摘 要： 前期研究發(fā)現(xiàn)宿主表觀遺傳調(diào)控蛋白——含溴結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)4（bromodomain-containing protein 4， BRD4）有助于非洲豬瘟病毒 （African swine fever virus， ASFV） 的復(fù)制，為了深入研究 BRD4 對(duì) ASFV 復(fù)制的影響，通過篩選出顯著促進(jìn) ASFV 復(fù)制的 BRD4-BD1/2 結(jié)構(gòu)域，利用慢病毒表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá) BRD4-BD1/2 結(jié)構(gòu)域的 3D4/21 細(xì)胞系，分析 ASFV 在 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系與 WT 細(xì)胞系之間的復(fù)制差異。首先，以家豬基因 BRD4-BD1/2 為靶標(biāo)，構(gòu)建了含有 3x Flag 標(biāo)簽的重組質(zhì)粒 pLVX-IRES-puro-3x Flag-BRD4-BD1/2，并將其與質(zhì)粒 pMD2.G 和 pSPAX2 共同轉(zhuǎn)染至 HEK-293T 細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，獲得具有感染能力的慢病毒。使用慢病毒感染 3D4/21 細(xì)胞后通過嘌呤霉素藥物篩選，成功獲得了穩(wěn)定表達(dá) BRD4-BD1/2 結(jié)構(gòu)域的 3D4/21 細(xì)胞系。利用 RT-qPCR 和 Western blot 技術(shù)分別檢測(cè)了 ASFV 感染 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞后 CP204L 和 B602L 基因的轉(zhuǎn)錄水平以及相應(yīng)蛋白表達(dá)水平，并通過 HAD50 測(cè)定評(píng)價(jià) ASFV 的復(fù)制能力。研究結(jié)果表明：成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá) BRD4-BD1/2 結(jié)構(gòu)域的 3D4/21 細(xì)胞系。與 3D4/21-WT 細(xì)胞系相比，BRD4-BD1/2 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系能夠顯著促進(jìn) ASFV 復(fù)制。本研究提供了深入研究 BRD4 蛋白在 ASFV 復(fù)制中功能的生物材料，并為 ASFV 疫苗候選株的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 非洲豬瘟病毒；BRD4；BD1/2；3D4/21 細(xì)胞；穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系

中圖分類號(hào)：S852.65

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）10-4646-14

收稿日期：2023-11-29

基金項(xiàng)目：國家自然基金面上項(xiàng)目（32072830）; 國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD1800101）;甘肅省重大專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目（22ZD6NA001）; 中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（CAAS-ZDRW202409）; 甘肅省基礎(chǔ)研究創(chuàng)新群體項(xiàng)目（22JR5RA024）和特派團(tuán)項(xiàng)目（22CX8NA011）; 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2021-LVRI）

作者簡介：吳夢(mèng)麗（1999-），女，河南鄭州人，碩士，主要從事動(dòng)物病毒學(xué)研究， E-mail：15238649312@163.com

*通信作者：牛慶麗，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail： niuqingli@caas.cn

Construction of a Passaged Porcine Alveolar Macrophage Cell Line Stably Expressing the

Porcine BRD4-BD1/2 Protein and Its Effects on ASFV Proliferation

WU Mengli1，2， SUN" Hualin1，2， YANG" Jifei1，2， ZHAO" Yaru1，2， GUAN" Guiquan1，2， YIN" Hong1，2， 3，

NIU" Qingli1，2*

（1.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention， College of Veterinary Medicine，

Lanzhou University， Lanzhou Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences，

Lanzhou" 730000，" China;

2.African Swine Fever Regional Laboratory of China （Lanzhou）

， Gansu Province Research Center for Basic Disciplines of Pathogen Biology， Lanzhou" 730046，

China;

3.Jiangsu Co-Innovation Center for the Prevention and Control of Important Animal Infectious

Disease and Zoonosis， Yangzhou University， Yangzhou" 225009，" China）

Abstract：" Previous studies have identified that the host epigenetic regulator， bromodomain-containing protein 4 （BRD4） facilitates the replication of the African swine fever virus （ASFV）. To further investigate the impact of BRD4 on ASFV replication， the BRD4-BD1/2 domain， which significantly enhances ASFV replication， was identified. Using a lentiviral expression system， a stably expressing 3D4/21 cell line of the BRD4-BD1/2 domain was successfully constructed to analyze replication differences between the 3D4/21-BRD4-BD1/2 cell line and the wild-type （WT） cell line. Initially， a recombinant plasmid， pLVX-IRES-puro-3x Flag-BRD4-BD1/2， targeting the porcine gene BRD4-BD1/2 and containing a 3x Flag tag， was constructed. This plasmid， along with plasmids pMD2.G and pSPAX2， was transfected into HEK-293T cells for lentiviral packaging to obtain infectious lentiviruses. Following lentiviral infection of 3D4/21 cells and selection with puromycin， a cell line stably expressing the BRD4-BD1/2 domain was established. The transcription levels of ASFV genes CP204L and B602L， and the expression levels of their corresponding proteins in ASFV-infected 3D4/21-BRD4-/BD1/2 cells， were detected using RT-qPCR and Western blot techniques， respectively. ASFV replication capacity was assessed using the HAD50 assay. The results showed that the stably expressing BRD4-BD1/2 domain in the 3D4/21 cell line significantly enhanced ASFV replication compared to the 3D4/21-WT cell line. This study provides biological material for in-depth research on the function of the BRD4 protein in ASFV replication and lays a theoretical foundation for the development of ASFV vaccine candidates.

