摘 要： 旨在探究Ⅵ型分泌系統(tǒng)（Type Ⅵ secretion systems，T6SS）的毒力效應(yīng)蛋白Tae4酰胺酶對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）及產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌（Listeria monocytogenes，L. monocytogenes）的抑菌作用。將pET-28a-Tae4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（Escherichia coli BL21，E. coli BL21）進(jìn)行目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，優(yōu)化IPTG的誘導(dǎo)時間、濃度、溫度，最后純化后的Tae4蛋白通過瓊脂孔擴(kuò)散試驗、最小抑菌濃度測定、抗生素聯(lián)用抑菌試驗分別作用于S. aureus和 L. monocytogenes。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，本試驗中重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)最佳條件為：IPTG終濃度為0.5 mmol·L-1，16 ℃誘導(dǎo)16 h。重組蛋白大小約為21 ku，可溶性表達(dá)于培養(yǎng)上清中。瓊脂孔擴(kuò)散試驗結(jié)果顯示，Tae4蛋白濃度500 μg·mL-1時S. aureus菌株均出現(xiàn)13mm以上抑菌圈，效果與菌株血清型有關(guān)，L. monocytogenes菌株均出現(xiàn)18mm以上抑菌圈；最小抑菌濃度試驗結(jié)果顯示，Tae4蛋白對S. aureus的MIC約為 250 μg·mL-1，對L. monocytogenes的MIC約為125 μg·mL-1，點板法和微量肉湯稀釋法結(jié)果一致；抗生素聯(lián)用抑菌試驗結(jié)果顯示，Tae4蛋白與青霉素（penicillin，PG）聯(lián)合使用均比單獨使用的抑菌效果要好，且對 L. monocytogenes的抑菌效果優(yōu)于S. aureus。綜上，Tae4蛋白對金黃色葡萄球菌和產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌具有抑菌效果，與青霉素聯(lián)用抑菌效果得到了增強，為后續(xù)抗生素替代提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： Tae4；Ⅵ型分泌系統(tǒng)；金黃色葡萄球菌；產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌；抗生素替代

中圖分類號：S859.796

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4660-10

收稿日期：2023-11-24

基金項目：2022年國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（S202210364039；S202210364026）；2023年安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)省級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（X202310364040）

作者簡介：占樂楊（2003-），女，安徽屯溪人，本科生，主要從事禽致病性大腸桿菌研究，E-mail：13705593713@163.com；茍婧萱（2003-），女，青海城中人，本科生，主要從事禽致病性大腸桿菌研究，E-mail： 1492648151@qq.com。占樂楊和茍婧萱是同等貢獻(xiàn)作者

*通信作者：宋祥軍，主要從事禽致病性大腸桿菌研究，E-mail： sxj@ahau.edu.cn

Study on the Antibacterial Effect of T6SS Effector Protein Tae4 on S. aureus

and L. monocytogenes

ZHAN" Leyang， GOU "Jingxuan， ZHANG" Manqi， FU" Weixuan， LAN" Shouxin， TU" Jian， WANG" Zhenyu，

SHAO" Ying， SONG Xiangjun*

（College of Animal Science and Technoogy，Anhui Agricultural University， Hefei 230000， China）

Abstract：" The aim of this study was to investigate the antibacterial effect of Tae4 amidase， a virulent effector protein of Type VI secretion systems， on Staphylococcus aureus （S. aureus） and Listeria monocytogenes （L.monocytogenes）. The recombinant plasmid pET-28a-Tae4 was transformed into E. coli expression strain BL21 to induce expression， and the induction time， concentration and temperature of IPTG were optimized. Finally， the purified Tae4 protein was tested by Agar pore diffusion test， minimal inhibitory concentration test and antibacterial test combining with antibiotic on S. aureus and L. monocytogenes， respectively. SDS-PAGE results showed that the optimal expression conditions were as follows： the final concentration of IPTG was 0.5 mmol·L-1 at 16 ℃ for 16 h，the size of the recombinant protein was about 21 ku， and existed in the form of soluble supernatant. The results of Agar pore diffusion test showed that when the concentration of Tae4 protein was 500 μg·mL-1 ， S. aureus strains showed bacteriostatic zones above 13mm， and the effect was related to the serotype of strains， and L. monocytogenes strains showed bacteriostatic zones above 18 mm. Minimum inhibitory concentration test showed that MIC of Tae4 against S.aureus was about 250 μg·mL-1， MIC of Tae4 against L. monocytogenes was about 125 μg·mL-1， which were consistent with spot plate method and microbroth dilution method. The combination test showed that the bacteriostatic effect of Tae4 protein combined with penicillin was better than that of penicillin alone. Furthermore， the antibacterial effect of L. monocytogenes was better than that of S. aureus. In summary， Tae4 protein has bacteriostatic effect on S.aureus and L. monocytogenes， and the bacteriostatic effect combined with penicillin has been enhanced，which provides a theoretical basis for subsequent antibiotic substitution.

