摘" " 要" " 目的" " 制備一種新型脂質(zhì)載藥納米探針HD@P-NPs，探討其體外超聲成像效果及用于瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（KFs）遷移抑制和級聯(lián)放大治療的效果。方法" " 采用超聲乳化法制備以全氟乙烷為核心脂質(zhì)殼層，負(fù)載血卟啉單甲醚和阿霉素的脂質(zhì)載藥納米探針HD@P-NPs，觀察其形態(tài)、結(jié)構(gòu)并檢測粒徑和Zeta電位，計算藥物包封率和載藥率；進(jìn)一步觀察HD@P-NPs在低強(qiáng)度聚焦超聲（LIFU）輻照下的二維超聲及超聲造影成像效果；溶血實驗檢測HD@P-NPs在不同濃度下的溶血率。取對數(shù)生長期的瘢痕疙瘩KFs按照不同實驗條件培養(yǎng)，并分為5組：對照組（不予特殊處理）、LIFU輻照組、D@P-NPs組（僅加入阿霉素）、HD@P-NPs組、HD@P-NPs+LIFU輻照組，使用MTT法檢測各組細(xì)胞存活率；Calcein AM/PI染色觀察各組細(xì)胞活性；細(xì)胞遷移實驗檢測各組細(xì)胞遷移率；活性氧熒光染色觀察各組活性氧產(chǎn)生情況，獲取其熒光強(qiáng)度。結(jié)果" " 成功制備HD@P-NPs，呈球形且大小均一，平均粒徑（170.36±6.03）nm，平均Zeta電位（-36.91±3.56）mV；血卟啉單甲醚包封率和載藥率分別為67.41%、5.18%，阿霉素包封率和載藥率分別為72.80%、11.20%。LIFU輻照后，HD@P-NPs相變產(chǎn)生微氣泡，在3 W/cm2、2 min輻照條件下可實現(xiàn)最佳成像效果，后續(xù)實驗采用此輻照條件。HD@P-NPs在25、50、100、200 μg/ml濃度下的溶血率分別為（2.48±0.02）%、（4.87±0.06）%、（5.03±0.03）%、（6.10±0.04）%。對照組、LIFU輻照組、D@P-NPs組、HD@P-NPs組及HD@P-NPs+LIFU輻照組細(xì)胞存活率分別為100%、（96.87±0.71）%、（77.94±2.83）%、（77.11±3.53）%、（49.75±1.25）%，HD@P-NPs+LIFU輻照組與對照組細(xì)胞存活率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。HD@P-NPs+LIFU輻照組見明顯紅色熒光及少量綠色熒光。對照組、LIFU輻照組、D@P-NPs組、HD@P-NPs組、HD@P-NPs+LIFU輻照組的細(xì)胞遷移率分別為（29.96±3.20）%、（28.62±2.56）%、（18.13±0.89）%、（17.46±0.20）%、（10.04±1.62）%，其中HD@P-NPs+LIFU輻照組細(xì)胞遷移率低于其余各組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均Plt;0.05）。HD@P-NPs+LIFU輻照組活性氧熒光強(qiáng)度為22.43±3.10，與其余各組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均Plt;0.05）。結(jié)論" " 本實驗成功制備了HD@P-NPs，其在LIFU輻照下可提高靶區(qū)有效藥物濃度，具有較好的體外超聲成像效果，可實現(xiàn)超聲可視化瘢痕疙瘩KFs級聯(lián)放大治療。

關(guān)鍵詞" " 納米探針；瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞；血卟啉單甲醚；阿霉素；聲動力治療

［中圖法分類號］R445.1" " " ［文獻(xiàn)標(biāo)識碼］A

Cascade therapy of keloid fibroblasts with acoustic induced

phase-change nanoprobes：an experimental study

FAN Zhengchao，XIA Jizhu，ZHU Weiwei，XU Ying，ZHAO Xiangzhi

Department of Ultrasound Medicine，Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Sichuan 646000，China

