摘 要： 本研究旨在闡明白屈菜紅堿（chelerythrine，CHE）抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）活性及探究其抗菌機(jī)制。通過(guò)測(cè)定最小抑菌濃度及最小殺菌濃度分析CHE對(duì)MRSA的抗菌活性；檢測(cè)CHE對(duì)MRSA細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的完整性、通透性，結(jié)合電鏡觀察MRSA細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)，從而對(duì)CHE抗菌機(jī)制進(jìn)行初步分析；檢測(cè)CHE對(duì)MRSA菌株活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平與ROS相關(guān)因子造成的影響，并結(jié)合熒光定量及轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證CHE抗菌機(jī)制。結(jié)果表明，CHE對(duì)MRSA的最小抑菌濃度為6.25 μg·mL-1，最小殺菌濃度為12.5 μg·mL-1。CHE可通過(guò)破壞MRSA菌株細(xì)胞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜，發(fā)揮抗菌作用。且CHE處理后可抑制MRSA呼吸鏈SdhABC等基因表達(dá)，從而阻斷呼吸鏈電子傳遞，使ROS水平升高從而發(fā)揮抗菌作用。綜上，本研究對(duì)CHE抗MRSA的抗菌機(jī)制進(jìn)行探究，為臨床防治MRSA感染提供新參考。

關(guān)鍵詞： 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；白屈菜紅堿；抗菌機(jī)制；氧化應(yīng)激

中圖分類號(hào)： S853.74

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）10-4670-09

收稿日期：2023-12-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31802226）；黑龍江省自然科學(xué)基金聯(lián)合引導(dǎo)項(xiàng)目（LH2022C072）；黑龍江省牛病防制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（PCBD201710）

作者簡(jiǎn)介：苑慶欣（2000-），男，黑龍江青岡人，碩士生，主要從事動(dòng)物性/食源性致病菌防控研究，E-mail：yuanqingxin_2000@126.com

*通信作者：宋 軍，主要從事人獸共患細(xì)菌性疾病防控研究，E-mail：songjun_2005@126.com；周志新，主要從事中藥抗菌機(jī)制及噬菌體抗菌研究，E-mail：Z2855877761@126.com

The Mechanism of Chelerythrine against Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

YUAN" Qingxin1， LIU" Kuo1， BAO" Xuhua1， GAO" Dongyang1， LI" He1， SONG" Jun1*， ZHOU" Zhixin

2*

（1.Key Laboratory of Bovine Disease Control in Northeast China of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， College of Animal Science and Veterinary Medicine， Heilongjiang Bayi Agricultural University，

Daqing 163319，" China;

2.Department of Animal Science and Technology， Heilongjiang Agricultural

Economy Vocational College， Mudanjiang 157041，" China）

Abstract：" The objective of this study was to investigate the antibacterial effect of chelerythrine （CHE） against methicillin-resistant Staphylococcus aureus （MRSA） and approach its mechanism. The antibacterial activity of CHE against MRSA was determined by minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC）. After treatment with CHE， the cell membrane and permeability of MRSA were assessed， and the morphology and ultrastructure of MRSA cells were observed by electron microscopy to preliminarily analyze the antibacterial mechanism of CHE. Additionally， the effect of CHE on reactive oxygen species （ROS） levels and ROS-related factors in MRSA strains was detected， combined with fluorescence quantification and transcriptomics to further explore the antibacterial mechanism of CHE. The results showed that the MIC of CHE against MRSA was 6.25 μg·mL-1， MBC is 12.5 μg·mL-1， and CHE can destroy cell membrane integrity and permeability to achieve antibacterial effect. CHE may block the electronic transmission of respiratory chain and promote ROS production by inhibiting the expression of gene SdhABC and other genes to exert activity against MRSA. In conclusion， this study explored the antibacterial mechanism of CHE against MRSA， which provided a new reference for clinical prevention of MRSA infection.