Key words： Tae4; type Ⅵ secretion system; S. aureus; Listeria monocytogenes; alternative to antibiotics

*Corresponding author：SONG Xiangjun，E-mail：sxj@ahau.edu.cn英文通信作者

金黃色葡萄球菌和產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌屬于革蘭陽性菌，是常見的人畜共患病原菌［1-2］。在抗生素減抗禁抗背景下，尋找有效的生物制品將減緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌在有限資源競爭中進(jìn)化出多種抗菌途徑，這些途徑通常針對保守的結(jié)構(gòu)，如細(xì)菌的細(xì)胞壁［3］。而相較于革蘭陰性菌，陽性菌的細(xì)胞壁肽聚糖層較厚且覆蓋在外層，缺乏外膜的保護(hù)易受到外界環(huán)境的影響甚至導(dǎo)致菌體死亡［4-5］。

T6SS是一種主要存在于革蘭陰性菌中的跨膜結(jié)構(gòu)，通過跨膜通道直接將效應(yīng)蛋白從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到靶細(xì)胞或胞外環(huán)境中［6］。T6SS除了與細(xì)菌的致病性有關(guān)外，還可以增強細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境的能力，參與細(xì)菌的種內(nèi)和種間競爭，這是因為T6SS分泌一些能夠抑制競爭菌的生長，甚至將其殺死的毒性蛋白［7，8］。2012年Russell等［9］發(fā)現(xiàn)了一類具有酰胺酶活性的效應(yīng)蛋白，并通過生信學(xué)分析分為4個超家族，命名為Tae1-4。研究表明這些效應(yīng)蛋白作用于肽聚糖的多肽部分，但因切割特異性而不同，其中Tae4裂解多肽鏈中c-D-谷氨?；?L-Meso-二氨基戊二酸酰胺鍵，即有望通過破壞細(xì)菌細(xì)胞壁以達(dá)到抑菌作用［9］。隨著革蘭陽性菌引起的感染率逐漸升高，獸用抗生素廣泛使用甚至濫用，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性不斷增強［10］。目前對于T6SS中的抗菌效應(yīng)蛋白著重在其蛋白結(jié)構(gòu)的探索，較少文獻(xiàn)報道其應(yīng)用于具體菌株中的抗菌能力。鑒于Tae4酰胺酶有抑菌活性，本研究擬通過原核表達(dá)載體pET-28a-Tae4表達(dá)及純化Tae4蛋白，通過體外抑菌試驗與青霉素聯(lián)用試驗來驗證該重組蛋白對兩種典型革蘭陽性菌是否有抑菌效果，為減少或替代抗生素在防治革蘭陽性菌感染中的使用提供科學(xué)依據(jù) 。

1 材料與方法

1.1 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

將由安徽通用生物有限公司合成的5 μL pET-28a-Tae4重組質(zhì)粒（Tae4基因根據(jù)鼠傷寒沙門菌LT2 NCBI Reference Sequence： NC_003197.2 設(shè)計）熱激法轉(zhuǎn)化至100 μL大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。放入37 ℃ 恒溫?fù)u床上180 r·min-1震蕩培養(yǎng)45 min。在5 000 r·min-1離心10 min后，丟棄多余的上清液，將約100 μL上清液留在EP管中用以重懸細(xì)菌，在超凈臺中將懸浮液均勻地涂覆在含濃度為100 μg·mL-1卡那霉素（kanamycin，Kana）的Luria-Bertani（LB）固體培養(yǎng)基上，并在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1.2 重組質(zhì)粒的篩選

挑取上述平板中表面光滑、邊緣平整的圓形菌落接種到 1 mL的含 Kana（100 μg·mL-1）的LB 液體培養(yǎng)基，溫度37℃震蕩培養(yǎng) 4～6 h，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的基因序列（NC_003197.2），設(shè)計Tae4基因的特異引物，上游引物Tae4-F：5′-AAGTTAATCATAGCGTTGCCGATGT-3′，下游引物Tae4-R：5′-CTCTGTTTCGGATTATTCAC-3′，取 1 μL 的菌液作為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）驗證，將PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1.2%的瓊脂糖核酸凝膠電泳，使用紫外照膠儀成像，觀察有無目的片段；將 PCR 結(jié)果為陽性的菌液送去上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，用snapgene軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3 重組蛋白的可溶性分析