Key words： African swine fever virus; BRD4; BD1/2; 3D4/21 cells; stable expression cell lines

*Corresponding author：" NIU Qingli， E-mail： niuqingli@caas.cn

非洲豬瘟 （African swine fever） 是一種能引起豬嚴(yán)重高熱的出血性疾病，病原為非洲豬瘟病毒 （African swine fever virus， ASFV）［1］。ASF 的臨床癥狀根據(jù)感染病毒毒株的毒力可以分為最急性型、急性型、亞急性型和慢性型。一般潛伏期約為 15 d，而重癥感染的個(gè)體可能在感染后 2～10 d 內(nèi)死亡［2-3］。ASF 能夠感染家豬和野豬，致死率可達(dá) 100%，對(duì)全球豬業(yè)和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生嚴(yán)重影響［4-5］。

ASFV 是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，是一種復(fù)雜的大型二十面體雙鏈 DNA 病毒。其結(jié)構(gòu)包括病毒基因組、內(nèi)核、內(nèi)膜、衣殼和囊膜［6］。病毒復(fù)制主要發(fā)生在宿主細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，涉及四個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄階段，包括即刻早期、早期、中期和晚期［7］。感染的主要細(xì)胞類型包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，它們通過吞噬作用和抗原呈遞等機(jī)制在免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［8-9］。

盡管原代肺泡巨噬細(xì)胞 （pulmonary alveolar macrophage，PAMs） 是目前用于研究 ASFV 感染機(jī)制和病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)的首選細(xì)胞，但受個(gè)體差異限制以及其缺乏商業(yè)化性能，使其在某些情況下不夠理想。3D4/21 （ATCC CRL-2843）細(xì)胞是用 pSV3neo 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代豬肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物后，建立了豬單髓細(xì)胞系3D4，通過 G-418 篩選建立。盡管其感染后病毒復(fù)制能力有限，但其作為一種宿主源性的體外連續(xù)傳代細(xì)胞系，可用于病毒感染后的免疫反應(yīng)和病毒與宿主之間相互作用的機(jī)制研究［10］。

含溴結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)4（bromodomain-containing protein 4， BRD4） 作為一種關(guān)鍵的表觀遺傳調(diào)節(jié)蛋白和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在多個(gè)生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期控制、癌癥和病毒感染等［11-12］。BRD4 包括兩個(gè)高度保守的 N 端溴結(jié)構(gòu)域（BD1和BD2），可識(shí)別組蛋白和非組蛋白上的乙酰賴氨酸殘基，同時(shí)還包含一個(gè)參與蛋白質(zhì)互作的 ET 結(jié)構(gòu)域。研究表明，BRD4 在人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、人乳頭瘤病毒（human papillomaviruses，HPV）、單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）等多種病毒感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用［13-15］。Wang等［16］還發(fā)現(xiàn)通過抑制 BRD4 蛋白的表達(dá)，可以激活 DNA 損傷相關(guān)的 cGAS-STING 通路，從而激發(fā)抗病毒天然免疫反應(yīng)。

BRD4 是 BET 家族中的一種關(guān)鍵蛋白質(zhì)，由兩個(gè)溴結(jié)構(gòu)域（BD1 和 BD2）和一個(gè)額外的末端域（ET）組成。它的兩個(gè)溴結(jié)構(gòu)域（BD1 和 BD2）對(duì)于 BRD4 發(fā)揮功能至關(guān)重要，通過識(shí)別并結(jié)合到乙?；M蛋白和一系列非組蛋白質(zhì)上，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄活性，ET 結(jié)構(gòu)域在轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮關(guān)鍵作用。BD1 通常與基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)和激活相關(guān)，而 BD2 則在轉(zhuǎn)錄延伸和后續(xù)步驟中發(fā)揮作用，這種功能上的差異反映了 BRD4 在基因表達(dá)調(diào)控中的復(fù)雜性和多樣性［17］。為了深入研究 ASFV 感染過程中 BRD4 不同結(jié)構(gòu)域的作用，分別構(gòu)建了帶有 3x Flag 標(biāo)簽的 BRD4 全長、 BD1/2 結(jié)構(gòu)域以及 BD1 截短體質(zhì)粒。通過 Western blot 在蛋白水平上檢測(cè) BRD4、BD1/2、BD1 對(duì) ASFV 復(fù)制的影響，結(jié)果表明 BRD4-BD1/2 對(duì) ASFV 復(fù)制具有明顯的促進(jìn)作用。