ABSTRACT" " Objective" " To prepare a new type of lipid nanoprobes（HD@P-NPs），and to investigate the effects of ultrasound imaging in vitro，migration inhibition as well as amplification therapy on keloid fibroblasts（KFs）.Methods" " HD@P-NPs were prepared through ultrasonic emulsification with perfluoroethane as the core lipid shell and loading of hematoporphyrin monomethyl ether（HMME） and doxorubicin（DOX）.The morphology，structure，particle size and Zeta potential of HD@P-NPs were measured，and the encapsulation efficiency and loading rate of corresponding drug were calculated.The imaging effects of two-dimensional ultrasound and contrast-enhanced ultrasound（CEUS） under the irradiation of low intensity focused ultrasound（LIFU） were explored.The hemolysis rate of HD@P-NPs at different concentrations were calculated.KFs in the logarithmic growth phase were cultured under different experimental conditions and divided into the following 5 groups： control group（no treatment），LIFU group，D@P-NPs group，HD@P-NPs group and HD@P-NPs+LIFU group.The cell survival rate was detected by MTT assay，the cell activity in each group was observed by Calcein-AM/PI staining method.Cell migration rate in each group was detected by cell migration experiment.Reactive oxygen species fluorescence staining was applied to observe the intracellular reactive oxygen species（ROS） production，and the fluorescence intensity was obtained.Results" " HD@P-NPs were successfully prepared with uniform dimensions.The average particle size was （170.36±6.03）nm，the average Zeta potential was （-36.91±3.56）mV，respectively.The encapsulation efficiency and loading rate of HMME and DOX were 67.41%，5.18% and 72.80%，11.20%，respectively.Microbubbles were generated by the phase transition of HD@P-NPs after LIFU irradiation.The optimal imaging efficacy was achieved under the irradiation conditions of 3 W/cm2 for 2 min and these parameters were subsequently adopted for further experiments.The hemolysis rate of HD@P-NPs at different concentrations（25，50，100，200 μg/ml） were （2.48±0.02）%，（4.87±0.06）%，（5.03±0.03）%，（6.10±0.04）%，respectively.Cell survival rate in the control，LIFU，D@P-NPs，HD@P-NPs，and HD@P-NPs+LIFU groups were 100%，（96.87±0.71）%，（77.94±2.83）%，（77.11±3.53）%，（49.75±1.25）%，respectively.A statistically significant difference was observed between the HD@P-NPs+LIFU group and the control group（Plt;0.05）.There was obvious red fluorescence while minimal green fluorescence in the HD@P-NPs+LIFU group.The migration rate in the control，LIFU，D@P-NPs，HD@P-NPs，and HD@P-NPs+LIFU groups were （29.96±3.20）%，（28.62±2.56）%，（18.13±0.89）%，（17.46±0.20）%，（10.04±1.62）%，respectively.The migration rate in the HD@P-NPs+LIFU group was significantly lower than that in other groups（all Plt;0.05）.The ROS in the HD@P-NPs+LIFU group was 22.43±3.10，the difference was statistically significant compared with other groups（all Plt;0.05）.Conclusion" " The HD@P-NPs were successfully prepared in this experiment.These nanoprobes can increase the effective drug concentration in the target area and realize cascade amplification therapy of KFs under LIFU irradiation and ultrasound visualization.