將篩選出的陽性重組質(zhì)粒的菌液用 SanPrep 柱式質(zhì)粒 DNA 小量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到E. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞（轉(zhuǎn)化方法同“1.1”），將篩選出的含陽性質(zhì)粒的菌液37℃振蕩培養(yǎng)至OD600 nm =0.6誘導(dǎo)。設(shè)置16、37 ℃兩種溫度組進(jìn)行誘導(dǎo)，完成后收集菌體，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）重懸菌體沉淀，超聲裂解至液體清亮，離心后收集上清和沉淀進(jìn)行SDS -PAGE 電泳驗證。

1.4 重組蛋白Tae4的誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

不同蛋白的最優(yōu)表達(dá)條件不相同，通過優(yōu)化誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度和IPTG終濃度來摸索重組蛋白Tae4的最佳表達(dá)條件，將目的蛋白大量表達(dá)于上清液。試驗中，僅改變其中一個影響因素而保持其他影響因素不變，來分析各影響因素對重組蛋白表達(dá)的影響，主要包括IPTG的誘導(dǎo)時間和終濃度。設(shè)置誘導(dǎo)時間和溫度分別為37 ℃、5 h和16 ℃、16 h，設(shè)置IPTG誘導(dǎo)終濃度分別為0.25、0.5、1 mmol·L-1。誘導(dǎo)后收集菌體，離心清洗后收集上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳驗證。分析Tae4蛋白的表達(dá)量，確定IPTG最佳終濃度和誘導(dǎo)表達(dá)最佳時間。

1.5 重組蛋白Tae4的純化

Tae4和His-Tag以融合蛋白的形式表達(dá)，用His磁珠進(jìn)行純化。選擇最佳表達(dá)條件下的可溶性上清加入到預(yù)處理好的磁珠中，顛倒混勻放置在混合儀上，室溫孵育30 min 。將離心管置于磁分離器，待溶液變澄清后，用移液器移出上清液。向離心管中加入 2 倍懸浮液體積的 Wash Buffer（50 mmol·L-1 NaH2PO4，300 mmol·L-1 NaCl，20 mmol·L-1 imidazole，pH 8.0），使用槍頭反復(fù)吹打，將離心管置于磁分離器上，待溶液變澄清后，用移液器吸取上清液，重復(fù)步驟次數(shù)視洗雜情況而定，吸取的上清液保留備用以便檢測。將 3倍磁珠體積的 Elution Buffer（50 mmol·L-1 NaH2PO4，300 mmol·L-1 NaCl，250 mmol·L-1 imidazole，pH 8.0）加入到離心管中，使用移液器輕輕吹打 3～5 次，混勻，將離心管置于磁分離器上，待溶液變澄清后，用移液器吸取上清液，即為目的蛋白。純化后的蛋白采用SDS-PAGE電泳進(jìn)行純化驗證。

1.6 重組蛋白Tae4的抗菌譜測定

1.6.1 重組蛋白Tae4的瓊脂孔擴(kuò)散抑菌試驗

測定重組蛋白Tae4的蛋白濃度，并將其濃度調(diào)整至500 μg·mL-1，選取本實驗室分離保存的S. aureus（ATCC 25923）、S. aureus（ATCC 6538）、S. aureus（CMCC 26003）、S. aureus 77、L.monocytogenes 26 、L.monocytogenes 32 、L.monocytogenes 36培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用高溫滅菌的LB液體培養(yǎng)基將其稀釋至1×105 CFU·mL-1。配制10個20 mL濃度為1%的固體培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌20 min，取各稀釋菌液20 μL分別加入LB固體培養(yǎng)基中，混合后分別倒入滅菌的平皿中，凝固后用打孔器打孔（4孔·板-1），在相應(yīng)的孔中加入200 μL重組蛋白質(zhì)，并設(shè)立陰性對照組。將平板放在4℃冰箱中過夜，然后在37 ℃培養(yǎng)14～18 h，取出平板觀察抑菌圈，并測量抑菌圈直徑。一般認(rèn)為抑菌圈直徑小于10 mm為不敏感；10～14 mm為中等敏感；15～20 mm為高度敏感；大于20 mm為極敏感。

