摘 要： 旨在對九疑山兔線粒體基因組進行組裝，探究其系統(tǒng)進化和分類地位。本研究采用高通量測序技術對20只150日齡九疑山兔的耳組織進行了全基因組測序，利用生物信息學軟件對線粒體基因組進行組裝，并對獲得的線粒體基因組進行序列分析、基因預測和注釋，隨后基于已發(fā)表的家兔、野兔、經濟動物和模式動物的線粒體基因組序列進行多序列比對和系統(tǒng)進化分析，對研究群體的多態(tài)性位點進行鑒定。組裝獲得長度為17 306 bp的九疑山兔線粒體基因組全序列，其堿基組成、基因分布與已發(fā)表的5個家兔品種的線粒體基因組基本一致?；贒-loop區(qū)的系統(tǒng)進化分析表明，九疑山兔與福建黃兔進化關系較近，而與歐洲穴兔、沂蒙毛兔、川白獺兔和新西蘭白兔較遠。通過其與14種野兔及11種經濟/模式動物的種間系統(tǒng)進化分析表明，九疑山兔與歐洲野兔、海南兔和白靴兔親緣關系較近，與其他野兔和經濟/模式動物較遠。研究群體的線粒體基因組保守區(qū)共鑒定到了12個突變位點，其中有3個突變的群體等位基因頻率大于0.8，為多態(tài)性位點。本研究組裝獲得了首個九疑山兔的完整線粒體基因組序列，明確了九疑山兔與其它品種家兔、野兔和常見經濟/模式動物的親緣關系和分類地位，為九疑山兔的種質資源利用和品種選育等研究提供了基礎數(shù)據(jù)。

關鍵詞： 九疑山兔；線粒體基因組；高通量測序；系統(tǒng)進化

中圖分類號： S829.1

文獻標志碼： A

文章編號：0366-6964（2024）10-4417-11

收稿日期：2024-03-07

基金項目：湖南省科技廳項目：九疑山兔選優(yōu)提純研究（2019NK4192）

作者簡介：李聰聰（1993-），女，河南南陽人，碩士，主要從事家兔遺傳與分子育種研究，E-mail：lcc199308@126.com

*通信作者：黃生強，主要從事分子遺傳與動物育種研究，E-mail：hsq07@126.com

Mitochondrial Genome Assembly and Phylogenetic Analysis of the Jiuyishan Rabbit

LI" Congcong1， HUANG" Zike1， HUANG" Nianni1， MA" Shiyu1， LIU" Han1， XIAO" Zhibiao2， SONG

Guo2， JIANG" Liang2， PENG" Weibo2， YANG" Lianxi3， GUO" Yuntao4， HUANG" Shengqiang1*

（1.College of Animal Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128，

China;

2.Animal Husbandry and Fisheries Affairs Center of Ningyuan County， Yongzhou 425600，

China;

3.Hunan Hyplus Agricultural and Pastoral Technology Co.， Ltd.， Yongzhou 425600，" China;

4.The Medical Laboratory of Nantong ZhongKe Co.， Ltd.， Nantong 226000，" China）

Abstract：" The aim of the study was to assemble the mitochondrial genome of the Jiuyishan rabbit and to investigate its phylogenetic evolution and taxonomic position. High-throughput sequencing technology was employed to perform whole-genome sequencing on ear tissues from 20 Jiuyishan rabbits at 150 days of age. Bioinformatics software was employed for the assembly of the mitochondrial genome， followed by conducting sequence analysis， gene prediction and annotation of the obtained mitochondrial genome. Subsequently， multiple sequence alignment and phylogenetic analysis were conducted based on the published mitochondrial genome sequences of rabbits， hares， economically important animals and model animals. Polymorphic sites within the study population were identified. The complete mitochondrial genome sequence of the Jiuyishan rabbit was successfully obtained， the length was 17 306 bp. The nucleotide composition and gene arrangement of the mitochondrial genome were found to be largely consistent with those reported for 5 previously published domestic rabbit breeds. Phylogenetic analysis based on the D-loop region indicated a closer evolutionary relationship between the Jiuyishan rabbit and the Fujian Yellow rabbit， while Jiuyishan rabbit was more distantly related to the European rabbit， Yimeng Wool rabbit， Chuanbai Rex rabbit and New Zealand White rabbit. Interspecific phylogenetic analysis involving 14 wild rabbit species and 11 economic or model animal species demonstrated that the Jiuyishan rabbit shared a closer phylogenetic relationship with the European wild rabbit， Hainan rabbit， and the White-booted rabbit but was further with others. A total of 12 mutation sites were identified in the conserved regions of the mitochondrial genome of the study population， with 3 mutations having allele frequencies greater than 0.8， indicating polymorphism. This study has successfully assembled the first complete mitochondrial genome sequence of the Jiuyishan rabbit， clarifying its phylogenetic relationships and taxonomic status in comparison to other domestic rabbit breeds， wild rabbits and common economic or model animals. This work provides foundational data for the utilization of genetic resources and the breeding of the Jiuyishan rabbit.