KEY WORDS" " Nanoprobes；Keloid fibroblasts；Hematoporphyrin monomethyl ether；Doxorubicin；Sonodynamic therapy

瘢痕疙瘩是一種異常纖維增生性疾病，臨床常表現(xiàn)為類癌行為［1］，因此也被稱為“無法愈合的纖維化傷口”［2］，嚴(yán)重影響組織生理功能，對患者造成一定的心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。瘢痕疙瘩誘發(fā)因素較多，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，傳統(tǒng)手術(shù)治療效果欠佳［3］。血卟啉單甲醚（HMME）作為聲動力治療（sonodynamic therapy，SDT）的新興藥物，具有性質(zhì)穩(wěn)定、暗毒性低及聲學(xué)激發(fā)吸收強(qiáng)等優(yōu)勢［4-5］；阿霉素（DOX）為蒽環(huán)類拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，能夠通過多種機(jī)制影響瘢痕疙瘩的關(guān)鍵細(xì)胞——成纖維細(xì)胞（KFs）［6］，參與了膠原蛋白的異常合成［7］，依托脂質(zhì)材料獨特磷脂雙分子層構(gòu)造，可同時包載疏水性和親水性藥物，實現(xiàn)藥物的持續(xù)穩(wěn)定釋放，同時聲敏激活HMME達(dá)到SDT協(xié)同DOX增效治療的目的。在低強(qiáng)度聚焦超聲（low intensity focused ultrasound，LIFU）輻照引起的聲滴汽化效應(yīng)下，納米相變能實現(xiàn)組織的實時可視化，同時靶向破壞微泡技術(shù)為精準(zhǔn)治療提供支持［8］，真正實現(xiàn)診療一體化。本實驗通過制備脂質(zhì)載藥納米探針HD@P-NPs，探討其體外超聲成像效果及SDT聯(lián)合藥物治療瘢痕疙瘩KFs的療效，旨在為臨床治療瘢痕疙瘩及KFs相關(guān)疾病的遞藥方式提供依據(jù)。

材料與方法

一、主要實驗試劑及動物

全氟己烷（PFH）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；HMME和DOX均購自上海麥克林生化科技股份有限公司；二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、二硬脂酰基甘油（DSPG）、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-c-RGD（DSPE-PEG2000-c-RGD）及膽固醇（CHOL）均購自西安瑞禧生物科技有限公司；胰酶細(xì)胞消化液（0.25%胰蛋白酶）、DCFH-DA活性氧檢測試劑盒、DAPI、DiD 均購自上海碧云天生物技術(shù)公司；Calcein-AM/PI雙染試劑盒、瓊脂粉均購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基均購自瀘州欣科盛生物科技有限公司；BALB/C小鼠購自重慶騰輝比爾實驗動物銷售有限公司；瘢痕疙瘩KFs購自廣州銘安生物科技有限公司；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）由西南醫(yī)科大學(xué)腫瘤生物實驗室提供。

二、主要實驗儀器

馬爾文激光粒度-電位分析儀（90 Plus Zeta，美國布魯克海文儀器公司）；透射電子顯微鏡（Talos F200X，美國FEI公司）；倒置熒光顯微鏡（IX73，日本Olympus公司）；光學(xué)顯微鏡（CKX53，日本Olympus公司）；紫外分光光度計（UV-5800PC，上海元析儀器有限公司）；超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）；全自動多功能酶標(biāo)儀（廣州伯齊科技有限公司）；移液器及高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi有限公司）；LIFU治療儀（重慶醫(yī)科大學(xué)超聲分子影像學(xué)研究所）。

三、主要實驗方法

1.納米粒的制備：將DPPC、DSPG、DSPE-PEG2000-c-RGD、CHOL和HMME按質(zhì)量比5∶2∶1.5∶1.5∶1的比例共稱取11 mg，溶解于10 ml甲醇（CH3OH）+10 ml三氯甲烷（CH3Cl）混合有機(jī)溶劑中，置于37℃恒溫水浴床內(nèi)搖晃10 min，然后將盛有50 ml混合有機(jī)溶液的圓底燒瓶安裝在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，設(shè)置水浴溫度為50℃，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后形成一均勻褐色薄膜結(jié)構(gòu)，加入4 ml去離子水并在超聲洗滌器內(nèi)震蕩洗脫薄膜，最終形成均質(zhì)半透明褐色水乳劑，避光移至10 ml EP管內(nèi)，加入200 μl DOX（10 mg/ml）及120 μl PFH，冰浴條件下進(jìn)行超聲乳化（聲震條件：120 W，時間：4 min），再于高速冷凍離心機(jī)內(nèi)離心（轉(zhuǎn)速：8000 r/min，時間：6 min，溫度：4℃），棄上清液，加超純水重懸沉淀，反復(fù)3次得到紅色乳劑，即為HD@P-NPs。稱量過程中不加HMME，僅加入DOX即制得D@P-NPs，僅加入DiD即制得DiD標(biāo)記的脂質(zhì)納米粒，不加任何藥物即制得空白脂質(zhì)納米粒。