Key words： MRSA; chelerythrine; antibacterial effect; oxidative stress

*Corresponding authors：" SONG Jun， E-mail： songjun_2005@126.com; ZHOU Zhixin， E-mail： Z2855877761@126.com

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus， MRSA）是一種高度多重耐藥的人獸共患病原體［1］，可引起人類及動(dòng)物多種疾病，如淺表皮膚和軟組織感染、奶牛乳房炎、骨髓炎、壞死性肺炎、敗血癥等［1-4］。WHO已將其列為急需開(kāi)發(fā)新型抗生素的超級(jí)細(xì)菌之一，而新型抗生素研發(fā)需要耗費(fèi)巨大的人力、物力以及時(shí)間［5］，因此當(dāng)前迫切需要新型的治療策略。

中藥是我國(guó)的寶貴資源，在治療感染性疾病方面有著悠久的歷史［6］，其作用靶點(diǎn)多、抗菌譜廣，細(xì)菌較少對(duì)其產(chǎn)生耐藥，對(duì)于抗菌有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，目前，已被廣泛應(yīng)用于減抗替抗領(lǐng)域［7］。白屈菜紅堿（chelerythrine， CHE）是一種存在于蕓香科、罌粟科等植物中的天然藥用植物活性成分。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，CHE具有抗菌、抗真菌、抗腫瘤等多種作用［8-11］。前期研究表明，CHE對(duì)金黃色葡萄球菌［12］、路鄧葡萄球菌［13］、變形鏈球菌［14］、大腸桿菌、嗜水氣單胞菌［15］及鮑曼不動(dòng)桿菌［10］等均有良好的抗菌活性。因此，CHE有潛力成為一種防治多重耐藥菌引起感染的天然、安全、高效的抗生素替代物。目前，雖有研究表明，CHE具有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)等能力［16］，但其抗菌作用機(jī)制的研究卻十分有限。本試驗(yàn)以MRSA為研究對(duì)象，深入研究CHE對(duì)MRSA的抗菌作用，著重研究CHE對(duì)其抗菌機(jī)制；并以ROS的生成為切入點(diǎn)，預(yù)測(cè)CHE潛在作用靶點(diǎn)并對(duì)其相關(guān)因子進(jìn)行化學(xué)和RT-PCR驗(yàn)證；以轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法進(jìn)一步分析CHE對(duì)MRSA的作用靶點(diǎn)，為應(yīng)用CHE防治人及動(dòng)物MRSA感染奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

Staphylococcus aureus ATCC 43300購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心，CHE購(gòu)自成都埃法公司，萬(wàn)古霉素、二甲基亞砜、β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司，ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自青島海博公司，N-苯基-1-萘胺購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根公司。Infinite 200 PRO熒光酶標(biāo)儀購(gòu)自Tecan Trading AG公司，iMark多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 CHE對(duì)MRSA最小抑/殺菌濃度測(cè)定

最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration， MIC）以微量稀釋法進(jìn)行測(cè)定［17］。CHE以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑，配制成4000 μg·mL-1備用。將CHE倍比稀釋，每孔100 μL加至96孔微量培養(yǎng)板中，同時(shí)加入等量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液（105 CFU·mL-1），37℃培養(yǎng)24 h。沒(méi)有肉眼可見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度為MIC。最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration， MBC）是指分別吸取MIC以上各孔培養(yǎng)物100 μL接種至LB固體培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)12 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，少于5個(gè)菌落的CHE濃度即為MBC。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)平行。

1.2.2 CHE對(duì)MRSA的影響

參考課題組前期改良試驗(yàn)方法［17］及操慶國(guó)等［18］方法檢測(cè)CHE對(duì)MRSA細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的影響。