Key words： Jiuyishan rabbit; mitochondrial genome; high-throughput sequencing; phylogenetic evolution

*Corresponding author： HUANG Shengqiang， E-mail：hsq07@126.com

家兔是兔形目兔科穴兔屬哺乳動物［1］，九疑山兔是我國一個重要的家兔品種，原產于湖南省寧遠縣九疑山，屬小型皮肉兼用型地方兔，具有性成熟早、繁殖率高、 適應性廣、耐潮濕、易飼養(yǎng)、體型小及毛色豐富等特點。由于主產區(qū)比較偏遠、閉塞，人為影響較小，九疑山兔是我國家兔地方品種“原生態(tài)”保持最好的一個品種，是家兔研究中寶貴的遺傳資源［2］。哺乳動物的線粒體基因組結構較簡單，大小約17 kb，在細胞中為多拷貝，具有嚴格的母系遺傳、結構簡單、 能獨立復制、具有較高的突變率且變異發(fā)生的幾率相對穩(wěn)定等特點［3-6］。線粒體基因組研究對揭示物種馴化和群體結構規(guī)律具有重要意義［7-12］。目前NCBI數(shù)據(jù)庫中已收錄了5種家兔基因組［13-17］，分別為新西蘭白兔、沂蒙毛兔、歐洲穴兔、福建黃兔和川白獺兔，但九疑山兔的線粒體基因組尚未被研究，因此本研究擬對九疑山兔的線粒體基因組進行高通量測序，利用生物信息學方法對其進行組裝、注釋和序列分析，以期為九疑山兔的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

本研究共納入20只九疑山兔，來自湖南省寧遠縣九疑山保種場，全部為公兔，在相同的環(huán)境和日糧飼喂條件下飼養(yǎng)至150日齡，每只兔子采集耳部組織5～8 g，使用生理鹽水清洗后分割成小塊兒，迅速投于液氮中冷凍，后轉移至裝有干冰的泡沫盒中送回實驗室，置于-80℃冰箱保存。

1.2 核酸提取

按照QIAGEN血液/組織基因組DNA提取試劑盒DNeasy Blood amp; Tissue Kit說明書從500 mg組織中抽提總DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA降解程度以及是否有RNA、蛋白質污染，并使用Qubit3.0 Fluorometer對DNA濃度進行精確定量。其中DNA濃度≥20 ng·μL-1，總量300 ng以上的DNA樣品為合格樣品。

1.3 文庫構建和高通量測序

每只兔子取300 ng基因組DNA樣品進行文庫構建。首先采用超聲法將大片段DNA打斷，并用磁珠分選的方法得到長度為300～500 bp的DNA片段。繼而使用T4-DNA聚合酶等，將打斷得到的黏性末端片段修復為平末端，并在3′端加上A堿基。隨后在T4-DNA連接酶的作用下，在DNA片段兩端加上帶index序列的接頭。使用PCR方法對DNA片段進行擴增，并將其環(huán)化酶切，得到純凈的環(huán)狀DNA文庫。文庫質控后，使用滾環(huán)擴增（RCA）的方法，將文庫制備為DNA納米球（DNB）。將DNB加載到 Pattern Array 芯片上，使用中科基因的DNBSEQ-T7測序平臺進行PE150讀長高通量測序工作。