2.HD@P-NPs的表征檢測：將制備好的HD@P-NPs進(jìn)行稀釋，取稀釋后的納米懸液上樣（保證每個視野內(nèi)納米粒數(shù)量不超過5個），于透射電子顯微鏡下觀察HD@P-NPs的形態(tài)、結(jié)構(gòu)。取40 μl HD@P-NPs，并用去離子水稀釋50倍后轉(zhuǎn)入干凈的比色皿內(nèi)，然后置于馬爾文激光粒度-電位分析儀檢測HD@P-NPs的粒徑、分散指數(shù)及Zeta電位。將HD@P-NPs重懸于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，4℃冰箱內(nèi)避光儲存，連續(xù)1周取納米懸液檢測其粒徑及分散指數(shù)，根據(jù)粒徑變化評價納米粒的生物穩(wěn)定性。

3.包封率和載藥率的檢測：將1 mg HMME溶解于CH3OH，配置成濃度為0～15.625 μg/ml的溶液，分析其在400 nm處的吸光度（OD）值，并繪制HMME濃度與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。另配置濃度為0～31.250 μg/ml的DOX溶液，分析其在480 nm處的OD值，并繪制DOX濃度與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后取1 ml HD@P-NPs納米懸液置于CH3OH中稀釋，直到納米粒中藥物OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算HMME和DOX的包封率和載藥率。

4.聲致相變及體外超聲成像效果觀察：于LIFU輻照后應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察HD@P-NPs的相變情況。將濃度為1.0 mg/ml的HD@P-NPs納米懸液加入到瓊脂糖凝膠模型中，于不同LIFU輻照條件下（聲強(qiáng)：1～3 W/cm2，時間：0～3 min，脈沖模式）觀察二維超聲和超聲造影成像效果，確定最佳輻照條件；使用ImageJ軟件定量分析信號強(qiáng)度。

5.溶血實驗檢測溶血率：取健康BALB/C小鼠全血，收集于EDTA抗凝管中，輕輕混勻后置于高速冷凍離心機(jī)內(nèi)離心（轉(zhuǎn)速：3000 r/min，時間：20 min）；將不同濃度納米懸液（25、50、100、200 μg/ml）、超純水、PBS溶液各取1 ml與30 μl血細(xì)胞混合，在37℃恒溫水浴鍋內(nèi)孵育4 h，離心10 min，將樣品置于同一水平線，并對溶血現(xiàn)象進(jìn)行拍照，用移液器吸取上清液，使用紫外分光光度計檢測其在542 nm處的OD值，并計算溶血率，公式為：溶血率=（樣本組OD值-PBS組OD值）/（超純水組OD值-PBS組OD值）×100%。

6.細(xì)胞攝取實驗：將KFs及HUVECs于6孔板中培養(yǎng)24 h，用DiD標(biāo)記的脂質(zhì)納米粒與KFs或HUVECs分別在37℃孵育1 h、3 h、4 h，然后用PBS溶液洗滌3次，4%多聚甲醛固定15 min，再用PBS溶液洗滌3次，每孔加入0.5 ml DAPI染色5 min，輕輕晃動6孔板以保證染色均勻，最后于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞對HD@P-NPs的攝取情況。