1.6.2 點板法測定重組蛋白的Tae4的最小抑菌濃度

調(diào)整重組蛋白濃度至500 μg·mL-1，將重組蛋白Tae4加入定量水解酪蛋白瓊脂（Mueller-Hinton Agar，MHA）中，制成濃度梯度的抗菌藥物平板：500、250、125、62.5、31.25 μg·mL-1。將配制好的藥物 MHA 平板放置4℃ 48 h后進(jìn)行試驗。選取本實驗室分離保存的S. aureus（ATCC 25923）、S. aureus（ATCC 6538）、S. aureus（CMCC 26003）、S. aureus 77、L. monocytogenes 26、L. monocytogenes 32、L. monocytogenes 36培養(yǎng)至對數(shù)生長后稀釋10倍倒入比色皿，用胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptone Soy Broth，TSB）校正濃度（即菌終濃度為1～2×108CFU·mL-1），將菌液梯度稀釋 101、102、103、104、105倍后，5 個稀釋倍數(shù)分別用移液槍吸取2μL接種到平板上，設(shè)置一組不加Tae4蛋白的平板做陽性對照。37 ℃孵育16h，觀察試驗結(jié)果。

1.6.3 微量肉湯稀釋法測定重組蛋白Tae4的最小抑菌濃度

將上述2 種病原菌接種至LB培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)至 OD600nm=1.0（即菌濃度約為 109 CFU·mL-1），然后用MH無菌肉湯以10倍梯度稀釋至終濃度約為 106 CFU·mL-1，充分混勻后待用。取無菌 96 孔板，所需孔均加入 100 μL 無菌肉湯培養(yǎng)基。第 3 列每孔加入 100 μL Tae4蛋白（500 μg·mL-1）用移液槍充分吹打（至少3次以上），從第3列吸100 μL 加到第 4 列吹打均勻，以此類推，直到第 8 列混勻后吸出 100 μL 棄掉，最后除第二列外每孔加入100 μL病原菌稀釋液，一列作為陰性對照（只含MH無菌肉湯和菌液）。37℃孵育每隔 2 h 測其 OD600 nm值，連續(xù)測10 h，記錄結(jié)果。

1.7 重組蛋白Tae4與PG聯(lián)合抑菌試驗

將青霉素鈉配制成8個梯度（分別為1 600、800、400、200、100、50、25、12.5 μg·mL-1），進(jìn)行瓊脂孔擴(kuò)散抑菌試驗來測定PG對2種病原菌大致的MIC范圍，試驗方法同“1.6.1”。選取實驗室保存的對PG耐藥的8株菌株分別是S. aureus（ATCC 6538）、S. aureus 76、S. aureus 92、S. aureus 93、 L. monocytogenes 36 培養(yǎng)至OD600 nm=1.0時（即菌濃度約為 109 CFU·mL-1），分別將8種病原菌十倍梯度稀釋3次（即菌終濃度約為 105～106 CFU·mL-1）充分混勻待用。將上述備好的每株菌液都分成4組，分別加入PBS、Tae4（125.0 μg·mL-1）、PG（200 μg·mL-1）、 Tae4（125.0 μg·mL-1）及PG（200 μg·mL-1）聯(lián)合使用，加入PBS的菌液組做陰性對照。常溫下作用30 min后放入37℃恒溫箱培養(yǎng)10 h，測其OD600nm值，記錄結(jié)果。

1.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（x-±sx-）”表示。采用 GraphPad Prism 8.0 軟件試驗結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，顯著性用 P 值表示，P＜0.05 代表差異顯著，本研究所有試驗均重復(fù) 3 次。*表示 Plt;0.05 即差異顯著，**表示 Plt;0.01 即差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的篩選

挑取生長良好的陽性菌落至含Kana的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，取1 μL菌液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，含重組質(zhì)粒的菌液經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定（圖1），發(fā)現(xiàn)在486 bp處特異性條帶，與預(yù)期目的條帶大小一致，表明重組質(zhì)粒篩選成功。

2.2 重組蛋白Tae4可溶性分析

將 pET-28a-Tae4重組菌株誘導(dǎo)后的菌液進(jìn)行超聲震碎，離心收集上清和沉淀進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳分析。結(jié)果如圖2所示，第1孔的重組菌株表達(dá)的蛋白在 21 ku處有明顯條帶，與預(yù)期蛋白大小一致。在37℃條件下上清處條帶較包涵體處條帶更淺，但在16℃下上清的條帶寬度及顏色深于包涵體條帶，說明Tae4蛋白表達(dá)產(chǎn)物在低溫時主要以可溶性上清的形式存在，因此選擇低溫誘導(dǎo)組進(jìn)行后續(xù)的試驗。