以30 μg·mL-1鹽酸萬(wàn)古霉素處理的菌液作為陽(yáng)性對(duì)照，未處理菌液作為陰性對(duì)照。將1×106 CFU·mL-1對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液與NPN（10 μmol·L-1）在5 mmol·L-1 HEPES緩沖液（pH 7.4，含5 mmol·L-1葡萄糖）中孵育30 min，記錄背景熒光。將等體積菌液與不同濃度CHE溶液混勻，置于96孔黑色熒光酶標(biāo)板，隨時(shí)間記錄熒光，直到熒光強(qiáng)度穩(wěn)定。多功能酶標(biāo)儀記錄熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)420 nm）。每項(xiàng)試驗(yàn)均獨(dú)立進(jìn)行，設(shè)立3個(gè)生物重復(fù)。

將1×106 CFU·mL-1對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液接種至含不同終濃度（1×MIC和2×MIC）的CHE液體培養(yǎng)基中，用PBS代替CHE藥液作為對(duì)照組，37℃，160 r·min-1培養(yǎng)。每60 min各取1.0 mL，用0.22 μm無(wú)菌濾器過(guò)濾，取濾液參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定β-半乳糖苷酶活性。

1.2.3 CHE對(duì)MRSA細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

將1×106 CFU·mL-1對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液與CHE（終濃度1×MIC）混合，37℃作用6 h。參照課題組先前方法處理掃描電鏡和透射電鏡樣品［19］，采用掃描電子顯微鏡（Hitachi S-4800）和透射電子顯微鏡（JEM-2100 Plus）觀察。

1.2.4 ROS檢測(cè)

使用活性氧檢測(cè)試劑盒（碧云天）測(cè)定CHE（終濃度1×MIC）作用MRSA前后ROS的水平。將1×106 CFU·mL-1對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液和10 μmol·L-1 DCFH-DA于37 ℃孵育15 min。使用PBS洗去胞外探針并重懸菌體。將裝載探針的菌液分別與l×MIC和2×MIC的CHE于96孔黑色熒光酶標(biāo)板中混勻，37 ℃條件下，每隔10 min，利用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定熒光強(qiáng)度，（激發(fā)波長(zhǎng)622 nm，發(fā)射波長(zhǎng)670 nm）每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 CHE對(duì)ROS相關(guān)因子的影響

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液與CHE（終濃度1×MIC）混合避光37℃孵育4 h。4℃，4 500 g離心10 min，收集菌體，加入500 μL PBS懸浮后冰浴超聲破碎菌體，4 000 g離心10 min保留上清。使用考馬斯亮藍(lán)法確定樣本蛋白濃度，再根據(jù)琥珀酸脫氫酶（SDH）測(cè)試盒、過(guò)氧化氫酶（CAT）測(cè)試盒、總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)試盒、丙二醛（MDA）測(cè)試盒配制工作液，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定計(jì)算各物質(zhì)活性。

1.2.6 熒光實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）驗(yàn)證

細(xì)菌過(guò)夜活化，1∶100的比例轉(zhuǎn)接到含有CHE（終濃度1×MIC）的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，選取預(yù)測(cè)靶點(diǎn)差異表達(dá)基因及16S rRNA 內(nèi)參基因，利用Primer 5設(shè)計(jì)引物，基因表達(dá)差異變化用差異倍數(shù)表示［20］，引物序列見(jiàn)表1。目的基因相對(duì)表達(dá)量差異倍數(shù)評(píng)估采用ΔΔCt與對(duì)照組的ΔCt之間的比值展示。反應(yīng)體系（20 μL）：2×預(yù)混SYBR Green Taq Master 10.0 μL，正、反向引物各0.4 μL（5 μmol·L-1），cDNA 1 μL，ddH2O 8.2 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸 20 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.7 轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)測(cè)序及分析

