【摘 要】目的：檢測(cè)晚期世居藏族膝骨關(guān)節(jié)炎患者血清和關(guān)節(jié)液中的趨化因子水平差異并探究其臨床意義。方法：隨機(jī)選取2023年5月至2023年8月進(jìn)行全膝置換術(shù)的20例膝骨關(guān)節(jié)炎患者，采用Luminex多因子檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)膝骨關(guān)節(jié)炎患者血清以及關(guān)節(jié)液34項(xiàng)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，采用視覺模擬評(píng)分法（VAS）、西安大略和麥克馬斯特大學(xué)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)（WOMAC）評(píng)估膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)疼痛程度和功能障礙程度，分析膝骨關(guān)節(jié)炎患者34項(xiàng)細(xì)胞因子與VAS評(píng)分、WOMAC評(píng)分、血紅蛋白、C反應(yīng)蛋白（CRP）、紅細(xì)胞沉降率（ESR）的相關(guān)性。結(jié)果：世居藏族膝骨關(guān)節(jié)炎患者血清和關(guān)節(jié)液的34項(xiàng)細(xì)胞因子中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（SDF-1α）、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10（IP-10）、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1β（MIP-1β）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）的濃度水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；關(guān)節(jié)液組與血清組中SDF-1α、IP-10、Eotaxin、MIP-1β呈正相關(guān)（P < 0.05）；關(guān)節(jié)液SDF-1α和MCP-1水平與WOMAC評(píng)分呈正相關(guān)（P < 0.05），IP-10與CRP、ESR呈正相關(guān)（P < 0.05）；關(guān)節(jié)液中的Eotaxin水平與BMI呈負(fù)相關(guān)（P < 0.05）；而檢測(cè)的34個(gè)細(xì)胞因子水平與VAS評(píng)分、WOMAC評(píng)分無(wú)顯著相關(guān)

（P > 0.05）。結(jié)論：晚期世居藏族膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液和外周血中產(chǎn)生了趨化因子，這些趨化因子可能會(huì)對(duì)早期膝骨關(guān)節(jié)炎的診斷與治療提供參考依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 膝骨關(guān)節(jié)炎；細(xì)胞因子；趨化因子；世居藏族；血清；關(guān)節(jié)液

Study on the Expression LevelsrUNMXVq0M4C1+N0Fhze5bQ== and Correlation of Chemokines in Late-stage Knee Osteoarthritis of Native Tibetan Patients

LOU Ben-jing，XIE Lu，GUO Wan-qin，GAO Jing-yang，BIAN Ba

【ABSTRACT】Objective：To detect the levels of chemokines in serum and joint fluid of late-stage knee osteoarthritis in Tibetan patients and explore their clinical significance.Methods：Twenty patients with knee osteoarthritis who had underwent total knee replacement surgery from May 2023 to August 2023 were randomly selected.Luminex multi factor detection technology was used to detect the expression levels of 34 cytokines in the serum and joint fluid.VAS and WOMAC were used to evaluate the degree of joint pain and functional impairment.The correlation between 34 cytokines and VAS score，WOMAC score，hemoglobin，CRP，and ESR were analyzed.Results：There was no statistically significant difference in the concentration levels of SDF-1α，IP-10，MIP-1β，and MCP-1 among the 34 cytokines in the serum and joint fluid（P > 0.05）;there was a positive correlation（P < 0.05）between SDF-1α，IP-10，Eotaxin，and MIP-1β in the joint fluid group and the serum group;the levels of SDF-1α and MCP-1in joint fluid were positively correlatedwith WOMAC score（P < 0.05），and IP-10was positively correlated with CRP andESR（P < 0.05）;the level of Eotaxin in joint fluid is negatively correlated with BMI;the levels of 34 cytokines detected were not significantly correlated with VAS score and WOMAC score.Conclusion：Chemokines are produced in the joint fluid and peripheral blood of late-stage knee osteoarthritis in Tibetan patients，which may provide reference for the diagnosis and treatment of early knee osteoarthritis.