2.3 重組蛋白Tae誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

不同的誘導(dǎo)溫度、濃度、時間影響目的蛋白的表達(dá)。為了提高 Tae4融合蛋白的表達(dá)量，對誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，主要包括 IPTG 的終濃度和誘導(dǎo)表達(dá)時間，誘導(dǎo)后收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。觀察下圖發(fā)現(xiàn)Tae4在16 ℃、IPTG 濃度為0.5 mmol·L-1誘導(dǎo)16 h的條件下，表達(dá)量最佳（圖3）。

2.4 重組蛋白Tae4的純化

選擇重組質(zhì)粒最優(yōu)表達(dá)的上清進(jìn)行純化，SDS-PAGE 電泳分析純化效果。第1～7孔為重組蛋白Tae4破碎上清純化后洗脫7次的目的蛋白，在凝膠跑道上顯示與目的蛋白大小相符的單一條帶，無明顯雜帶，結(jié)果表示純化結(jié)果良好（圖4）。

2.5 重組蛋白Tae4對金黃色葡萄球菌的抑菌作用

2.5.1 重組蛋白Tae4單獨抑制試驗S. aureus試驗

瓊擴(kuò)試驗結(jié)果顯示，重組蛋白Tae4對所選試驗菌株均有抑菌效果，試驗組出現(xiàn)抑菌圈，而陰性對照組未出現(xiàn)抑菌圈。其中，Tae4蛋白抑制CMCC26003、ATCC25926、ATCC6538的平均抑菌圈直徑分別為13.8、22.3、20.0 mm，與CMCC26003組的抑菌圈直徑相比，ATCC25926、ATCC6538對Tae4蛋白有更高的敏感性。

點板法試驗結(jié)果顯示，當(dāng)Tae4添加濃度為31.25 μg·mL-1 時，3株菌的生長狀態(tài)較陽性對照有減弱現(xiàn)象。當(dāng)Tae4濃度為62.5 μg·mL-1 時，ATCC6538的生長受到明顯抑制，CMCC26003和ATCC25923基本無變化。當(dāng)添加的Tae4濃度為250 μg·mL-1 時，3株菌的生長均受到了明顯的抑制。

微量肉湯稀釋法結(jié)果顯示，重組蛋白Tae4為125 μg·mL-1時，S. aureus（ATCC25923）和S. aureus（ATCC6538）生長曲線平緩，低于125 μg·mL-1時生長曲線有向上趨勢，大致估計Tae4對S. aureus（ATCC25923）和S. aureus（ATCC6538）的MIC為125 μg·mL-1。同樣的方法估計Tae4對S. aureus（野生株77）和S. aureus（CMCC26003）的MIC為250" μg·mL-1（圖5）。

2.5.2 重組蛋白Tae4與PG聯(lián)合抑制S. aureus試驗" 聯(lián)用抑菌試驗結(jié)果顯示：與對照組相比，抑菌效果都有一定的提升，特別是對于野生株S. aureus 76和S. aureus 93有較大提升，抑菌效果明顯（圖6）。

2.6 重組蛋白Tae4對產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的抑菌效果

2.6.1 重組蛋白Tae4單獨抑制L.monocytogenes試驗

瓊擴(kuò)試驗結(jié)果顯示，重組蛋白Tae4對L.monocytogenes 26、L.monocytogenes 32、L.monocytogenes 36均有抑菌效果，試驗組出現(xiàn)抑菌圈，而陰性對照組未出現(xiàn)抑菌圈。其中，Tae4蛋白抑制L.m-26、L.m-32、L.m36的平均抑菌圈直徑分別為21.0、19.0、21.0 mm，三株菌均一致表現(xiàn)出較高的敏感性。

點板法試驗結(jié)果顯示，當(dāng)Tae4添加濃度為31.25 μg·mL-1 時，觀察平板，發(fā)現(xiàn)5個梯度的菌落生長狀態(tài)良好，與陽性對照組相差不大，3株菌的生長狀態(tài)良好。當(dāng)Tae4濃度為62.5 μg·mL-1 時，3株菌在稀釋到104倍時，發(fā)現(xiàn)菌株生長受到了明顯抑制，而當(dāng)添加的Tae4濃度到達(dá)125 μg·mL-1 時，3株菌的生長均受到了明顯的抑制，觀察平板發(fā)現(xiàn) 無肉眼可見的菌落。該濃度為后續(xù)試驗提供指導(dǎo)。