送上海派森諾生物科技有限公司協(xié)作完成。具體操作：將對(duì)數(shù)期菌液接種于預(yù)先加入CHE（終濃度1×MIC）的RNase-free離心管中，將二者于37℃孵育4 h，提取樣品總RNA，應(yīng)用Nanodrop測(cè)定RNA 濃度、純度及使用Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer檢測(cè)樣品RNA的質(zhì)量。質(zhì)控后總RNA樣本去除核糖體RNA，將RNA片段化，反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA構(gòu)建富集文庫(kù)。之后利用IlluminaNextSeqTM 500測(cè)序樣品。對(duì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序結(jié)果采用topGO進(jìn)行GO富集分析，將各個(gè)基因富集到相關(guān)分子功能、進(jìn)程、結(jié)構(gòu)等條目并對(duì)每個(gè)功能下的基因數(shù)目進(jìn)行計(jì)算，找出差異基因顯著條目，確定CHE對(duì)MRSA差異基因影響的主要生物學(xué)功能。同時(shí)利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，將差異表達(dá)基因比對(duì)至調(diào)控通路或行使的功能分類。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)使用Graph Pad Prism 8.0軟件分析，試驗(yàn)結(jié)果以“x-±s”表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)，差異性檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為Plt;0.05（*）差異顯著，Plt;0.01（**）差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 CHE對(duì)MRSA菌株的最小抑/殺菌濃度

通過(guò)測(cè)定CHE對(duì)MRSA的抗菌活性，表明CHE對(duì)MRSA的MIC為6.25 μg·mL-1，MBC為12.5 μg·mL-1。

2.2 CHE對(duì)MRSA的影響

細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)改變或破壞時(shí)，熒光探針NPN可進(jìn)入疏水環(huán)境并釋放熒光，為了解CHE對(duì)MRSA菌株細(xì)胞壁的影響，檢測(cè)了不同濃度CHE對(duì)MRSA處理后NPN熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖1 A所示。CHE（1×MIC和2×MIC）處理組熒光強(qiáng)度極顯著升高，熒光強(qiáng)度在作用后的3 min內(nèi)顯著上升，與萬(wàn)古霉素相比，CHE對(duì)MRSA菌株細(xì)胞壁通透性具有影響。CHE對(duì)MRSA菌株細(xì)胞膜的影響如圖1 B所示。β-半乳糖苷酶試驗(yàn)中，對(duì)照組胞外β-半乳糖苷酶活性變化差異不顯著，而CHE（1×MIC和2×MIC）處理組胞外β-半乳糖苷酶活性在1 h內(nèi)急劇上升的同時(shí)，酶活性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)仍維持在恒定水平。

2.3 CHE對(duì)MRSA菌株細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響

通過(guò)SEM和TEM直接觀察MRSA外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化，觀察結(jié)果如圖2所示。對(duì)照組A、D中，MRSA形態(tài)規(guī)則，成簇生長(zhǎng)。CHE（1×MIC）處理組B、E中，MRSA大部分表面發(fā)生皺縮，團(tuán)簇連接斷裂。CHE（2×MIC）處理組C、F大部分細(xì)胞崩解破碎，細(xì)胞褶皺殘缺。TEM觀察結(jié)果顯示，對(duì)照組MRSA細(xì)胞完整，胞質(zhì)電子密度均勻。CHE（1×MIC）處理的細(xì)胞，胞質(zhì)空泡化、胞漿與細(xì)胞壁分離、細(xì)胞皺縮、電子密度降低。CHE（2×MIC）處理的細(xì)胞褶皺，細(xì)胞壁破裂，內(nèi)容物滲出。綜上表明，CHE能夠破壞MRSA內(nèi)部及外部形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2.4 CHE對(duì)MRSA菌株ROS的影響

如圖3所示，CHE對(duì)MRSA產(chǎn)生的ROS具有濃度依賴性作用。在濃度為1×MIC時(shí)ROS含量是空白對(duì)照組的6.10倍。在濃度為2×MIC時(shí)，熒光強(qiáng)度比空白對(duì)照組增加了10.53倍。在濃度為4×MIC時(shí)，熒光強(qiáng)度比空白對(duì)照組增加了19.15倍。同時(shí)在ROS檢測(cè)的1 h內(nèi)添加CHE 10 min后，細(xì)菌細(xì)胞 ROS繼續(xù)快速升高。總之，和對(duì)照組（CHE未處理組）相比，CHE處理后使MRSA菌株細(xì)胞出現(xiàn)大量ROS。