1.4 生物信息學分析

原始數(shù)據(jù)下機后，首先使用fastp［18］軟件（版本：v0.20.0，參數(shù)：默認）對原始數(shù)據(jù)進行預處理，去掉接頭、低質量和長度過短的序列，獲得高質量數(shù)據(jù)。隨后使用bwa［19］軟件（版本：0.7.12-r1039，參數(shù)：mem-t 10-R \"@RG/tID：Sample/tLB：Sample/tSM：Sample/tPL：ILLUMINA\"）將高質量的序列比對至家兔的參考基因組（版本：OryCun2.0），使用samtools［20］（版本：1.2，參數(shù)：sort-@10-O BAM）、sambamba［21］（版本：0.7.0，參數(shù)：markdup -t 10）軟件對bam文件進行排序和標重，并利用varscan［22］軟件（版本：2.4.4-1，參數(shù)：mpileup2cns --min-coverage 100 --min-reads2 10 --output-vcf --variants --min-freq-for-hom 0.8 --min-var-freq 0.01 --p-value 0.05）對線粒體基因組上的突變進行鑒定，隨后使用annovar［23］（版本：2016-02-01，參數(shù)：-remove -buildver ocu2.0 -operation g -nastring. -argument \"-hgvs\" -vcfinput -thread 4 -maxgenethread 4）和snpEff［24］軟件（版本：4.3g，參數(shù)：ann -noStats -v OcuMT）進行突變的注釋。使用samtools（版本：1.2，參數(shù)：stats -@8）和mosdepth［25］軟件（版本：0.2.5，參數(shù)：--flag 0 --threads 10 --no-per-base --thresholds 0，4，10，20，30，50，100，300，500，1 000，3 000，5 000）進行基因組比對率、深度和覆蓋度的統(tǒng)計。使用MEANGS［26］軟件（版本：V.1.0，參數(shù)：-t 6 -n 20 000 000 -i 350 --deepin）進行線粒體基因組的組裝，并利用mitofinder［27］軟件（版本：1.4.1，參數(shù)：-r NC_001913.1.gb -o 2 -p 8 -m 32）進行線粒體基因預測和注釋，獲得的九疑山兔線粒體基因組序列已上傳至NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫（登陸號：PP357264）。使用OGDRAW［28］線上工具（https：∥chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）進行線粒體基因組結構圈圖繪制。使用perl程序（版本：5.16）和R軟件（版本：4.0.2）對獲得的九疑山兔線粒體基因組進行堿基組成分析和繪圖。使用MEGA［29］軟件的ClustalW工具進行多序列比對，并進行NJ（Neighbor-Joining Algorithm，鄰接法）樹的構建，建樹采用Bootstrap方法，迭代次數(shù)為1 000。

1.5 公共數(shù)據(jù)獲取

本研究從NCBI （https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/） GenBank數(shù)據(jù)庫檢索并下載5種國內外家兔和14種國內外野兔以及11種常見經濟動物及模式動物的線粒體基因組，詳見表1。

2 結 果

2.1 測序數(shù)據(jù)質量

對20只九疑山兔的耳組織DNA進行全基因組測序，平均每個樣本質控后獲得54.31G高質量測序數(shù)據(jù)（48.38G～60.49G），Q30平均為93.14%（89.87%～94.2%），插入片段平均長度為 337.15 bp（290～374 bp），平均GC含量為43.40%（42.61%～45.2%）。將數(shù)據(jù)與歐洲穴兔的參考基因組（版本：OryCun2.0）比對后，平均比對率為99.16%。全基因組水平的測序深度約18.33×，而線粒體基因組上平均測序深度達到5 477.36×。質控結果說明九疑山兔耳組織中的線粒體拷貝數(shù)較多，測序數(shù)據(jù)質量高，平均深度足以滿足后續(xù)組裝線粒體基因組和進一步分析要求，詳見表2。

2.2 九疑山兔線粒體基因組組裝和注釋

對質控后的數(shù)據(jù)進行組裝后獲得1個高質量環(huán)狀九疑山兔線粒體基因組，序列總長度為17 306 bp，位于5種已報道的家兔線粒體全基因組序列長度范圍之間（16 024～17 755 bp），AT堿基的比例為59.43%、GC堿基比例為40.57%，呈現(xiàn)明顯的 AT 偏好性。九疑山兔的線粒體基因組結構高度保守，基因組成和排列順序均與其他兔種基因組相同，共注釋到 13 個蛋白質編碼基因、22 個 tRNA 基因（tRNA-Met、tRNA-Ile、tRNA-Gly、tRNA-Ala、tRNA-Leu*2、tRNA-Val、tRNA-Pro、tRNA-Phe、tRNA-Trp、tRNA-Ser*2、tRNA-Gln、tRNA-Thr、tRNA-Cys、tRNA-Asn、tRNA-Tyr、tRNA-Asp、tRNA-Glu、tRNA-Lys、tRNA-Arg、tRNA-His），2 個 rRNA 基因（rrnL、rrnS）和非編碼控制區(qū)1個（D-loop）（圖1，表3）。13個蛋白編碼基因包括1個CYTB基因、2個ATPase（ATP8和ATP6）、3個氧化酶亞基（COX1、COX2和COX3）和7個脫氫酶亞基（ND1～ND6和ND4L）。22個 tRNA 基因中有14個tRNA位于H鏈上，8個tRNA位于L鏈上。九疑山兔線粒體基因組的控制區(qū)（D-loop區(qū)）位于15 446～17 306 bp，長度為1 861 bp，在tRNA-Pro和tRNA-Phe之間，含有較多的重復序列，AT含量是55.67%，GC含量是44.33%。

