摘 要： 甲烷馬賽球菌是哺乳動物消化道中的固有菌群，能夠利用三甲胺（TMA）生成甲烷，然而其對宿主的作用機制尚不十分清楚。本文旨在利用小鼠模型研究灌胃甲烷馬賽球菌菌株DZ1活菌對小鼠血清氧化三甲胺（TMAO）和炎癥因子、肝抗氧化能力及盲腸微生物區(qū)系的影響。試驗采用14只5周齡雄性C57BL/6J小鼠（體重18.4±1.1 g），隨機分為對照組（n=7）和處理組（n=7），單籠飼養(yǎng)。處理組每天灌胃200 μL DZ1菌液（1.09×109 個細胞·mL-1），對照組每天灌胃200 μL無菌PBS溶液，試驗期4周。結果顯示，與對照組相比，處理組小鼠日增重和采食量沒有顯著變化（Pgt;0.05）。處理組小鼠血清TMAO濃度和炎癥因子水平顯著降低（Plt;0.05）。處理組小鼠肝中超氧化酶歧化酶（SOD）活性顯著升高（P=0.035），肝總抗氧化能力（T-AOC）顯著提高（P=0.039）。盲腸細菌16S rRNA基因測序結果顯示，處理組和對照組菌群結構沒有顯著差異（ANOSIM，P=0.161）。處理組中疣微菌門（Verrucomicrobia）的相對豐度有降低的趨勢（P=0.064），Lawsonibacter屬、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）和阿克曼菌屬（Akkermansia）等的相對豐度顯著降低（Plt;0.05）。綜上，灌胃甲烷馬賽球菌菌株DZ1未顯著影響小鼠盲腸細菌區(qū)系結構，但降低了小鼠血清TMAO和炎癥因子水平，提高了肝組織總抗氧化能力。

關鍵詞： 氧化三甲胺（TMAO）；甲烷馬賽球菌；腸道微生物；炎癥因子；抗氧化能力

中圖分類號：S852.6

文獻標志碼：A

"文章編號：0366-6964（2024）10-4679-11

收稿日期：2023-10-10

基金項目：江蘇省自然科學基金（BK20211217）；國家自然科學基金（31872381）

作者簡介：占小秀（1998-），女，安徽太湖人，碩士生，主要從事反芻動物營養(yǎng)與瘤胃微生物研究，E-mail： 2021105048@stu.njau.edu.cn

*通信作者：金 巍，主要從事反芻動物營養(yǎng)與消化道微生物研究與教學工作，E-mail：jinwei@njau.edu.cn

Effects of Methanomassiliicoccus DZ1 on Serum Trimethylamine-N-oxide and Inflammatory

Factors， Liver Antioxidant Capacity and Cecum Microbiota in Mice

ZHAN" Xiaoxiu1，2， LIU" Pengyu1，2， XIANG" Xiao’e3， MAO" Shengyong1，2， JIN" Wei1，2*

（1.Ruminant Nutrition and Feed Engineering Technology Research Center， Nanjing Agricultural University，

Nanjing 210095，" China;

2.Laboratory of Gastrointestinal Microbiology， College of Animal Science

and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095，" China;

3.National Experimental

Teaching Center of Animal Science， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095，" China）