2.5 CHE對(duì)MRSA菌株ROS抗菌相關(guān)因子活性影響

如圖4所示，CHE能顯著性降低MRSA菌株SDH、CAT、T-AOC活性，并能夠顯著升高M(jìn)DA含量，且這種效應(yīng)呈劑量依賴性。

2.6 CHE對(duì)ROS預(yù)測(cè)抗菌靶點(diǎn)RT-PCR驗(yàn)證

試驗(yàn)選取與氧化磷酸化相關(guān)的2個(gè)基因SdhA、C進(jìn)行RT-PCR檢驗(yàn)，從而驗(yàn)證CHE作用后，MRSA氧化磷酸化及呼吸鏈基因是否出現(xiàn)顯著變化，表2結(jié)果表明，氧化磷酸化相關(guān)SdhA、C基因顯著下調(diào)。

2.7 CHE抗MRSA分子機(jī)制

CHE處理組（CHE）和對(duì)照組（MRSA）比較，共有1 102個(gè)基因表達(dá)出現(xiàn)顯著差異，其中，有609個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，493個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。用GO分析富集差異表達(dá)基因功能，并對(duì)基因條目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。GO富集分析顯示，差異基因參與的主要生物過(guò)程包括酰胺生物合成，肽生物合成，肽代謝，翻譯，三磷酸核苷酸合成及含氮化合物轉(zhuǎn)運(yùn)等；影響的細(xì)胞成分主要為核糖體；參與的分子功能主要包括核糖體結(jié)構(gòu)成分，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性，rRNA結(jié)合，RNA聚合酶活性及質(zhì)子通道活性等。

將差異基因進(jìn)行KEGG通路分析，分析基因主要參與到的代謝通路和結(jié)構(gòu)功能的執(zhí)行。KEGG注釋顯示差異表達(dá)基因共參與108條通路，其中，差異最顯著的前20條通路見(jiàn)表3、圖5。富集后的結(jié)果顯示，差異基因主要影響細(xì)胞的DNA合成及修復(fù)、RNA的合成、蛋白合成、細(xì)胞進(jìn)程、物質(zhì)代謝，能量代謝以及耐藥性相關(guān)通路。對(duì)蛋白質(zhì)合成的影響主要表現(xiàn)在DNA解旋酶、引物酶、DNA聚合酶等相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，RNA聚合酶合成基因表達(dá)下調(diào)，核糖體蛋白基因表達(dá)下調(diào)，物質(zhì)代謝，能量代謝及耐藥基因等顯著變化。能量代謝相關(guān)基因中，氧化磷酸化相關(guān)基因SdhABC基因及細(xì)胞色素bd基因表達(dá)顯著下調(diào)，這與RT-PCR結(jié)果相互驗(yàn)證，表明CHE可能是通過(guò)抑制SdhABC及細(xì)胞色素氧化酶bd基因的表達(dá)，破壞MRSA菌株氧化磷酸過(guò)程，使機(jī)體ROS水平升高并大量積累，從而發(fā)揮抗菌作用。

3 討 論

前期研究表明，CHE具有良好的生物安全性，具有臨床應(yīng)用治療MRSA感染的潛力［21］。本研究測(cè)定CHE對(duì)MRSA的MIC和MBC分別為6.25和12.5 μg·mL-1，表明CHE對(duì)于MRSA菌株具有良好的抗菌活性。細(xì)胞壁與細(xì)胞膜作為保護(hù)細(xì)菌的屏障，是許多抗菌物質(zhì)作用靶點(diǎn)之一。不同抗菌物質(zhì)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的機(jī)制各不相同，包括針對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的合成等［18］。本試驗(yàn)測(cè)定CHE對(duì)MRSA細(xì)胞壁與細(xì)胞膜的作用，并通過(guò)SEM和TEM觀察CHE對(duì)MRSA形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，CHE能增加MRSA菌株細(xì)胞壁通透性，弱化細(xì)胞壁維持細(xì)菌形態(tài)的作用，并對(duì)細(xì)胞膜造成破壞。