2.3 家兔各品種D-loop區(qū)堿基組成和系統(tǒng)進化分析

D-loop區(qū)與線粒體基因組上的其他區(qū)域相比，具有更高的進化速率，常用來分析品種之間的系統(tǒng)進化關系。從NCBI收集已發(fā)表的5種國內外家兔品種（福建黃兔、歐洲穴兔、新西蘭白兔、川白獺兔和沂蒙毛兔）的線粒體基因組序列，提取其D-loop序列。首先，對家兔各個品種線粒體基因組D-loop的堿基比例進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)九疑山兔和福建黃兔的AT堿基比例略低于歐洲穴兔、新西蘭白兔、川白獺兔和沂蒙毛兔（圖2A）。隨后對這些序列進行多序列比對并基于NJ法構建系統(tǒng)進化樹（圖2B），結果表明九疑山兔與福建黃兔進化關系較近并聚為一支，歐洲穴兔與新西蘭白兔、沂蒙毛兔、川白獺兔則聚為另外一支。說明九疑山兔與福建黃兔進化關系較近，而與歐洲穴兔、沂蒙毛兔、川白獺兔和新西蘭白兔進化關系較遠。

2.4 九疑山兔與其他物種間堿基組成和系統(tǒng)進化分析

為了研究九疑山兔與其他物種的進化關系，從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫獲得14個野兔和11個經濟/模式動物的線粒體基因組序列［30-38］，分別作為近緣物種和外群參與分析（圖3）。首先，對各個物種線粒體基因組的堿基分布進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)九疑山兔、新西蘭白兔、沂蒙毛兔、歐洲穴兔、福建黃兔和川白獺兔這6種家兔的堿基組成比例接近。高原兔、塔里木兔、海南兔、歐洲野兔、白靴兔、雪兔、草兔、藏兔、華南兔、草兔-托氏兔、韓國野兔、格拉納達野兔、白尾長耳大野兔和北極兔等野兔的4種堿基含量基本一致，AT含量較家兔略高。外群的綿羊、山羊、人、牛、馬、豬、斑馬魚、小鼠、大鼠等經濟或模式動物AT堿基組成比例較野兔AT堿基更小，果蠅的AT堿基含量占比最大超過家兔，小鼠和大鼠的堿基基本一致且略高于家兔。

使用線粒體基因組全序列進行多序列比對并進行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)九疑山兔與歐洲野兔和海南兔、白靴兔親緣關系較近，與其他野兔品種關系稍遠，且與其他參與對比的11種經濟或模式動物聚為不同兩個分支，外群中九疑山兔與大鼠、小鼠的親緣關系最近，其次是斑馬魚、雞、人、馬、豬、牛、綿羊、山羊，外群中九疑山兔與果蠅的親緣關系最遠。

2.5 九疑山兔線粒體保守區(qū)多態(tài)性位點

以已發(fā)表的新西蘭白兔的線粒體基因組為參考，分析本研究納入的20只九疑山兔群體的單核苷酸多態(tài)性（SNV）和插入缺失（InDel）變異，發(fā)現(xiàn)D-loop區(qū)域有較多的突變，保守區(qū)域鑒定到了12個突變位點（表4），其中有3個突變位于非編碼RNA上（ncRNA_exonic），1個突變位于基因間區(qū)（intergentic），8個突變位于外顯子區(qū)（exonic）。外顯子區(qū)的突變中有3個為同義突變，5個為錯義突變。錯義突變中有2個位點的群體等位基因頻率（MAF）大于等于0.95，分別是MT-5870-G-C、MT-11565-T-C，分別位于COX1、ND4基因上，tRNA-Thr基因上也鑒定到1個突變MT-15341-T-C，MAF為0.85（表4）。經過與5種已發(fā)表家兔、海南兔、火山兔和人線粒體基因組相同位置及附近的序列比較，發(fā)現(xiàn)這3個突變均在多個物種/品種中出現(xiàn)，并不保守，不會影響蛋白功能，為多態(tài)性位點。

另外還鑒定到3個MAF較低的錯義突變位點MT-4643-T-G、MT-7379-A-G和MT-12400-A-C，分布在ND2、COX2和ND5基因上，其功能尚不明確。