Abstract：" Methanomassiliicoccales is an indigenous group of methanogens in the mammalian gut that can use trimethylamine （TMA） to produce methane， but the mechanisms of its action on the host remain unclear. The aim of this study was to investigate the effects of Methanomethylophilus sp. DZ1 on serum trimethylamine-N-oxide （TMAO） and inflammatory factors， liver antioxidant capacity， and cecum microbiota in mice. Fourteen five-week-old male B7/6J mice （body weight 18.4±1.1g） were randomly divided into a control group （n=7） and a treatment group （n=7）， single cage feeding. Each mouse in the treatment group was given 200 μL DZ1 （1.09×109 cells·mL-1） daily， and each mouse in the control group was given 200 μL sterile PBS solution daily. The experiment lasted for 4 weeks. The results showed that the body weight and feed intake of mice in the treatment group had no significant changes （Pgt;0.05）. Serum TMAO concentration and inflammatory factor levels of mice in the treatment group were significantly decreased （Plt;0.05）. The activities of superoxidase dismutase （SOD） in the liver of the treatment group were significantly increased （P=0.035）， and the total antioxidant capacity （T-AOC） of the liver was significantly increased （P=0.039）. The results of 16S rRNA gene sequencing of cecal bacteria showed no significant difference in bacterial community structure between the treatment group and control group （ANOSIM， P=0.161）. The relative abundance of Verrucomicrobia in the treatment group significantly decreased （P=0.064）. The relative abundances of Lawsonibacter， Ruminococcus， and Akkermansia were significantly decreased （Plt;0.05）. In summary， the strain DZ1 had no significant effect on the bacterial community structure of the cecum in mice， but decreased the levels of serum TMAO and inflammatory factors， and increased the total antioxidant capacity of the liver.

Key words： trimethylamine-N-oxide（TMAO）; Methanomassiliicoccus; gut microbiome; inflammatory factors; antioxidant capacity

*Corresponding author： JIN Wei，E-mail：jinwei@njau.edu.cn

三甲胺（Trimethylamine，TMA）是一種腸道微生物代謝產(chǎn)物，具有特殊的魚腥臭味，分子式為（CH3）3N。雞蛋、魚、紅肉、乳制品以及豆粕、菜粕和魚粉等人類食品和動物飼料中都存在著大量的TMA前體物質，例如膽堿、左旋肉堿、甜菜堿、甘油磷脂酰膽堿、三甲基賴氨酸、磷脂酰膽堿等，這些物質在腸道中能被微生物快速降解成TMA［1-3］。大部分TMA會被腸上皮細胞吸收，進入血液循環(huán)，被吸收的TMA在肝中被含黃素單加氧酶3（FMO3）氧化，生成氧化三甲胺（trimethylamine N-oxide，TMAO）［4］。在一些喪失FMO3基因功能的患者中，由于TMA不能被氧化為TMAO而在體內積累，并通過汗液分泌和呼吸釋放，讓患者散發(fā)出魚腥臭味，這種癥狀被稱為魚臭綜合征，是一種遺傳疾病［5］。

近些年的研究發(fā)現(xiàn)，TMAO是誘發(fā)動脈粥樣硬化等心血管疾病的重要因素［6-8］。研究還發(fā)現(xiàn)，長期采食高水平TMAO日糧會誘發(fā)小鼠腎小管間質纖維化和功能障礙［9］。Chen等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠日糧中補充TMAO或膽堿能夠誘導肝小管膽固醇ATP結合盒轉運蛋白（Abc）的表達，增加膽結石形成的風險。研究還發(fā)現(xiàn)，TMAO通過激活ROS-TXNIP-NLRP3炎癥小體，誘導人臍靜脈內皮細胞" 炎癥和內皮功能障礙［11］。綜上可見，大量的TMA進入機體轉化成TMAO也是有害的。在人和動物腸道中廣泛存在著甲烷馬賽球菌目甲烷菌（methanomassiliicoccales，Mmc）［12-13］?；蚪M學和培養(yǎng)學研究表明，Mmc 具有不同于其它甲烷菌目的能量代謝方式和產(chǎn)甲烷代謝途徑，這一目甲烷菌嚴格利用H2還原甲醇、一甲胺（methylamine， MMA）、二甲胺（dimethylamine， DMA）、TMA等甲基化合物生成甲烷［14］。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，Mmc在奶牛瘤胃TMA代謝中起著重要的作用，瘤胃中的TMA 水平影響血液和乳中TMAO的水平［15］，Mmc可能在調控哺乳動物機體TMA/TMAO水平中起著關鍵作用。