鑒于 BRD4-BD1/2 結(jié)構(gòu)域的重要性，作者進(jìn)一步應(yīng)用慢病毒包裝技術(shù)成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá) BRD4-BD1/2 的 3D4/21 細(xì)胞系。慢病毒 （lentivirus）包裝系統(tǒng)構(gòu)建是將外源基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，以實(shí)現(xiàn)外源基因長期穩(wěn)定表達(dá)的方法。這一技術(shù)廣泛應(yīng)用于研究特定蛋白或病毒功能，例如，ASFV-E165R 蛋白在 PK-15 細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)［18］；ASFV-D1133L 蛋白在 MA-104 細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)［19］；宿主 HDAC6 蛋白在 Vero 細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)等［20］。本研究中，作者發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá) BRD4-BD1/2 結(jié)構(gòu)域可顯著促進(jìn) ASFV 的復(fù)制，證明了 BRD4-BD1/2 在 ASFV 復(fù)制中的重要性?？偠灾髡呃寐《景b技術(shù)成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá) BRD4-BD1/2 結(jié)構(gòu)域的 3D4/21 細(xì)胞系，并驗(yàn)證了其對(duì) ASFV 復(fù)制的促進(jìn)作用。這為進(jìn)一步研究 BRD4 在 ASFV 感染中的作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)，同時(shí)為病毒增殖和疫苗生產(chǎn)提供了生物學(xué)材料。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與病毒

豬肺泡巨噬細(xì)胞（3D4/21）和人胚胎腎細(xì)胞 （HEK-293T）由本實(shí)驗(yàn)室保存。慢病毒包裝質(zhì)粒 pLVX-IRES-Puro、pMD2.G 和 pSPAX2 均由本實(shí)驗(yàn)室保存。ASFV 基因 II 型強(qiáng)毒株 ASFV CN/GS/2018，ASFV 綠色熒光蛋白表達(dá)株 （ASFV-EGFP） 是以 ASFV CN/GS/2018 的親本株構(gòu)建了僅插入 EGFP-Tag 的重組病毒，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所國家非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒?yàn)室（蘭州）構(gòu)建并保存。

1.2 試劑和抗體

胎牛血清 （FBS）、0.25% EDTA-Trypsin、嘌呤霉素、RPMI 1640 培養(yǎng)基和高糖 DMEM 培養(yǎng)基、RIPA 裂解液均購于 Thermo Scientific 公司。青霉素-鏈霉素-兩性霉素（三抗）購于北京索萊寶公司。限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ和 BamHⅠ、DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶均購于 NEB 公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 TaKaRa 公司。膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自南京諾唯贊公司。Cell Counting Kit-8 （CCK8） 購自 APExBIO Technology LLC 公司。小鼠抗 β-actin 單克隆抗體、小鼠抗 Flag 單克隆抗體和山羊抗小鼠IgG抗體購自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司。小鼠抗 ASFV-p30 單克隆抗體，小鼠抗 ASFV-p72 單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.3 篩選影響ASFV增殖的BRD4結(jié)構(gòu)域

分別構(gòu)建帶有 3x Flag 標(biāo)簽的 BRD4 全長、BD1/2 結(jié)構(gòu)域以及 BD1 截短體質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至 3D4/21 細(xì)胞，隨后將細(xì)胞置于 37 ℃ 含 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，用含 2% FBS的 RPMI 1640 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，感染 ASFV 24 hpi 后，收集細(xì)胞樣品進(jìn)行 Western blot 分析，以評(píng)估過表達(dá) BRD4 全長及截短體對(duì) ASFV 復(fù)制的影響。

1.4 引物設(shè)計(jì)和質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù) NCBI 數(shù)據(jù)庫中 Sus scrofa BRD4 基因序列（ID： 100533540），設(shè)計(jì)針對(duì) BRD4-BD1/2 結(jié)構(gòu)域的特異性引物，并插入限制性內(nèi)切酶 5′ EcoRⅠ和3′ BamHⅠ位點(diǎn)，擴(kuò)增目的片段，以慢病毒表達(dá)載體 pLVX-IRES-Puro 為載體，酶切載體與目的片段后，使用 T4 連接酶進(jìn)行連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化，涂板，測(cè)序鑒定正確后得到重組質(zhì)粒，命名為 pLVX-FLAG-BRD4-BD1/2。