【Keywords】 knee osteoarthritis;cytokines;chemokines;native Tibetan;serum;joint fluid

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）約占骨關(guān)節(jié)炎的83%［1］，首先表現(xiàn)為分子紊亂（關(guān)節(jié)組織代謝異常），其次為解剖和（或）生理紊亂（特征為軟骨退化、骨重塑、骨贅形成、關(guān)節(jié)炎癥和正常關(guān)節(jié)功能喪失）［2］。隨著對(duì)細(xì)胞因子的了解，KOA內(nèi)在發(fā)病機(jī)制逐漸引起關(guān)注［3］。世居藏族KOA患者血液中是否具有和平原人群相似的細(xì)胞因子？哪些細(xì)胞因子可以作為世居藏族KOA患者診斷的生物標(biāo)志物？這些問(wèn)題都有待研究。根據(jù)已有的研究報(bào)道，本研究選取與KOA相關(guān)的34項(xiàng)細(xì)胞因子［白細(xì)胞介素（IL）類和趨化因子類］進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)探討晚期世居藏族KOA患者血清和關(guān)節(jié)液中趨化因子表達(dá)水平的差異及相關(guān)性，為世居藏族KOA患者病情的發(fā)生、發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2023年5月至2023年8月西藏大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的23例行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的KOA患者為研究對(duì)象。由于樣本采集以及保存條件的限制，最終有效樣本為20個(gè)，其中男13例，女7例。記錄研究對(duì)象的年齡、身高、體質(zhì)量，以及體質(zhì)量指數(shù)（BMI），并填寫KOA相關(guān)調(diào)查問(wèn)卷。本研究已獲得倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并遵循《赫爾辛基宣言》。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 按照《骨關(guān)節(jié)炎診療指南（2018版）》［4］標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合上述KOA診斷標(biāo)準(zhǔn)且為原發(fā)性KOA患者；②三代及以上為藏族的世居藏族患者；③Kellgren-Lawrence≥Ⅲ級(jí)；④患者簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) ①繼發(fā)性KOA患者；②炎癥性疾病以及嚴(yán)重的內(nèi)科疾病者。

2 方 法

2.1 檢測(cè)指標(biāo) IL類：IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、

IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-31。趨化因子類：巨噬細(xì)胞炎癥蛋白（MIP）-1α、MIP-1β、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（SDF-1α）、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10

（IP-10）、Eotaxin、RANTES、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、GRO-α。其他類：干擾素（IFN）-γ、IFN-α、腫瘤壞死因子（TNF）-α、TNF-β、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）。

2.2 檢測(cè)設(shè)備 液相芯片懸浮平臺(tái)采用Luminex? 100/200? System，檢測(cè)試劑盒采用定制的34項(xiàng)細(xì)胞因子試劑盒。儀器校準(zhǔn)試劑盒為L(zhǎng)uminex? 100/200 Calibration Kit和Luminex? 100/200 Performance Verification Kit。

2.3 檢測(cè)流程

2.3.1 血清和關(guān)節(jié)液的獲取 空腹?fàn)顟B(tài)下獲得KOA患者靜脈血5 mL，靜置30 min后離心獲取血清。離心機(jī)以3000 r·min-1離心10 min，離心半徑10 cm。2 d內(nèi)的血清樣本放入4～8 ℃冰箱內(nèi)保存，超過(guò)2 d的血清樣本在-80 ℃儲(chǔ)存。抽取關(guān)節(jié)液約1 mL并-80 ℃保存。將采集的樣本分為血清組和關(guān)節(jié)液組進(jìn)行比較。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備 于Human Standard Mix （lyophilized）中加入50 μL Universal Assay Buffer（1X），渦旋10 s，離心機(jī)以3000 r·min-1離心10 s，離心半徑10 cm，冰面放置15 min后取出；再加入