本文提出假設：1）提高腸道中的Mmc菌群豐度可能會促進小鼠腸道中產(chǎn)生的TMA轉化成甲烷，減少進入血液循環(huán)TMA的量，進而減少機體內TMAO的水平；2）提高腸道中的Mmc菌群豐度，還可能影響小鼠機體內炎癥水平和抗氧化能力以及腸道菌群結構。因此，本文利用1株奶牛消化道源甲烷馬賽球菌DZ1灌胃小鼠，研究DZ1對小鼠血清TMAO和促炎癥因子水平、肝組織抗氧化能力以及盲腸菌群結構的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗選用14只5周齡雄性C57BL/6J小鼠（體重18.4±1.1 g），小鼠購自江蘇省集萃藥康生物科技股份有限公司。小鼠飼喂SPF級維持日糧，日糧購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司。

1.2 菌株和培養(yǎng)基

菌株DZ1（Methanomethylophilus sp. LGM-DZ1）從南京農(nóng)業(yè)大學消化道微生物實驗室菌種保藏庫獲得（同時保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.40028）。BRN培養(yǎng)基參照Rea等［16］的方法配制（表1）。

無細胞瘤胃液的配制：瘤胃液四層紗布過濾除去大顆粒殘渣，然后離心取上清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

微量元素溶液配制（1 L）［17］：氮川三醋酸（nitrilotriacetic acid），1.5 g；CoSO4·7H2O，0.18 g；CaCl2·2H2O，0.1 g；ZnSO4·7H2O，0.18 g；NaCl，1.0 g；FeSO4·7H2O，0.1 g；MgSO4·7H2O，3.0 g；MnSO4·H2O，0.45 g；NaMoO4·2H2O，0.01 g；NiSO4·6H2O，0.1 g；NaSeO4，0.19 g；NaWO2·2H2O，0.1 g；CuSO4·5H2O，0.01 g；KAl（SO4）2·12H2O，0.018 g；H3BO3，0.01 g。

維生素溶液與脂肪酸溶液參考Lowe等［18］的方法配制。

1.3 DZ1菌液制備

菌株DZ1利用BRN培養(yǎng)基培養(yǎng)。在39 ℃、50 r·min-1的恒溫振蕩器中培養(yǎng)5 d（該菌培養(yǎng)5 d達到對數(shù)生長期）至菌體OD值（OD=600 nm）為0.5～0.6。將10 mL菌液離心后棄上清收集菌體，用4.5 mL無菌1×PBS溶液重懸菌體。已進行預試驗，該株甲烷菌離心菌體后用PBS重懸放置1 h后再接種仍能存活。

1.4 試驗設計

將14只小鼠隨機分為對照組（n=7）和處理組（n=7），單籠飼養(yǎng)。所有小鼠飼喂相同日糧。每天上午10：00給小鼠灌胃，給對照組小鼠灌胃200 μL無菌的1×PBS溶液，處理組小鼠灌胃200 μL的對數(shù)生長期DZ1菌液（細胞數(shù)1.09×109 個·mL-1）。

環(huán)境溫度（24±1）℃，相對濕度（50±5）%，12 h/12 h光暗循環(huán)。小鼠自由采食和飲水。試驗預試期7 d，正試期28 d。從正試期開始，每天灌胃前稱重，每3 d記錄采食量。

1.5 樣品采集

試驗第28天不灌喂菌液。禁食4 h（確保胃中食糜排空）后，小鼠眶下靜脈采血，置于EDTA-K2抗凝采血管中，1 125×g離心15 min后取上清液檢測TMAO含量。頸椎脫臼法處死小鼠，沿腹中線打開腹腔，取出腸道和肝組織，并將組織放入液氮中保存，待測指標；盲腸表面切開一個小口，使用無菌鑷子擠壓盲腸壁，采集盲腸內容物到提前準備的無菌凍存管中，并保存于液氮用于微生物定量和測序分析。