微量肉湯稀釋法結(jié)果顯示，4 h左右Tae4蛋白對細(xì)菌生長的影響逐漸增強，當(dāng)Tae4濃度為125 μg·mL-1時，細(xì)菌生長曲線較為平緩，Tae4濃度62.5 μg·mL-1時細(xì)菌生長曲線有向上趨勢?？梢耘袛嘀亟M蛋白Tae4對L.monocytogenes 26、L.monocytogenes 32、L.monocytogenes 36的MIC均約為125 μg·mL-1（圖7）。

2.6.2 重組蛋白Tae4與PG聯(lián)合抑制L. monocytogenes試驗

聯(lián)用抑菌試驗結(jié)果顯示：當(dāng)重組蛋白Tae4與PG聯(lián)合使用時，OD600nm值比單獨使用時下降，表明抑菌效果有一定的提升（圖8）。

3 討 論

革蘭陰性菌T6SS能夠分泌效應(yīng)因子，在種內(nèi)和種間競爭中發(fā)揮重要作用，Russell等人已經(jīng)鑒定出三種主要的效應(yīng)因子：酰胺酶［9］、磷脂酶［11］和肽聚糖水解酶［12］。而Tae家族是T6SS中近幾年新發(fā)現(xiàn)的一類具有酰胺酶活性的抗菌效應(yīng)因子，Benz團(tuán)隊［19］在研究鼠傷寒沙門菌T6SS的效應(yīng)蛋白時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Tae4輸出到大腸桿菌胞質(zhì)中不干擾細(xì)菌增殖，但定位于細(xì)菌周圍后細(xì)胞生長受到損害。后續(xù)發(fā)現(xiàn)Tae4蛋白能作用于細(xì)胞壁通過裂解c-D-谷氨?；?L-Meso-二氨基戊二酸酰胺鍵且特異性地水解鼠多肽的受體莖以降解肽聚糖，最終消滅細(xì)菌，有望其作為一種綠色安全的抗生素替代品應(yīng)用于臨床治療［13］。

由于包涵體中表達(dá)的蛋白沒有生物活性，且有研究表明通過異源表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白Tae4時，包涵體表達(dá)較多或與上清液持平，因此進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)與純化時應(yīng)摸索條件使Tae4表達(dá)于上清液［13］?？紤]到目的蛋白可溶性和表達(dá)量會受到誘導(dǎo)條件的影響，誘導(dǎo)劑IPTG會根據(jù)情況進(jìn)行濃度、溫度、時間的調(diào)整［14］。柴政斌等［15］發(fā)現(xiàn)在16 ℃時可溶重組蛋白明顯比37 ℃時比例高，在本試驗的Tae4蛋白可溶性分析中顯示表達(dá)產(chǎn)物在16℃時主要以可溶性上清液形式存在，而在37 ℃時包涵體大量表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn) IPTG濃度也起到了重要的作用，當(dāng)IPTG濃度較低時，會導(dǎo)致誘導(dǎo)效率的降低，但當(dāng)IPTG濃度過高時，也會引起蛋白濃度的下降，包涵體積累過大［16，17］。故設(shè)置了三個不同的IPTG濃度試驗組，發(fā)現(xiàn)終濃度為0.5mmol·L-1利于上清液的高效表達(dá)。經(jīng)過上述摸索，最終發(fā)現(xiàn)在16 ℃、IPTG 濃度為0.5 mmol·L-1誘導(dǎo)16 h的條件下，目的蛋白Tae4表達(dá)量最佳。此外，通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白時，載體標(biāo)簽蛋白的存在有利于重組蛋白的純化，故使用His標(biāo)簽純化蛋白［18］。

本試驗使用可溶性的上清表達(dá)來進(jìn)行抑菌效果測試，結(jié)果表明Tae4對所選試驗菌均有抑菌作用。瓊擴(kuò)試驗表示，Tae4蛋白對金葡菌受試菌種均有抑菌圈，其抑菌作用與菌株血清型有關(guān)；產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的抑菌效果優(yōu)于金葡菌，3株受試菌均有明顯的抑菌圈。點板法測定最小抑菌濃度試驗結(jié)果顯示金葡菌MIC為250 μg·mL-1，該結(jié)果與微量肉湯稀釋法接近，產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌來MIC為125 μg·mL-1，該結(jié)果也與微量肉湯稀釋法接近。Tae4效應(yīng)蛋白具有抑菌活性，這與Benz團(tuán)隊［19］所研究的結(jié)果相符。進(jìn)一步證實了革蘭陰性菌中T6SS效應(yīng)蛋白Tae4有抑制革蘭陽性菌的效果。