7.細(xì)胞毒性實驗：當(dāng)KFs處于對數(shù)生長期且細(xì)胞生長至80%～90%時，用新鮮DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×105個/ml，取0.1 ml并將細(xì)胞接種于96孔板中（每孔1×104個，均勻分布），置于培養(yǎng)孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h直至細(xì)胞完全貼壁，然后吸去培養(yǎng)基中舊液，分別加入濃度為500、250、125、62.5、31.25、15.625 μg/ml的空白脂質(zhì)納米懸液共培養(yǎng)24 h，使用MTT法檢測細(xì)胞存活率，分析納米粒細(xì)胞毒性。

8.分組及相關(guān)檢測

（1）分組：取對數(shù)生長期的KFs按照不同實驗條件分為對照組（未進(jìn)行任何處理）、LIFU輻照組（僅進(jìn)行超聲輻照）、D@P-NPs組（加入D@P-NPs納米懸液）、HD@P-NPs組（加入HD@P-NPs納米懸液）及HD@P-NPs+LIFU輻照組（加入HD@P-NPs納米懸液并進(jìn)行超聲輻照），于37℃、5% CO2條件下孵育24 h，其中LIFU輻照組和HD@P-NPs+LIFU輻照組于孵育4 h后進(jìn)行超聲輻照繼續(xù)培養(yǎng)24 h；細(xì)胞存活率和細(xì)胞活性檢測時細(xì)胞密度為每孔1×105個；細(xì)胞遷移情況檢測時細(xì)胞密度為每孔2.0×105個；活性氧產(chǎn)生情況檢測時細(xì)胞密度為每孔1×104個。

（2）MTT法檢測細(xì)胞存活率：各組均避光加入20 μl MTT溶液，孵育4 h后吸出混合液并加入150 μl DMSO溶液，使用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長下的OD值，計算細(xì)胞存活率。

（3）Calcein AM/PI染色觀察細(xì)胞活性：各組均加入配置好的Calcein-AM/PI溶液繼續(xù)孵育20 min，然后用PBS溶液洗去未結(jié)合的染料，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞活性。

（4）細(xì)胞遷移實驗檢測細(xì)胞遷移率：各組均加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液2.0 ml，待細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%融合后用無菌吸管尖端刮去培養(yǎng)中心，并用PBS溶液洗去劃痕區(qū)域受損細(xì)胞，于光學(xué)顯微鏡下觀察0 h、24 h細(xì)胞遷移情況；使用ImageJ軟件觀察不同時間點細(xì)胞劃痕面積，計算細(xì)胞遷移率，公式為：細(xì)胞遷移率=（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

（5）活性氧熒光染色觀察活性氧產(chǎn)生情況：各組均吸出舊培養(yǎng)基并用PBS溶液洗滌3次，立即加入配置好的DCFH-DA溶液孵育20 min，再次使用PBS溶液避光沖洗，于倒置熒光顯微鏡下觀察活性氧產(chǎn)生情況；使用ImageJ軟件定量分析各組活性氧熒光強(qiáng)度。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用 GraphPad Prism 10.1統(tǒng)計軟件，計量資料以x±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)" 果

一、HD@P-NPs的表征

HD@P-NPs呈棕紅色，透射電子顯微鏡下形態(tài)呈球形，大小均一（圖1），分散性好，平均粒徑（170.36±6.03）nm，平均Zeta電位（-36.91±3.56）mV。于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中存放1周后，HD@P-NPs粒徑無明顯改變，穩(wěn)定在170 nm，分散指數(shù)為0.2（圖2），具有良好的生物穩(wěn)定性。

二、HD@P-NPs的藥物包封率和載藥率

紫外吸收光譜顯示，HMME在400 nm處出現(xiàn)吸收波峰，DOX在480 nm處出現(xiàn)吸收波峰，HD@P-NPs在400 nm和480 nm均出現(xiàn)吸收波峰（圖3）。當(dāng)HMME與DOX質(zhì)量比為1∶2時，HD@P-NPs具有相對較高的藥物包封率和載藥率，對應(yīng)條件下HMME包封率和載藥率分別為67.41%、5.18%，DOX包封率和載藥率分別為72.80%、11.20%。