75 μL Universal Assay Buffer（1X），渦旋10 s；然后用Universal Assay Buffer （1X）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行4倍稀釋。空白對(duì)照（Blank）為Universal Assay Buffer（1X）。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量樣本中各細(xì)胞因子的含量。

2.3.3 芯片檢測(cè)操作流程 首先，將已經(jīng)包被目標(biāo)特異性抗體的捕獲微珠加入到樣本中，4 ℃孵育1～2 h并洗滌（整個(gè)洗滌過(guò)程必須在磁力架上進(jìn)行）。然后，使用生物素化的檢測(cè)抗體孵育捕獲的微球/因子，以形成免疫復(fù)合物，孵育時(shí)間為

30 min，洗滌。最后，棄去檢測(cè)抗體并洗滌，加入顯色標(biāo)記物Streptavidin-PE，孵育30 min，洗滌，置入已質(zhì)控的Luminex? 100/200?儀器讀取數(shù)值。用MilliplexAnalyst軟件分析得到標(biāo)準(zhǔn)曲線及其方程（5-參數(shù)擬合），標(biāo)準(zhǔn)曲線CV% < 15%，符合質(zhì)控要求。

2.4 觀察指標(biāo) 根據(jù)視覺模擬評(píng)分法（VAS）對(duì)KOA患者進(jìn)行疼痛程度評(píng)估。評(píng)分表為0～10分，0分代表無(wú)痛，10分代表疼痛難忍。VAS評(píng)分越高表明患者疼痛程度越大。

采用西安大略和麥克馬斯特大學(xué)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)（WOMAC）評(píng)估KOA嚴(yán)重程度。量表中的24項(xiàng)分為3部分，即疼痛評(píng)估、僵硬評(píng)估和身體功能評(píng)估。WOMAC總分越高表明患者殘疾程度越嚴(yán)重。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 血清組與關(guān)節(jié)液組細(xì)胞因子水平比較 34項(xiàng)細(xì)胞因子中Eotaxin和RANTES水平在血清組和關(guān)節(jié)液組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；SDF-1α、IP-10、MIP-1β，以及MCP-1水平關(guān)節(jié)液組和血清組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

3.2 相關(guān)性分析 KOA患者血清和關(guān)節(jié)液中檢測(cè)出的6種趨化因子中SDF-1α、IP-10、Eotaxin、MIP-1β呈正相關(guān)（r = 0.588、r = 0.704、r = 0.613、r = 0.615，P < 0.05），RANTES和MCP-1無(wú)相關(guān)性（P > 0.05）；關(guān)節(jié)液中的Eotaxin與BMI呈負(fù)相關(guān)（P < 0.05），SDF-1α和MCP-1與WOMAC評(píng)分呈正相關(guān)（P < 0.05），IP-10與C反應(yīng)蛋白（CRP）、ESR呈正相關(guān)（P < 0.05），血紅蛋白濃度與檢測(cè)指標(biāo)均不存在相關(guān)性（P > 0.05）。

4 討 論

KOA是導(dǎo)致慢性殘疾的主要原因，并給患者帶來(lái)健康和經(jīng)濟(jì)的負(fù)擔(dān)［5］。對(duì)于KOA晚期患者來(lái)說(shuō)，最有效的治療方式是進(jìn)行全膝關(guān)節(jié)置換

術(shù)［6-7］，因此，闡明疾病發(fā)生機(jī)制，探尋更有效的治療方法顯得尤為重要［8-10］。一些研究利用生物信息學(xué)分析探索了KOA的關(guān)鍵致病基因，發(fā)現(xiàn)IL-6和CXCL12（又稱SDF-1）在KOA關(guān)節(jié)液晚期高表達(dá)并具有良好的診斷效果［3］，這與本研究發(fā)現(xiàn)的SDF-1α水平在晚期KOA中顯著變化是一致的。趨化因子是一種多效性因子，它在炎癥和代謝性疾病中發(fā)揮重要作用［11-14］。研究發(fā)現(xiàn)，OA晚期趨化因子發(fā)揮作用參與炎癥和免疫紊亂使關(guān)節(jié)局部炎癥更為明顯［15-16］。