由于抗生素的濫用，有研究表明幾種常用于治療葡萄球菌感染的抗生素殺菌效果已不理想，可能是由于滲透性改變或作用環(huán)境改變［1］。張馨元等［20］發(fā)現(xiàn)抗菌肽和酰胺酶聯(lián)合應(yīng)用時，酰胺酶彌補了抗菌肽對較厚細(xì)胞壁無穿透力的缺陷，對治療糞腸球菌感染有提升效果。青霉素作為β-內(nèi)酰胺類抗生素，其β-內(nèi)酰胺環(huán)中的羧基和細(xì)菌相應(yīng) PBPs 結(jié)合，使細(xì)胞壁中的肽聚糖無法交聯(lián)，網(wǎng)狀細(xì)胞壁無法形成，同時Tae家族有切割短肽鏈破壞肽聚糖層結(jié)構(gòu)使靶細(xì)胞細(xì)胞壁破裂的抗菌效應(yīng)，因此本研究試探究Tae4蛋白和青霉素聯(lián)合作用是否可以對這兩種菌產(chǎn)生協(xié)同作用以有效增強殺菌效果，從而降低抗生素用量減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生［21-22］。首先用瓊脂擴(kuò)散法大致測出PG對兩種菌的最小抑菌濃度，后續(xù)選用對PG耐藥的八株菌株進(jìn)行試驗，從結(jié)果來看聯(lián)合使用Tae4和PG比單獨使用產(chǎn)生了更好的效果，且從結(jié)果上看產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌組比金葡組抑菌效果要好，綜上所述，兩種菌均一致表現(xiàn)出Tae4蛋白與PG的聯(lián)合使用具有協(xié)同抑菌作用。

本研究表明利用大腸桿菌表達(dá)菌株BL21在低溫條件下誘導(dǎo)表達(dá)獲得了可溶性重組蛋白Tae4，體外抑菌試驗表明Tae4重組蛋白對所選的兩種革蘭陽性菌均有抑菌作用，聯(lián)合青霉素使用時抑菌效果得到不同程度的提升。本研究為后續(xù)利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)來研發(fā)Tae4蛋白類抗生素替代物提供理論依據(jù)，為動物性食品安全和人類健康展現(xiàn)廣闊的前景。

4 結(jié) 論

本研究完成了重組蛋白Tae4的上清表達(dá)與純化，發(fā)現(xiàn)在16℃、IPTG 濃度為0.5 mmol·L-1誘導(dǎo)16 h的條件下，蛋白表達(dá)量最佳。經(jīng)抑菌試驗表明其對金黃色葡萄球菌和產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌均具有抗菌作用，和PG聯(lián)用時具有協(xié)同抗菌作用，且對產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的抑菌效果優(yōu)于金黃色葡萄球菌。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ 韓塔拉， 王俊瑞. 金黃色葡萄球菌異質(zhì)性耐藥機制及實驗室檢測技術(shù)［J］. 中國感染控制雜志， 2022， 21（12）：1249-1256.

HAN T L， WANG J R. Mechanisms and laboratory detection technologies of heteroresistance in Staphylococcus aureus［J］. Chinese Journal of Infection Control， 2022， 21（12）：1249-1256. （in Chinese）

［2］ 張 旭. 單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）分型及檢測新方法探究［D］. 廣州：華南理工大學(xué)， 2021.

ZHANG X. Research on new methods for typing and detection of Listeria monocytogenes［D］. Guangzhou：South China University of Technology， 2021. （in Chinese）

［3］ VOLLMER W， BERTSCHE U. Murein （peptidoglycan） structure， architecture and biosynthesis in Escherichia coli［J］. Biochim Biophys Acta （BBA）-Biomembr， 2008， 1778（9）：1714-1734.

［4］ 王增航， 董 濤. 霍亂弧菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)的效應(yīng)蛋白對細(xì)菌細(xì)胞壁的降解機制［J］. 微生物學(xué)通報， 2021， 48（1）：135-144.

WANG Z H， DONG T. Bacterial cell wall degradation by type Ⅵ secretion system effector proteins in Vibrio cholerae［J］. Microbiology China， 2021， 48（1）：135-144. （in Chinese）

［5］ TONG G， PAN Y， DONG H， et al. Structure and dynamics of pentaglycyl bridges in the cell walls of Staphylococcus aureus by13C-15N REDOR NMR［J］. Biochemistry， 1997， 36（32）：9859-9866.