三、HD@P-NPs體外超聲成像效果及聲致相變性能

當(dāng)聲強(qiáng)為1 W/cm2時，HD@P-NPs在二維超聲下不同輻照時間的信號強(qiáng)度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，超聲造影下輻照3 min的信號強(qiáng)度較輻照1 min及2 min時增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均Plt;0.05）；當(dāng)聲強(qiáng)為2 W/cm2時，隨著輻照時間的增加，HD@P-NPs信號強(qiáng)度逐漸增加，二維超聲下輻照時間為2 min及3 min時信號強(qiáng)度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，超聲造影下輻照3 min的信號強(qiáng)度較輻照1 min及2 min時增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均Plt;0.05）；當(dāng)聲強(qiáng)為3 W/cm2，輻照時間為1 min和2 min時，HD@P-NPs在二維超聲和超聲造影下信號驟增，但在輻照3 min時信號有所減弱，輻照2 min時信號強(qiáng)度與其余各時間點比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均Plt;0.05）。見圖4和表1。后續(xù)實驗使用LIFU輻照條件為聲強(qiáng)3 W/cm2、時間2 min。

光學(xué)顯微鏡下觀示LIFU輻照后HD@P-NPs可產(chǎn)生大量的微氣泡，并在聲強(qiáng)3 W/cm2、時間2 min的輻照條件下達(dá)微泡最大化。見圖5。

四、溶血實驗結(jié)果

溶血實驗結(jié)果顯示，HD@P-NPs在25、50、100、200 μg/ml濃度下的溶血率分別為（2.48±0.02）%、（4.87±0.06）%、（5.03±0.03）%、（6.10±0.04）%。

五、細(xì)胞攝取結(jié)果

孵育1 h后KFs及HUVECs內(nèi)均未見明顯紅色熒光信號；孵育3 h后KFs內(nèi)紅色熒光信號有所增加，HUVECs內(nèi)未見明顯紅色熒光信號；孵育4 h后KFs內(nèi)見大量紅色熒光信號，HUVECs內(nèi)未見明顯紅色熒光信號。見圖6。

六、細(xì)胞毒性實驗結(jié)果

空白脂質(zhì)納米粒濃度為500、250、125、62.5、31.25、15.625 μg/ml時，細(xì)胞存活率分別為（86.17±2.41）%、（88.00±1.39）%、（89.67±0.91）%、（90.83±0.40）%、（90.80±0.30）%、（90.97±1.33）%，可排除納米粒毒性干擾。

七、各組相關(guān)檢測結(jié)果

（1）各組細(xì)胞存活率比較：對照組、LIFU輻照組、D@P-NPs組、HD@P-NPs組及HD@P-NPs+LIFU輻照組細(xì)胞存活率分別為100%、（96.87±0.71）%、（77.94±2.83）%、（77.11±3.53）%、（49.75±1.25）%，HD@P-NPs+LIFU輻照組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。

（2）各組細(xì)胞活性檢測結(jié)果：LIFU輻照組僅見大量綠色熒光分布，未見紅色熒光；D@P-NPS組和HD@P-NPs組均可見部分紅色熒光；HD@P-NPs+LIFU輻照組見明顯紅色熒光及少量綠色熒光。見圖7。

（3）各組細(xì)胞遷移率比較：對照組、LIFU輻照組、D@P-NPs組、HD@P-NPs組、HD@P-NPs+LIFU輻照組細(xì)胞遷移率分別為（29.96±3.20）%、（28.62±2.56）%、（18.13±0.89）%、（17.46±0.20）%、（10.04±1.62）%，其中HD@P-NPs+LIFU輻照組細(xì)胞遷移率低于其余各組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均Plt;0.05）。見圖8。