1.5 重組慢病毒包裝和穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立

HEK-293T 細(xì)胞在生長狀態(tài)良好時(shí)鋪至 60 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度約 80% 時(shí)，按照 jet PRIME 的說明，將 pLVX- FLAG-BRD4-BD1/2 （3 μg）、pMD2.G （2 μg）、psPAX2 （1 μg） 共同轉(zhuǎn)染至 HEK-293T 細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后 48 h 后，收集細(xì)胞及上清培養(yǎng)液，以 3000 r·min-1 離心 10 min 后，將上清凍存于 -80 ℃。當(dāng) 3D4/21 細(xì)胞密度達(dá)到 30%～50% 時(shí)感染上述包裝好的慢病毒，感染 48 hpi 后使用 5 μg·mL-1 嘌呤霉素進(jìn)行篩選。將篩選得到的細(xì)胞稀釋后均勻接種于 96 孔板中，以確保平均每個(gè)孔只接種 1 個(gè)，以獲得單克隆細(xì)胞，繼續(xù)在含有 5 μg·mL-1 的嘌呤霉素培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.6 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的驗(yàn)證

采用 PCR 和 Western blot 方法對(duì)上述收集的細(xì)胞樣品中的 BRD4-BD1/2 表達(dá)情況進(jìn)行鑒定。PCR結(jié)果顯示，3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系在 2 000 bp 處出現(xiàn)與預(yù)期一致的目的條帶。

將上述細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng) 10 代后的細(xì)胞一部分加入 RIPA 裂解液和 5×loading Buffer，取 20 μL 蛋白上樣量進(jìn)行 SDS-PAGE，電泳結(jié)束后將蛋白用 90 V 恒壓轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜，用 TBST 配制的 5% 的脫脂奶粉溶液室溫封閉 2 h，隨后加入相應(yīng)小鼠抗Flag單克隆抗體4 ℃過夜孵育，用 TBST 洗 3 次后加入相應(yīng)的山羊抗小鼠IgG抗體，室溫孵育 1 h，最后用 ECL 化學(xué)發(fā)光底物全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析。

1.7 不同代次穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系細(xì)胞活性的測(cè)定

使用 CCK-8 檢測(cè)方法測(cè)定細(xì)胞活性，分別將篩選得到的生長狀態(tài)良好的 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞和陰性對(duì)照 3D4/21-WT 細(xì)胞均以每孔 104 個(gè)均勻接種至 96 孔板中。分別設(shè)置了不同的時(shí)間點(diǎn)（12、24、36、48 h）以及不同代次（F10、F20、F30）兩種細(xì)胞培養(yǎng)相同的時(shí)間，向板孔中加入 10 μL CCK-8 溶液，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做 3 次重復(fù)。將 96 孔板放在 37℃、5% CO2 條件下，避光孵育 2 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)量 450 nm 波長下各孔的 OD 值。

1.8 穩(wěn)定表達(dá) BRD4-BD1/2 細(xì)胞系對(duì) ASFV 增殖的影響

1.8.1 RT-qPCR 檢測(cè)病毒 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平

通過 Trizol 法提取細(xì)胞總 RNA，并反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，再以 cDNA 為模板進(jìn)行 Real-time qPCR，以豬的 GAPDH 基因作為內(nèi)參，檢測(cè)目的基因的轉(zhuǎn)錄水平。根據(jù) NCBI 數(shù)據(jù)庫 ASFV CP204L 基因序列 （GenBank： MK333184.1）， ASFV B646L 基因序列 （GenBank： MK333180.1），豬 GAPDH 基因序列（GenBank： NM 001206359.1）設(shè)計(jì)的引物序列如表1。

1.8.2 Western blot 檢測(cè)病毒蛋白表達(dá)情況

3D4/21-BRD4-BD1/2 和 3D4/21-WT 細(xì)胞接種于 12 孔板，分別以不同 MOI （0、0.1、1、2） 或不同感染時(shí)間 （12、24、36、48 hpi） 感染 ASFV CN/GS/2018，收集細(xì)胞樣品并使用 RIPA 裂解液裂解蛋白，4 ℃、12 000 r·min-1 離心 10 min 后收集上清液加入 5×loading buffer，金屬浴高溫變性后進(jìn)行 SDS-PAGE，電泳結(jié)束后 100 V，1 h 30 min 恒壓轉(zhuǎn)印至 NC 膜上。轉(zhuǎn)印完成后，使用含 5% 脫脂奶粉的 TBST 緩沖溶液將 NC 膜至室溫封閉 2 h 后，用 TBST 洗膜 5 次，每次 5 min；按照比例稀釋 αnti-Flag （1∶1 000），αnti-β-actin （1∶5 000），αnti-p30 （1∶1 000），αnti-p72 （1∶1 000） 抗體，4 ℃ 過夜孵育；TBST 洗膜 5 次，每次 5 min；加入 1∶10 000 稀釋的 HRP-conjugated Afinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L），Goat αnti-Mouse 二抗室溫孵育 2 h；TBST 洗膜 5 次；最后，使用 ECL 化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行成像和分析。