［6］ BOYER F， FICHANT G， BERTHOD J， et al. Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome wide in silico analysis： what can be learned from available microbial genomic resources？［J］. BMC Genomics， 2009， 10（1）：104.

［7］ HOFER U. T6SS： shoot and scrub［J］. Nat Rev Microbiol， 2020， 18（8）：412-413.

［8］ SANA T G， BERNI B， BLEVES S. The T6SSs of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 and their effectors： beyond bacterial-cell targeting［J］. Front Cell Infect Microbiol， 2016， 6：61.

［9］ RUSSELL A B， SINGH P， BRITTNACHER M， et al. A widespread bacterial type VI secretion effector superfamily identified using a heuristic approach［J］. Cell Host Microbe， 2012， 11（5）：538-549.

［10］ NAYLOR N R， SILVA S， KULASABANATHAN K， et al. Methods for estimating the burden of antimicrobial resistance：a systematic literature review protocol［J］. Syst Rev， 2016， 5（1）：187.

［11］ RUSSELL A B， LEROUX M， HATHAZI K， et al. Diverse type VI secretion phospholipases are functionally plastic antibacterial effectors［J］. Nature， 2013， 496（7446）：508-512.

［12］ WHITNEY J C， CHOU S， RUSSELL A B， et al. Identification， structure， and function of a novel type vi secretion peptidoglycan glycoside hydrolase effector-immunity pair［J］. J Biol Chem， 2013， 288（37）：26616-26624.

［13］ LU D F， ZHENG Y S， LIAO N S， et al. The structural basis of the Tle4-Tli4 complex reveals the self-protection mechanism of H2-T6SS in Pseudomonas aeruginosa［J］. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr， 2014， 70（Pt 12）：3233-3243.

［14］ MATSUMOTO T， TAKAHASHI S， UEDA M， et al. Preparation of high activity yeast whole cell bioctalysts by optimization of intracellular production of recombinant Rhizopus oryzae lipase［J］. J Mol Catal B Enzym， 2002， 17（3/5）：143-149.

［15］ 柴政斌， 張更林， 王學(xué)政， 等. 融合蛋白GST-PADI4可溶性表達(dá)條件的優(yōu)化及純化［J］. 中國生物制品學(xué)雜志， 2014， 27（3）：404-408， 411.

CHAI Z B， ZHANG G L， WANG X Z， et al. Optimization of condition for soluble expression of GST-PADI4 fusion protein and purification of expressed product［J］. Chinese Journal of Biologicals， 2014， 27（3）：404-408， 411. （in Chinese）

［16］ RAMíREZ O T， ZAMORA R， ESPINOSA G， et al. Kinetic study of penicillin acylase production by recombinant E." coli in batch cultures［J］. Process Biochem， 1994， 29（3）：197-206.

［17］ PENNA T C V， ISHII M， DE SOUZA L C， et al. Expression of green fluorescent protein （GFPuv） in Escherichia coli DH5-a， under different growth conditions［J］. Afr J Biotechnol， 2004， 3（1）：105-111.

［18］ 狄志欣. 人胰島素原基因的克隆以及在大腸桿菌中的高效表達(dá)、質(zhì)譜鑒定［D］. 蘭州：蘭州理工大學(xué)， 2015.

DI Z X. Gene cloning， prokaryotic expression， purification and MS identification of human proinsulin［D］. Lanzhou：Lanzhou University of Technology， 2015. （in Chinese）

［19］ BENZ J， REINSTEIN J， MEINHART A. Structural Insights into the Effector-Immunity System Tae4/Tai4 from Salmonella typhimurium［J］. PLoS One， 2013， 8（6）：e67362.

［20］ 張馨元. 抗菌肽LL-37與酰胺酶聯(lián)合應(yīng)用治療糞腸球菌感染的研究［D］. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2021.

ZHANG X Y. The effect of the combined use of antimicrobial peptide LL-37 and amidase on Enterococcus faecalis［D］. Hohhot：Inner Mongolia Agricultural University， 2021. （in Chinese）

［21］ SPRATT B G. Distinct penicillin binding proteins involved in the division， elongation， and shape of Escherichia coli K12［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 1975， 72（8）：2999-3003.

［22］ WISE E M Jr， PARK J T. Penicillin：its basic site of action as an inhibitor of a peptide cross-linking reaction in cell wall mucopeptide synthesis［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 1965， 54（1）：75-81.

（編輯 白永平）