3 討 論

九疑山兔是我國優(yōu)秀的小型皮肉兼用型地方兔，是原生態(tài)保持非常好的兔種質資源材料，從線粒體基因組層面分析九疑山兔的系統(tǒng)發(fā)育地位，對探究其起源、進化和種群分類具有重要意義。本研究采用高通量測序技術和生物信息學分析獲得了長度為17 306 bp的九疑山兔線粒體基因組全序列，對其進行了基因預測和注釋，發(fā)現(xiàn)其基因組成和分布與已發(fā)布的其他5種家兔一致，各基因長度也基本一致，表明家兔線粒體基因組在進化上具有高度保守性。九疑山兔線粒體基因組序列中AT 含量高于GC含量，表現(xiàn)出明顯的AT偏好性，這一現(xiàn)象在其他家兔和野兔線粒體中同樣存在［15，17］，只是比例因品種不同而略有差異。

研究人員在2003年對來源于中國本土和不同時間引入的20個品種的104個家兔個體線粒體DNA的約700 bp控制區(qū)進行測序，并構建了一個簡化的中繼網(wǎng)絡（MJ），結果顯示3個中國本土家兔品種（福建黃兔、太行山兔和四川白兔）被劃分到兩個歐洲家兔品種分支，推測中國家兔地方品種是從歐洲引進［39］。2021年Liu等［4］用限制性內切酶簡化基因組測序技術（RAD-seq）從6個中國本土家兔品種和2個進口家兔品種中獲得1 006 496個SNPs標記，進行了鄰接樹（NJ）、主成分分析（PCA）、常染色體和Y染色體群體結構分析，結果顯示福建黃兔、云南彩兔和九疑山兔聚為一類。本研究中，九疑山兔與福建黃兔在系統(tǒng)發(fā)育樹中聚為一支，整體距離歐洲穴兔較近，可能也是源于歐洲穴兔。Wang等［13］在2021年首次測定了德國雷克斯兔和美國雷克斯兔雜交而來的川白獺兔的線粒體基因組，使用NJ鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)川白獺兔與歐洲穴兔親緣關系最近。2023年Setiaji等［40］首次測定了印度尼西亞土兔線粒體基因組序列，系統(tǒng)進化分析結果顯示，新西蘭白兔與沂蒙毛兔的關系較近，在本研究中得到印證。2019年Yao等［14］首次獲得了沂蒙毛兔線粒體全基因組序列，系統(tǒng)進化樹顯示沂蒙毛兔與川白獺兔關系最近，而歐洲穴兔關系稍遠，與本研究結果一致。Xie等［17］對國內外7個不同品種的180只家兔進行了全基因組測序，鑒定出174 301 84個高質量的SNV，并分析了群體的遺傳多樣性和種群結構，發(fā)現(xiàn)九疑山兔的遺傳多樣性較高，在進化關系上與歐洲兔和和國外引入兔種較近，與國內本土兔種較遠，與本研究結果一致，推測九疑山兔血統(tǒng)成分較復雜，可能存在與外來兔種的雜交。

將九疑山兔的線粒體基因組序列與表1中列出的14種野兔和11種經濟/模式動物的線粒體基因組進行系統(tǒng)進化分析表明，九疑山兔與表1中列出的14種野兔的親緣關系較近，與10種哺乳動物的親緣關系次之，與果蠅的親緣關系最遠，與預期一致，從另外的維度印證了基因組序列的可靠性。2020年周彤等［16］對同為家兔的福建黃兔線粒體基因組全序列測定與分析，并基于線粒體基因組控制區(qū)序列構建10種兔形目動物的系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)海南兔與福建黃兔的進化關系較近，與本研究結果相互印證。

值得一提的是，本研究從九疑山兔群體中鑒定到了MT-5870-G-C、MT-11565-T-C和MT-15341-T-C 三個群體攜帶頻率較高的多態(tài)性位點，雖然經過保守性的評估，這些位點均不會對蛋白質產生顯著的影響，但這些位點有作為識別位點來進行品種鑒定標記的潛能。另外鑒定到了3個MAF較低的錯義突變位點MT-4643-T-G、MT-7379-A-G和MT-12400-A-C，分布在ND2、COX2和ND5基因上，因為群體規(guī)模的限制，暫無法確定其真實群體攜帶頻率，在將來的研究中將會納入更多的樣本對這些“罕見”位點進行進一步研究。

4 結 論

本研究組裝獲得了九疑山兔的完整線粒體基因組序列，明確了九疑山兔與其它家兔品種、野兔和常見經濟/模式動物的親緣關系和分類地位，為九疑山兔的種質資源利用和品種選育等研究提供了基礎數(shù)據(jù)。

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（編輯 郭云雁）