1.9 紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象（HAD50）測(cè)定

將 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞與 3D4/21-WT 細(xì)胞同時(shí)感染 ASFV （MOI=1） 36 hpi 后，收集上清，并于 -80 ℃ 進(jìn)行多次反復(fù)凍融。隨后 1 200 r·min-1離心 10 min，取 100 μL 病毒上清液進(jìn)行 10-1～10-8 倍梯度稀釋，然后接種到鋪滿 PAM 細(xì)胞的 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。每孔加入 25 μL 1% 的豬紅細(xì)胞，每個(gè)稀釋梯度設(shè)置 8 個(gè)重復(fù)，37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5～7 d，每天觀察細(xì)胞及玫瑰花環(huán)數(shù)。根據(jù) Reed-Muench 法計(jì)算病毒滴度。

1.10 不同代次 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系對(duì)ASFV復(fù)制的影響

為了研究不同代次細(xì)胞系對(duì)于 ASFV 復(fù)制的影響，分別將 3D4/21-BRD4-BD1/2 和 3D4/21-WT 在 37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至所需要的代次。分別選取了第 10、20、30 代細(xì)胞，將其接種到 12 孔板中，感染 ASFV CN/GS/2018。在感染后的特定時(shí)間點(diǎn)（12、24、36、48 hpi）收集細(xì)胞樣品，通過 Western blot 評(píng)估不同代次細(xì)胞系對(duì)于病毒復(fù)制的影響。

使用免疫熒光檢測(cè)不同代次（F10、F20、F30）穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的穩(wěn)定表達(dá)情況。使用熒光標(biāo)記的二抗檢測(cè) Flag-BRD4-BD1/2 的表達(dá)情況，并對(duì)不同代次細(xì)胞系進(jìn)行比較。

1.11 數(shù)據(jù)分析

使用 GraphPad Prism 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖形繪制，采用獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。ns.Pgt;0.05 說明數(shù)據(jù)間無顯著差異，*.P≤0.05 說明數(shù)據(jù)間有顯著差異，**. P ≤0.01 說明數(shù)據(jù)間有極顯著差異。***. P≤0.001 表明數(shù)據(jù)間差異具有極高的統(tǒng)計(jì)顯著性。****. P≤0.0001。

2 結(jié) 果

2.1 BRD4-BD1/2促進(jìn) ASFV 的復(fù)制

為了探究 BRD4 及其溴結(jié)構(gòu)域?qū)τ?ASFV 復(fù)"" 制的影響，分別構(gòu)建 BRD4、BD1/2 和 BD1 的截短體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后感染 ASFV，利用 Western blot 及 RT-qPCR 檢測(cè)其對(duì) ASFV 復(fù)制的影響。

結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染 BRD4-BD1/2 結(jié)構(gòu)域顯著提高了 ASFV B646L 基因及其編碼的 p72蛋白和 CP204L 基因及其編碼的 p30 蛋白表達(dá)水平。這一結(jié)果表明，BRD4的 BD1/2 結(jié)構(gòu)域在 ASFV 復(fù)制中發(fā)揮了明顯的促進(jìn)作用（圖1B～D）。

2.2 重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建

本研究以 pLVX-IRES-Puro 質(zhì)粒為骨架構(gòu)建了含有 Flag 標(biāo)簽的 BRD4-BD1/2 基因的重組質(zhì)粒。為了驗(yàn)證構(gòu)建的載體，進(jìn)行了 EcoRⅠ 和 BamHⅠ 限制性內(nèi)切酶的雙酶切試驗(yàn)。通過瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察到兩條明顯的 DNA 條帶。

其中一條約為 5 000 bp，對(duì)應(yīng)切割后的載體條帶，另一個(gè)約為 2 000 bp，與預(yù)期的 BRD4-BD1/2 的目的基因片段大小相符。結(jié)果表明慢病毒表達(dá)載體 pLVX-IRES-Puro-3x Flag- BRD4-BD1/2 構(gòu)建成功（圖 2）。

2.3 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系的鑒定

通過慢病毒包裝系統(tǒng)感染 3D4/21-WT 細(xì)胞后，觀察到細(xì)胞形態(tài)并未顯著改變，嘌呤霉素篩選后能夠正常傳代培養(yǎng)。通過篩選出的陽性克隆細(xì)胞連續(xù)傳代后，提取穩(wěn)定表達(dá) BRD4-BD1/2 基因的細(xì)胞系的總蛋白。通過 Western blot 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)傳代培養(yǎng)的 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系中 BRD4-BD1/2 基因能夠穩(wěn)定表達(dá)（圖 3）。

