MTX組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖3、圖4。

4 討 論

研究表明，免疫細(xì)胞的異常活化和炎癥因子的過度釋放對RA的發(fā)生、發(fā)展具有重要影響［11-13］。既往研究表明，作為一種調(diào)控炎癥和免疫反應(yīng)的關(guān)鍵途徑，NF-κB信號通路在RA的病理過程中扮演著舉足輕重的角色［14-15］。因此，調(diào)控NF-κB信號通路已成為治療RA的重要策略之一。

破骨細(xì)胞在骨吸收過程中起核心作用，RANK及其配體RANKL在破骨細(xì)胞分化過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用［16］。在正常生理狀態(tài)下，RANKL通過與破骨細(xì)胞表面的RANK受體結(jié)合，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的成熟和骨吸收過程［17-19］。而OPG是一種可溶性的RANKL誘導(dǎo)受體，通過與RANKL結(jié)合，阻斷RANKL與RANK的相互作用，從而抑制骨吸收過程［20-21］。因此，RANKL/RANK/OPG信號通路被視為RA患者全身關(guān)節(jié)破壞的潛在靶點(diǎn)［22］。

然而，該過程受到NF-κB信號通路的精確調(diào)控［23］，其中p50和p65亞單位形成的二聚體通常被視為NF-κB蛋白［24］。在生理狀態(tài)下，其受到抑制性蛋白ⅠκB的約束，激活NF-κB的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是IKK復(fù)合物對ⅠκB蛋白進(jìn)行磷酸化和泛素化，從而使NF-κB二聚體得以釋放并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)一步激活靶基因［25］。

siRNA在基因沉默和基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊，其獨(dú)特的機(jī)制使得它成為眾多疾病治療的有力工具［26］。因此，針對NF-κB家族成員p65的siRNA成為治療RA的潛在方案。但是，siRNA本身不能阻斷炎癥反應(yīng)過程，筆者創(chuàng)新性地將siRNA與MTX結(jié)合，制備siRNA與MTX的復(fù)合納米脂質(zhì)體，通過納米載藥系統(tǒng)，將MTX精準(zhǔn)傳遞于NF-κB通路的關(guān)鍵蛋白，實(shí)現(xiàn)協(xié)同治療效果。實(shí)驗結(jié)果表明，siRNA與復(fù)合MTX納米脂質(zhì)體能顯著降低CIA模型大鼠滑膜組織中的TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子水平。證明siRNA與MTX的復(fù)合納米脂質(zhì)體能夠有效抑制NF-κB信號通路的活化，阻止巨噬細(xì)胞釋放炎性因子，進(jìn)而改善關(guān)節(jié)滑膜的病理損傷。此外，還能提升OPG含量，降低RANKL含量，阻斷RANKL與RANK的相互作用，抑制骨吸收，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，阻止關(guān)節(jié)破壞。

盡管siRNA與MTX復(fù)合納米脂質(zhì)體在治療RA方面展現(xiàn)出巨大的潛力，但仍面臨著一些挑戰(zhàn)。復(fù)合納米脂質(zhì)體的制備工藝精細(xì)化是一個關(guān)鍵問題，其次藥物釋放動力學(xué)的深入研究也是至關(guān)重要的。相信隨著不斷優(yōu)化制備工藝和藥物釋放系統(tǒng)，siRNA與MTX復(fù)合納米脂質(zhì)體將為RA患者帶來更好的治療效果。

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收稿日期：2024-05-04；修回日期：2024-06-18