（4）各組活性氧熒光強(qiáng)度比較：D@P-NPs組、HD@P-NPs組及HD@P-NPs+LIFU輻照組活性氧熒光強(qiáng)度分別為14.61±1.32、15.35±1.95、22.43±3.10，HD@P-NPs+LIFU輻照組與其余兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均Plt;0.05）；對照組和LIFU輻照組均未見活性氧熒光信號。見圖9。

討" 論

瘢痕疙瘩具有KFs異常增殖、微血管過表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積等特征［9］，傳統(tǒng)治療手段效果不佳，且反復(fù)刺激可能誘發(fā)瘢痕癌［10］，高復(fù)發(fā)率更是目前臨床治療面臨的主要挑戰(zhàn)［11］。SDT是一種基于超聲技術(shù)的新型無創(chuàng)治療方式，主要通過聲敏劑激活產(chǎn)生活性氧來殺傷靶區(qū)細(xì)胞［12-13］，同時實現(xiàn)特定細(xì)胞分子示蹤成像并發(fā)揮治療作用，是分子成像技術(shù)的研究熱點［14-15］。近年來，SDT在腫瘤等治療領(lǐng)域的應(yīng)用已取得顯著進(jìn)展，尤其在材料科學(xué)、藥物遞送系統(tǒng)和治療策略方面均有了新的突破［16］。本實驗將超聲成像與SDT相結(jié)合，采用超聲乳化法將聲敏藥物HMME和化療藥物DOX共同載入脂質(zhì)載體，核心負(fù)載的相變材料PFH在LIFU輻照下表現(xiàn)出卓越的超聲相變性能，可以實現(xiàn)瘢痕靶區(qū)的實時成像，通過干擾瘢痕疙瘩KFs增殖提高靶區(qū)藥物療效，旨在為瘢痕疙瘩及相關(guān)KFs疾病的治療提供新思路。

本實驗制備的HD@P-NPs以PFH為內(nèi)核，PFH是一種具有良好生物惰性和化學(xué)穩(wěn)定性的氟碳化合物，可在LIFU輻照下發(fā)生線性震蕩從而轉(zhuǎn)化為微氣泡［17］，HD@P-NPs通過與周圍組織環(huán)境形成聲阻抗差異，產(chǎn)生顯著的背向散射信號，從而實現(xiàn)靶區(qū)結(jié)構(gòu)成像［18-19］。本實驗結(jié)果顯示，HD@P-NPs信號強(qiáng)度隨著輻照聲強(qiáng)及輻照時間的增加而逐漸增強(qiáng)，最終在聲強(qiáng)3 W/cm2、時間2 min輻照條件下產(chǎn)生最大的信號強(qiáng)度，但過度輻照會造成一定的信號衰減，當(dāng)聲強(qiáng)3 W/cm2、輻照3 min時信號強(qiáng)度有所減弱，這可能是由于相變微泡聚合后導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，出現(xiàn)崩塌。本實驗結(jié)果表明HD@P-NPs具有良好的超聲成像效果，核心搭載的PFH在LIFU輻照下通過機(jī)械震蕩產(chǎn)生聲滴汽化效應(yīng)，實現(xiàn)了結(jié)構(gòu)微泡化，且輻照聲強(qiáng)和輻照時間為誘發(fā)相變產(chǎn)生的關(guān)鍵因素。低頻超聲波具有較強(qiáng)的聲波穿透力，可以暫時增加細(xì)胞間隙和細(xì)胞膜通透性，在促進(jìn)納米藥物滲透的同時又可保護(hù)周圍正常組織，這種超聲結(jié)合微泡的主要優(yōu)勢在于藥物的釋放具有選擇性［20-21］。本實驗結(jié)果顯示KFs對HD@P-NPs攝取呈明顯時間依賴性，孵育4 h后KFs內(nèi)紅色熒光明顯多于HUVECs，表明HD@P-NPs通過脂膜互溶可促進(jìn)KFs內(nèi)納米攝取，通過體外LIFU輻照可實現(xiàn)HD@P-NPs的靶區(qū)精準(zhǔn)釋放，并減少對周圍正常組織的損傷。