2.4 細(xì)胞活性檢測(cè)

使用 CCK-8 測(cè)定3D4/21-BRD4-BD1/2 和 3D4/21-WT 細(xì)胞的細(xì)胞活性。分別在不同時(shí)間點(diǎn)（12、24、36和48 h）以及不同代次的細(xì)胞（F10、F20、F30），通過測(cè)量 450 nm 波長下的 OD 值。結(jié)果顯示，各時(shí)間點(diǎn)及各代次細(xì)胞的兩種細(xì)胞系的細(xì)胞活性沒有顯著差異。盡管 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞經(jīng)過改造，但其細(xì)胞活性與 WT 細(xì)胞相比，細(xì)胞活性正常，無顯著差異（Pgt;0.05）（圖 4 A、B）。

2.5 BRD4-BD1/2 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系促進(jìn) ASFV 復(fù)制

為了比較分析 ASFV-EGFP 毒株在 3D4/21-BRD4-BD1/2 和 3D4/21-WT 細(xì)胞中的增殖能力，作者分別在這兩種細(xì)胞系中進(jìn)行了 ASFV-EGFP 的感染試驗(yàn)。兩種細(xì)胞系均在不同的病毒滴度（MOI 分別為0、0.1、1、2）下進(jìn)行了 ASFV-EGFP 感染。隨后在感染后 36 hpi 觀察熒光強(qiáng)度。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，病毒感染 24 hpi 時(shí) Western blot 結(jié)果并不能明顯檢測(cè)到 ASFV 主要結(jié)構(gòu)蛋白 p72 的表達(dá)，而在 36 hpi 時(shí)能夠明顯檢測(cè)到其表達(dá)，因此作者選擇 36 hpi 作為主要的試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)。

試驗(yàn)結(jié)果顯示在感染后 36 hpi，與 3D4/21-WT 相比，穩(wěn)定表達(dá) BRD4-BD1/2 細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，這表明 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系能夠促進(jìn) ASFV-EGFP 復(fù)制（圖 5）。

2.6 不同 MOI ASFV 感染 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系對(duì) ASFV 增殖的影響

為了分析不同 MOI （0、0.1、1、2） ASFV CN/GS/2018 在 3D4/21-BRD4-BD1/2和 3D4/21- WT 細(xì)胞中的復(fù)制能力，分別將兩種細(xì)胞接種到 12 孔板，待細(xì)胞密度長至 70%，分別以不同 MOI （0、0.1、1、2） 的 ASFV CN/GS/2018 毒株感染兩種細(xì)胞。感染后 36 hpi 收取樣品。

利用 RT-qPCR 檢測(cè) 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞中 ASFV 基因 CP204L、B646L/GAPDH表達(dá)量。結(jié)果顯示，3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞中 CP204L、B646L/GAPDH 表達(dá)量顯著高于 WT 細(xì)胞（Plt;0.01）（圖 6 C、D）。3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系與 WT 細(xì)胞相比均能促進(jìn) ASFV CP204L、B646L 基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。

同時(shí)，利用 Western blot 檢測(cè)病毒蛋白 p30、p72 的表達(dá)，結(jié)果顯示 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系中 p30、p72 蛋白表達(dá)量顯著高于 3D4/21-WT 細(xì)胞（圖 6 A）。綜上所述，3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞在不同 MOI ASFV 感染時(shí)現(xiàn)出明顯的促進(jìn)病毒復(fù)制的能力。

2.7 不同時(shí)間點(diǎn) ASFV 感染 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系對(duì) ASFV 增殖的影響

為了分析 3D4/21-BRD4-BD1/2 和 3D4/21-WT細(xì)胞在感染 ASFV CN/GS/2018 不同時(shí)間點(diǎn)之間的復(fù)制能力，將兩種細(xì)胞分別接種到 12 孔板，待細(xì)胞密度長至 70%，使用 ASFV CN/GS/2018 （MOI=1） 進(jìn)行感染，分別在感染后 12、24、36、48 hpi 收取樣品。

通過 Western blot 檢測(cè)病毒蛋白 p30、p72 的表達(dá)，結(jié)果顯示 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系中 p30、p72 蛋白表達(dá)量顯著高于 WT 細(xì)胞（圖 7 A、B）。利用 RT-qPCR 檢測(cè) 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞中 CP204L、B646L 和 GAPDH mRNA 表達(dá)水平。結(jié)果顯示，3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞中 CP204L、B646L / GAPDH mRNA 表達(dá)量顯著高于 WT 細(xì)胞（Plt;0.01）（圖 7 C、D）。穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系能促進(jìn) ASFV CP204L、B646L 基因的表達(dá)。