此外有研究表明，抗菌藥物能夠通過(guò)刺激細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生高水平ROS，發(fā)揮抗菌作用［22］。本試驗(yàn)將CHE與MRSA作用后，菌株ROS濃度顯著升高，通過(guò)測(cè)定SDH、T-AOC、CAT、MDA 4種ROS相關(guān)因子活性變化，證明CHE可通過(guò)影響ROS相關(guān)因子活性，消耗抗氧化物質(zhì)，破壞氧化穩(wěn)態(tài)造成氧化應(yīng)激［23］，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞氧化與抗氧化反應(yīng)失衡，消耗抗氧化物質(zhì)造成脂質(zhì)過(guò)氧化，使菌株ROS水平升高，從而發(fā)揮抗菌活性，與前期結(jié)果相吻合。

SDH是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一，正常生命活動(dòng)中，SDH會(huì)將電子以及質(zhì)子進(jìn)行傳遞，完成氧化磷酸化并合成H2O以及ATP。因此本研究推測(cè)CHE處理MRSA后，菌株ROS水平升高并大量積累可能與氧化磷酸化過(guò)程被破壞有關(guān)。通過(guò)RT-PCR驗(yàn)證，CHE可能是通過(guò)抑制氧化磷酸化相關(guān)SdhA、C基因的表達(dá)，破壞氧化脫氫過(guò)程，從而減少氧化磷酸化產(chǎn)能。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果進(jìn)一步表明，CHE能夠抑制MRSA菌株SDH組裝因子SdhABC，細(xì)胞色素bd復(fù)合物因子CydA、CydB的基因表達(dá)，與探針檢測(cè)和化學(xué)分析相互印證。在低氧或大量ROS存在時(shí)，呼吸鏈中的電子傳遞會(huì)經(jīng)細(xì)胞色素bd進(jìn)行傳遞，保證電子傳遞鏈的完整以及ATP的合成。細(xì)胞色素bd復(fù)合物因子CydA、CydB的基因表達(dá)受到抑制，會(huì)使呼吸鏈電子傳遞受阻，對(duì)氧化磷酸化過(guò)程造成破壞。已有研究表明，鄰苯二甲酸二甲酯可對(duì)S. aureus的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和細(xì)胞表面特性造成破壞，且能誘導(dǎo)S. aureus產(chǎn)生氧化應(yīng)激，降低SDH和ATP酶的活性，破壞能量代謝［24］。除此之外，Lee等［25］研發(fā)了細(xì)胞色素bd抑制劑，與Q203能夠協(xié)同抑制結(jié)核分枝桿菌呼吸鏈的電子傳遞和ATP穩(wěn)態(tài)。本研究中CHE處理后導(dǎo)致MRSA菌株ROS爆發(fā)并大量積累，表明氧化脫氫及電子傳遞過(guò)程均受到影響，使氧化磷酸化無(wú)法正常進(jìn)行。以上研究與轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果說(shuō)明，CHE可能是通過(guò)抑制這些基因的表達(dá)，導(dǎo)致氧化磷酸化功能受阻，大量電子被直接傳遞給分子氧，進(jìn)而使ROS水平升高并大量積累從而起抗菌作用。因此根據(jù)上述結(jié)果可以推斷，CHE可能是通過(guò)抑制SdhABC，細(xì)胞色素氧化酶bd基因的表達(dá)，阻斷呼吸鏈電子傳遞，破壞MRSA菌株氧化磷酸化過(guò)程，使機(jī)體ROS水平升高并大量積累，發(fā)揮抗菌作用。

4 結(jié) 論

綜上所述，CHE可通過(guò)破壞MRSA菌株細(xì)胞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜，發(fā)揮抗菌作用。且CHE處理后可抑制MRSA呼吸鏈SdhABC等基因表達(dá)，從而阻斷呼吸鏈電子傳遞，使ROS水平升高，從而發(fā)揮抗MRSA活性。

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（編輯 白永平）