1.6 血清TMAO測定

血清TMAO測定參照Hai等［19］的方法，利用LC-MS測定。取100 μL血清與200 μL乙腈混合沉淀蛋白，14 000×g離心10 min，吸取2 μL上清液注入U3000 DGLC系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific， Waltham，美國）和Q Exactive質譜儀（Thermo Fisher Scientific， Waltham，美國），TMAO在Waters BEH Amide column色譜柱上分離。檢測數(shù)據(jù)利用Xcalibur和TraceFinder 4.1（Thermo Fisher Scientific， Waltham，美國）收集和分析。

1.7 盲腸內容物DNA提取

盲腸內容物DNA提取參照Zoetendal等［20］描述的方法。樣品解凍后，準確稱量0.30 g樣品，加入CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）溶液混勻后轉移至鋯珠管（已加入0.1 mm的氧化鋯珠）中，利用Bead Beat破碎細胞，添加RNA酶去除RNA，酚-氯仿-異戊醇反復抽提去除雜質，異戊醇沉淀DNA，TE buffer 溶解 DNA。Nanodrop 2000（Nyxor Biotech，法國）測定DNA的濃度，DNA樣品260/280比值在1.8～2.0，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 實時熒光定量PCR

胃腸道中的古菌主要由甲烷菌組成，檢測古菌可以反映總甲烷菌豐度的變化。cutC基因是編碼細菌膽堿三甲胺裂解酶的基因，可以檢測膽堿降解菌群豐度的變化。采用Quant StudioTM 7 Flex System （Applied Biosystems，美國）熒光定量PCR儀，以及SYBR? Premix Ex TagTM （TaKaRa，中國） 試劑盒，對總古菌和甲烷馬賽球菌（Methanomassiliicoccales，Mmc）的16S rRNA基因以及細菌中編碼膽堿三甲胺裂解酶的cutC基因進行定量分析。依據(jù)質粒制備的標準曲線計算基因拷貝數(shù)。引物序列見表2。

1.9 炎癥因子和抗氧化指標的測定

利用ELISA試劑盒（BIOFINE，中國）測定血清中的炎癥因子 TNF-α、IL-1β和IL-6水平，以及肝組織中T-AOC、GSH-PX、CAT、SOD、GSH和MDA等氧化應激相關指標。按照說明書步驟進行操作。

1.10 細菌16S rRNA基因測序及數(shù)據(jù)分析

使用引物對細菌的16S rRNA基因全長進行PCR擴增，其中引物包括27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）［23］。每個樣本的擴增混合物首先與條形碼（barcode）序列連接，然后經(jīng)等質量混合后，使用試劑盒（Pacific Biosciences SMRTbellTM Template Prep kit 1.0）的標準流程構建文庫，并在PacBio Sequel Ⅱ測序儀上進行測序。獲得的原始序列經(jīng)過SMRT Link Analysis軟件（版本6.0）處理并生成環(huán)形一致性序列（CCS reads），其中" 最小通過次數(shù)為3和最低預測準確度為0.99。接下來，原始序列進一步去除了條形碼、引物、嵌合體以及包含10個連續(xù)相同堿基的序列，以確保數(shù)據(jù)的質量和可靠性。采用Mothur軟件（版本1.21.1）［24］中的UPARSE工具（版本7.1，http：∥drive5.com/uparse/）進行稀釋曲線分析，并計算樣本中微生物群落的Alpha多樣性指數(shù)，包括Chao、ACE和Shannon指數(shù)。微生物群落的Beta多樣性通過使用R軟件（版本4.1.3，https：∥www.r-project.org/）計算樣本間的Bray-Curtis和UniFrac［25］距離來獲得。使用UCHIME識別并去除潛在的嵌合序列，并基于99%的相似性閾值聚類OTU（Operational Taxonomic Units）。最后，使用RDP Classifier（http：∥rdp.cme.msu.edu/）比對Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫（版本132）對代表性OTU序列進行分類，并在70%的置信度閾值內對每個OTU序列進行系統(tǒng)發(fā)育關系［26］。