綜上所述，3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞在 ASFV 感染不同時(shí)間點(diǎn)的病毒復(fù)制能力強(qiáng)于 WT 細(xì)胞。

2.8 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞中 ASFV 滴度測(cè)定

為了深入分析 ASFV CN/GS/2018 在 3D4/21-BRD4-BD1/2 與 3D4/21-WT 細(xì)胞系中的增殖能力，作者通過觀察豬源紅細(xì)胞在感染 ASFV 的單核巨噬細(xì)胞周圍的吸附現(xiàn)象，采用 HAD50 測(cè)定方法對(duì)兩種細(xì)胞系中的病毒滴度進(jìn)行了量化。

如圖8，使用 HAD50 值計(jì)算，3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系中強(qiáng)毒株 ASFV CN/GS/2018 的病毒滴度分別為 6.5和6.7 lgHAD50·0.1 mL-1，這顯著高于3D4/21-WT細(xì)胞系中的病毒滴度（5.45和5.5 lgHAD50·0.1 mL-1）。這一結(jié)果表明，在3D4/21-BRD4-BD1/2細(xì)胞系中ASFV的增殖能力顯著高于3D4/21-WT細(xì)胞系 （Plt;0.05）。

2.9 不同代次 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系對(duì)于 ASFV 復(fù)制影響的評(píng)估

為了深入研究不同代次 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系對(duì)于 ASFV 復(fù)制的影響，作者分別選取了第 10、20、30 代 3D4/21-BRD4-BD1/2 以及相應(yīng)代次的 3D4/21-WT 細(xì)胞，將其接種到 12 孔板中并感染 ASFV CN/GS/2018。在感染后的特定時(shí)間點(diǎn)（12、24、36、48 hpi）收集相應(yīng)的細(xì)胞樣品，通過 Western blot 進(jìn)行對(duì)比分析。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在上述特定時(shí)間點(diǎn)（12、24、36、48 hpi），3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系在第 10、20、30代次相對(duì)于相應(yīng)代次的 3D4/21-WT 細(xì)胞，均能促進(jìn) ASFV 復(fù)制，而這種促進(jìn) ASFV 復(fù)制的能力并沒有降低或消失（圖 9A～D）。

同時(shí)利用免疫熒光檢測(cè)了不同代次（F10、F20、F30）穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的 BRD4-BD1/2表達(dá)情況，試驗(yàn)結(jié)果表明：不同代次的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系中 BRD4-BD1/2 均能穩(wěn)定表達(dá)（圖 9E）。

3 討 論

非洲豬瘟（African swine fever）因其死亡率高、傳染性強(qiáng)，對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成重大威脅，因此成為了獸醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。關(guān)于非洲豬瘟病毒（African swine fever vrius）的研究涵蓋了發(fā)病機(jī)制、免疫逃避機(jī)制和疫苗開發(fā)等方面。最近的研究表明，ASFV 可以感染多種商業(yè)化傳代細(xì)胞系，包括 MA-104、MARC-145 在內(nèi)的多種細(xì)胞系，這些細(xì)胞系被用來替代肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）來研究 ASFV 的復(fù)制動(dòng)力學(xué)［21］。同樣，3D4/21 細(xì)胞系也被用作感染 ASFV 的細(xì)胞系，以替代肺泡巨噬細(xì)胞（PAM），盡管其復(fù)制效率相對(duì)較低［22］。

本研究主要聚焦于表觀遺傳調(diào)節(jié)蛋白 BRD4 在 ASFV 感染中的作用，轉(zhuǎn)染 BRD4-BD1/2 能夠促進(jìn) ASFV 復(fù)制，作者推測(cè)可能與 BRD4 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)。BRD4 在 HSV 感染研究中也有類似的現(xiàn)象：轉(zhuǎn)染 BRD4 全長不能直接促進(jìn) HSV 感染，而轉(zhuǎn)染 BD1/2 能夠促進(jìn) HSV 感染，這種現(xiàn)象可能是由于 BD1/2 與 BRD4 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合乙酰賴氨酸［23］。相比之下，BRD4-BD1/2 的穩(wěn)定表達(dá)可能通過特定的相互作用或調(diào)控路徑直接促進(jìn) ASFV 復(fù)制，因此作者構(gòu)建了 BRD4-BD1/2 穩(wěn)定表達(dá) 3D4/21 細(xì)胞系，驗(yàn)證了其在 ASFV 復(fù)制中的關(guān)健作用。作者的研究擴(kuò)展了對(duì) BRD4 在病毒感染領(lǐng)域的了解，前期研究已經(jīng)證明 BRD4 在 HIV、HPV、HSV 等多種病毒感染中發(fā)揮重要作用［24-26］。然而，本研究的結(jié)果揭示了 BRD4 在 ASFV 復(fù)制中的作用，豐富了 BRD4 在免疫學(xué)和病毒學(xué)領(lǐng)域的潛在應(yīng)用。