本實驗細(xì)胞毒性實驗結(jié)果顯示，不同濃度空白脂質(zhì)納米粒下KFs存活率均在90%左右，可排除納米毒性干擾，為SDT研究提供了有力的支持。進(jìn)一步將KFs按照不同實驗條件進(jìn)行共孵育，結(jié)果顯示HD@P-NPs+LIFU輻照組細(xì)胞存活率為（49.75±1.25）%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），分析其機(jī)制可能為：靶區(qū)裂解釋放的DOX及LIFU協(xié)同作用會產(chǎn)生強(qiáng)大的聲敏治療作用，HMME聯(lián)合LIFU輻照后，HD@P-NPs的細(xì)胞抑制作用明顯增強(qiáng)，同時該納米粒穩(wěn)定性好，可減少DOX不穩(wěn)定滲漏的發(fā)生［22］。采用脂質(zhì)納米粒對DOX進(jìn)行包裹，可減少其對周圍組織的作用，并進(jìn)一步實現(xiàn)深部瘢痕組織的靶向治療。本實驗各組遷移率比較結(jié)果顯示，HD@P-NPs+LIFU輻照組細(xì)胞遷移率低于其余各組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均Plt;0.05），表明僅將HMME及DOX包載于脂質(zhì)納米探針的細(xì)胞遷移抑制作用不及HD@P-NPs+LIFU輻照組細(xì)胞，其機(jī)制可能為細(xì)胞外膠原沉積所構(gòu)建的物理屏障對納米藥物的滲透有一定限制，這也是惡性纖維化疾病治療的一大障礙?？栈⑴菽軌蛴行д{(diào)節(jié)細(xì)胞間質(zhì)壓力，進(jìn)而提升細(xì)胞療效，LIFU輻照后細(xì)胞膜通透性得到暫時提升，有助于減小向外梯度分布的間質(zhì)壓力，為納米藥物的滲透創(chuàng)造了有利條件［23］，增加了靶區(qū)聲敏藥物的蓄積，因此HD@P-NPs+LIFU輻照組細(xì)胞表現(xiàn)出明顯遷移抑制。大量的活性氧可導(dǎo)致細(xì)胞器功能障礙、細(xì)胞內(nèi)氧化還原動態(tài)平衡紊亂，并通過內(nèi)源性線粒體通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實驗結(jié)果顯示，HD@P-NPs+LIFU輻照組活性氧熒光強(qiáng)度顯著高于其余各組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均Plt;0.05）。這是因為除了DOX的氧化應(yīng)激作用，還與HMME強(qiáng)大的活性氧產(chǎn)率有關(guān)，LIFU輻照下HMME受到激活，從基態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，隨后與鄰近氧分子進(jìn)行連續(xù)化學(xué)反應(yīng)，最終產(chǎn)生豐富的活性氧產(chǎn)物［24］。同時，LIFU靶向破壞納米釋放的DOX能夠提高靶區(qū)有效藥物濃度，從而實現(xiàn)SDT與DOX聯(lián)合作用下的細(xì)胞生長抑制，達(dá)到藥物協(xié)同增效治療的目的。

綜上所述，本實驗成功制備了一種以SDT為基礎(chǔ)的新型脂質(zhì)載藥納米探針HD@P-NPs，具有較好的相變成像效果，可為瘢痕疙瘩的治療提供高對比度圖像，通過SDT與DOX的聯(lián)合靶區(qū)釋放，加速了KFs凋亡，為瘢痕疙瘩及KFs相關(guān)疾病的監(jiān)測和治療提供了理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2024-04-09）