1.11 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 25.0軟件（SPSS Inc.， Chicago， IL， USA）進行數(shù)據(jù)分析。采食量、日增重、TMAO、炎癥指標、肝組織抗氧化指標以及實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)利用獨立樣本t檢驗進行分析，微生物數(shù)據(jù)采用 Mann-Whitney U（M）非參數(shù)檢驗分析。Plt;0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 體重與采食量

如圖1所示，與對照組相比，灌胃DZ1菌液對小鼠平均日采食量（P=0.714）和平均日增重（P=0.634）均沒有顯著影響。

2.2 血清TMAO水平

如圖2所示，與對照組相比，灌胃DZ1顯著降低了小鼠血清中TMAO的含量（P=0.017）。

2.3 血清炎癥因子水平

如圖3所示，與對照組相比，灌胃DZ1顯著降低了小鼠血清中TNF-α（P=0.004）、IL-1β（P=0.024）和IL-6（P=0.036）的水平。

2.4 肝組織氧化應激相關指標

如圖4所示，灌胃DZ1小鼠的肝組織中T-AOC（P=0.039）和SOD（P=0.035）相較對照組顯著升高。

2.5 小鼠盲腸中古菌和Mmc的16S rRNA基因以及cutC基因定量分析

如表3所示，試驗第4周總古菌和細菌cutC基因拷貝數(shù)在兩個組間均無顯著差異，Mmc占古菌比例有升高的趨勢（P = 0.083）；且與對照組相比，處理組Mmc拷貝數(shù)顯著升高（Plt;0.05）。

2.6 小鼠盲腸內細菌16S rRNA基因測序分析

由表4所示，與對照組小鼠相比，處理組小鼠的OTUs，Chao指數(shù)，Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)均無顯著差異（Pgt;0.05）。

如圖5所示，對照組和處理組之間小鼠盲腸菌群結構沒有顯著差異（ANOSIM，P=0.161）。

如表5所示，有7個門的細菌相對豐度大于0.1%，相對豐度最高的是厚壁菌門（Firmicutes），其次是擬桿菌門（Bacteroidetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）。與對照組相比，處理組中疣微菌門（Verrucomicrobia）的相對豐度有降低的趨勢（P=0.064）。

如表6所示，共有28個屬的相對豐度大于1%。處理組中Lawsonibacter、Ruminococcus及Akkermansia屬相對豐度顯著低于對照組（Plt;0.05）。

3 討 論

試驗結果表明，灌胃甲烷馬賽球菌DZ1顯著提高了小鼠盲腸內Mmc的拷貝數(shù)，這提示菌株DZ1可以到達小鼠后段腸道。DZ1灌胃顯著降低了小鼠血清中TMAO水平，暗示腸道中產(chǎn)生的TMA進入血液循環(huán)的量減少。

灌胃DZ1對小鼠盲腸細菌菌群結構影響不顯著，但顯著降低了Lawsonibacter、Ruminococcus和Akkermansia屬相對豐度。雖然當前人們對腸道微生物影響機體健康方面的研究尚有很大空白，但許多關于人類和動物的研究結果已經(jīng)證實，腸道微生物可以通過改變菌群結構、菌群門屬的相對豐度、代謝產(chǎn)物譜，甚至通過改變腸道屏障完整性等影響機體生理功能［27-29］。本文雖然沒有對相對豐度發(fā)生顯著變化的三個屬對代謝產(chǎn)物和宿主生理功能的影響展開深入研究，但已有文獻報道分離自人糞便的Lawsonibacter屬細菌Lawsonibacter asaccharolyticus是丁酸鹽產(chǎn)生菌［30-31］，L. asaccharolyticus可以通過丁酸鹽抑制NFκB活化和IκBα降解來降低促炎細胞因子的表達［30］。本研究中，Lawsonibacter相對豐度降低的原因及其對宿主的影響尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，Ruminococcus屬細菌相對豐度在炎癥性腸病患者的消化道中顯著升高，這提示該屬可能參與腸道炎癥的發(fā)生［32］。還有研究報道Ruminococcus屬細菌相對豐度在非酒精性脂肪肝患者腸道內顯著提高［33］。已報道的Akkermansia屬有Akkermansia muciniphila、Akkermansia glycaniphila以及Akkermansia biwaensis三個種，其中A.muciniphila是革蘭陰性專性厭氧菌，僅占健康人類腸道菌群3%［34］。近年來，大量小鼠和臨床研究顯示，該菌在動物代謝疾病及免疫治療方面有獨特功效［33］。研究還發(fā)現(xiàn)，Akkermansia的豐度與闌尾炎的嚴重程度呈負相關［35］。雖然Lawsonibacter和Akkermansia 屬相對豐度的降低對宿主的潛在影響尚不清楚，但Ruminococcus相對豐度的降低可能與腸道炎癥水平降低有關。DZ1與這三個屬相對豐度變化的關系尚不清楚，還有待進一步研究。