本研究應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)方法是Luminex多因子檢測(cè)技術(shù)，同傳統(tǒng)的ELISA方法相比，Luminex重復(fù)性好，樣本污染可能性小，準(zhǔn)確性高。檢測(cè)結(jié)果顯示，趨化因子類SDF-1α、IP-10、Eotaxin、RANTES、MIP-1β、MCP-1出現(xiàn)明顯的變化。部分研究結(jié)果與已有的文獻(xiàn)不一致，可能是因?yàn)楸狙芯考{入人群為世居藏族，而對(duì)該人群KOA相關(guān)細(xì)胞因子的研究幾乎未有報(bào)道，這可能導(dǎo)致了結(jié)果的差異。通過(guò)分析這6種趨化因子水平發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)液組SDF-1α、Eotaxin、RANTES、MIP-1β水平低于血清組，而IP-10、MCP-1水平明顯高于血清組。表明在藏族人群中趨化因子或許可以成為晚期KOA特異性診斷標(biāo)志物，并為早期預(yù)防性治療提供參考。對(duì)于在KOA患者中常研究的IL類細(xì)胞因子在本次檢測(cè)中大多數(shù)是低于檢測(cè)值下限，因此猜測(cè)檢測(cè)結(jié)果可能受到海拔以及儲(chǔ)存條件的影響，需進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)關(guān)節(jié)液和血清檢測(cè)出的6種趨化因子水平相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)液和血清中SDF-1α、IP-10、Eotaxin、MIP-1β水平呈正相關(guān)（P < 0.05），這說(shuō)明在KOA終末期患者由局部炎癥損傷轉(zhuǎn)變?yōu)槿硇匝装Y，此時(shí)患者血清中的炎性因子水平也隨之升高。WOMAC可用于KOA嚴(yán)重程度的評(píng)估，本研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)SDF-1α和MCP-1與WOMAC評(píng)分呈正相關(guān)（P < 0.05），那么趨化因子的改變或許可作為終末期KOA的診斷指標(biāo)。關(guān)節(jié)液IP-10與CRP、ESR呈正相關(guān)（P < 0.05），這也證實(shí)在KOA終末期患者體內(nèi)炎癥由局部性轉(zhuǎn)變?yōu)槿硇裕颊叩南リP(guān)節(jié)功能變得更差。關(guān)節(jié)液中Eotaxin水平與BMI呈負(fù)相關(guān)（P < 0.05），由此推測(cè)KOA患者肥胖可影響趨化因子Eotaxin的產(chǎn)生。根據(jù)結(jié)果顯示，KOA晚期患者血紅蛋白濃度與檢測(cè)出的趨化因子均不存在相關(guān)性，或許在高原缺氧環(huán)境下世居藏族人群獨(dú)特的適應(yīng)能力使缺氧環(huán)境不是KOA發(fā)生的主要原因。高原地區(qū)KOA流行病學(xué)調(diào)查極為罕見，因此針對(duì)高原地區(qū)KOA疾病預(yù)防與早期治療更應(yīng)該引起關(guān)注。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，在世居藏族KOA晚期患者中，關(guān)節(jié)液和血清的趨化因子水平升高是一致的。那么，對(duì)于世居藏族人群細(xì)胞因子的檢測(cè)或許可以成為預(yù)測(cè)KOA發(fā)生、發(fā)展的生物標(biāo)志物。然而，本研究存在一定的局限性，首先是納入樣本量較少，有必要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步加以驗(yàn)證；其次，由于倫理問(wèn)題未設(shè)置對(duì)照組樣本，只比較了KOA患者血清和關(guān)節(jié)液中的趨化因子水平；再次，只探討了晚期KOA患者趨化因子的水平變化，若增加其他階段的KOA患者可能會(huì)獲得關(guān)于疾病進(jìn)展的其他細(xì)胞因子。

參考文獻(xiàn)

［1］ MATHIESSEN A，CONAGHAN PG.Synovitis in osteoarthritis：current understanding with therapeutic implications［J］.Arthritis Res Ther，2017，19（1）：18-26.