此外，本研究中的一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是，盡管 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系在增殖活性上與3D4/21-WT 細(xì)胞無顯著差異，但其可以顯著促進(jìn) ASFV 復(fù)制。RT-qPCR 和 Western blot 的結(jié)果表明 ASFV B646L 基因編碼的 p72 蛋白和 CP204L 基因編碼的 p30 蛋白的表達(dá)量在 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞中顯著升高，這是衡量病毒在細(xì)胞中增殖的重要標(biāo)志，這提示 BRD4-BD1/2 可能在 ASFV 的生命周期中起到了促進(jìn)作用［27］。

此外，BRD4-BD1/2 對(duì) ASFV 復(fù)制的持續(xù)促進(jìn)作用表明，其穩(wěn)定表達(dá)可能在 ASFV 生命周期的特定階段起到關(guān)鍵影響，為 ASFV 的生物學(xué)特性提供了新的視角。HAD50 測(cè)定結(jié)果一步證實(shí)了在 3D4/21-BRD4-BD1/2 細(xì)胞系中，ASFV 的復(fù)制能力相較于 3D4/21-WT 細(xì)胞有了顯著提升，這強(qiáng)調(diào)了BRD4-BD1/2 在 ASFV 復(fù)制過程中的重要作用。

BRD4 在調(diào)控病毒感染反應(yīng)中的作用不僅限于 ASFV。Wang 等［16］的研究表明，抑制 BRD4 可通過 DNA 損傷依賴的方式激活 cGAS-STING 途徑，進(jìn)而激發(fā)廣泛的抗病毒天然免疫反應(yīng)，顯示出對(duì)多種 DNA 和 RNA 病毒的廣譜抗病毒活性。在呼吸道合胞病毒（RSV）的研究中，BRD4 抑制被發(fā)現(xiàn)可以改變病毒感染初期宿主免疫反應(yīng)中的蛋白質(zhì)相互作用復(fù)合體，有助于治療病毒性和過敏性肺?。?8］。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了 BRD4 在調(diào)節(jié)宿主對(duì)病毒感染反應(yīng)中的關(guān)鍵作用，為針對(duì) RSV 等 RNA 病毒開發(fā)基于 BRD4 抑制的治療方法提供了依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn) BRD4 與 HPV 中的 E2 蛋白相互作用，參與 HPV 生命周期的多個(gè)關(guān)鍵步驟，這為開發(fā)針對(duì) BRD4 的 HPV 治療策略提供了新的思路［29］。綜上所述，我們的研究以及相關(guān)文獻(xiàn)的支持，均強(qiáng)調(diào)了 BRD4 在病毒復(fù)制和宿主免疫調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵作用，表明針對(duì) BRD4 的策略可能成為一種有效的抗病毒治療方法，證明了將其作為潛在抗病毒靶標(biāo)的可能性。

綜上所述，本研究不僅成功構(gòu)建了 BRD4-BD1/2 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，驗(yàn)證了其在 ASFV 復(fù)制中的關(guān)鍵作用，還為 ASFV 感染機(jī)制的深入理解和疫苗開發(fā)提供了新的理論基礎(chǔ)，為今后的病毒感染治療和疫苗研發(fā)提供了新的思路。在未來的研究中，可以進(jìn)一步探索 BRD4 與 ASFV 復(fù)制機(jī)制之間的分子交互作用，以更全面地理解這一復(fù)雜的病毒感染過程。

4 結(jié) 論

本研究通過構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá) BRD4-BD1/2 基因的細(xì)胞系，證明了 BRD4-BD1/2 基因在促進(jìn) ASFV 復(fù)制中的關(guān)鍵作用。我們的研究不僅揭示了 BRD4 在 ASFV 感染和復(fù)制過程中的重要功能，也強(qiáng)調(diào)了其作為防治非洲豬瘟的潛在藥物靶標(biāo)的價(jià)值。此外，鑒于 ASFV 對(duì)全球豬業(yè)和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)構(gòu)成的嚴(yán)重威脅，該細(xì)胞系的建立為未來研究 ASFV 的感染機(jī)制及疫苗候選株的開發(fā)提供了生物材料，而且為探索新的防控策略提供了科學(xué)依據(jù)，為農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)和豬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了新的見解。通過深入分析 BRD4-BD1/2 在 ASFV 生命周期中的角色，未來的研究應(yīng)進(jìn)一步探索其具體的分子機(jī)制及其它潛在的生物標(biāo)記物，以促進(jìn)對(duì)疫苗和藥物開發(fā)的全面理解。

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（編輯 白永平）