［2］ DAINESE P，WYNGAERT KV，DE MITS S，et al.Association between knee inflammation and knee pain in patients with knee osteoarthritis：a systematic review［J］.Osteoarthritis Cartilage，2022，30（4）：516-534.

［3］ YANG Y，ZHANG Y，MIN D，et al.Screening of key pathogenic genes in advanced knee osteoarthritis based on bioinformatics analysis［J］.Ann Transl Med，2022，10（18）：978-985.

［4］ 中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)關(guān)節(jié)外科學(xué)組.骨關(guān)節(jié)炎診治指南（2018版）［J］.中華骨科雜志，2018，38（12）：705-715.

［5］ DAINESE P，MAHIEU H，DE MITS S，et al.Associations between markers of inflammation and altered pain perception mechanisms in people with knee osteoarthritis：a systematic review［J］.RMD Open，2023，9（2）：e002945-e002958.

［6］ UIVARASEANU B，VESA CM，TIT DM，et al.Therapeutic approaches in the management of knee osteoarthritis（review）［J］.Exp Ther Med，2022，23（5）：328-333.

［7］ ?LéGLOVá O.Pain treatment options for osteoarthritis［J］.Vnitr Lek，2023，69（2）：119-127.

［8］ DU X，LIU ZY，TAO XX，et al.Research progress on the pathogenesis of knee osteoarthritis［J］.OrthopSurg，2023，15（9）：2213-2224.

［9］ GIORGINO R，ALBANO D，F(xiàn)USCO S，et al.Knee osteoarthritis：epidemiology，pathogenesis，and mesenchymal stem cells：what else is new？an update［J］.Int J Mol Sci，2023，24（7）：6405-6421.

［10］ XU JZ，LI LL，F(xiàn)U J，et al.Comparison of serum inflammatory indicators and radiographic results in MAKO robotic-assisted versus conventional total knee arthroplasty for knee osteoarthritis：a retrospective study of Chinese patients［J］.BMC Musculoskelet Disord，2022，23（1）：418-426.

［11］ KOYAMA T，UCHIDA K，F(xiàn)UKUSHIMA K，et al.Elevated levels of TNF-α，IL-1β and IL-6 in the synovial tissue of patients with labral tear：a comparative study with hip osteoarthritis［J］.BMC Musculoskelet Disord，2021，22（1）：33-39.

［12］ YUE G，AN Q，XU X，et al.The role of Chemerin in human diseases［J］.Cytokine，2023，162（1）：156089-156096.

［13］ GOWLER PRW，TURNBULL J，SHAHTAHERI M，et al.

InterplaKQOYBDItUkpQeUJFalZfew==y between cellular changes in the knee joint，

circulating lipids and pain behaviours in a slowlyLKsmvdm8Pa1TfPRl9RRPjw== progressing murine model of osteoarthritis［J］.Eur J Pain，2022，26（10）：2213-2226.

［14］ AHMED AS，GEDIN P，HUGO A，et al.Activation of NF-κB in synovium versus cartilage from patients with advanced knee osteoarthritis：a potential contributor to inflammatory aspects of disease progression［J］.J Immunol，2018，201（7）：1918-1927.

［15］ CUI M，CHENG C，ZHANG L.High-throughput proteomics：a methodological mini-review［J］.Lab Invest，2022，102（11）：1170-1181.

［16］ DEL SORDO L，BLACKLER GB，PHILPOTT HT，et al.

Impaired efferocytosis by synovial macrophages in patients with knee osteoarthritis［J］.Arthritis Rheumatol，2023，75（5）：685-696.

收稿日期：2024-03-09；修回日期：2024-04-27