灌胃DZ1顯著降低了小鼠血清三種促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。有研究表明，TNF-α是一種多效性促炎細胞因子，在調節(jié)多種發(fā)育和免疫過程中發(fā)揮著不同的作用，包括炎癥、分化、脂質代謝和凋亡，還與動脈粥樣硬化、炎癥性腸病等疾病有關；IL-1β是炎癥反應的主要細胞因子之一，與心血管疾病發(fā)生有關；IL-6是動物機體炎癥發(fā)生的重要影響細胞因子，也是小鼠應激時可誘導的主要細胞因子，還是動物疾病預防的潛在治療性靶點［36-37］。三種促炎因子水平降低的直接原因尚不清楚，可能與血清TMAO水平降低有關。TMAO是腸道微生物和宿主共同作用的代謝產(chǎn)物。血液TMAO水平和心血管疾病、慢性腎疾病和糖尿病等疾病發(fā)生有著密切關系［38］，研究還表明，TMAO可以誘導細胞因子和黏附因子表達，影響炎癥因子水平。Sanchez-Lopez等［39］的研究顯示，增加膽堿攝入量（可導致TMAO水平升高）可以使主動脈中IL-1β表達上調；Lai等［40］的研究也表明，TMAO可以通過激活p38磷酸化和上調抗原R水平使得CKD大鼠體內包括MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18等炎癥因子水平上調，這與本文結果相一致。基于以上結果，可以初步證實增加腸道中甲烷馬賽球菌的豐度可以降低了進入血液循環(huán)TMA的量，降低機體內TMAO水平，進而降低促炎因子水平。

灌胃DZ1提高了小鼠肝組織總抗氧化能力（T-AOC）和超氧化物歧化酶（SOD）活性。超氧化物歧化酶是動物抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分。SOD作為天然抗氧化物酶分布廣泛，在各類動物、植物和微生物中都存在，在機體中主要有清除自由基和抗氧化作用，在一定程度上可以抵御炎癥反應［41］。有研究表明飼喂小鼠用TMAO處理過的水會使小鼠肝抗氧化能力和SOD活性下降［42］。還有研究顯示，TMAO可以降低大鼠機體SOD水平，加劇氧化應激癥狀［43］。Rosa等［44］的研究顯示，大鼠體內SOD活性升高可以緩解機體氧化應激，降低炎癥發(fā)生風險。以上結果表明，DZ1可能通過降低機體TMAO水平提高小鼠肝的抗氧化能力?？寡趸芰Φ奶岣咭部赡芘c促炎因子水平降低有關，還需要進一步證實。

4 結 論

灌胃菌株DZ1降低了小鼠血清中TMAO和炎癥因子水平，提高了肝的總抗氧化能力，但沒有顯著影響盲腸菌群結構。甲烷馬賽球菌廣泛分布于哺乳動物的胃腸道中，本文研究結果進一步證實了甲烷馬賽球菌在調控機體TMA/TMAO水平中起著重要作用；同時還發(fā)現(xiàn)甲烷馬賽球菌可能通過調控機體TMAO水平影響機體炎癥水平和肝的抗氧化能力。后續(xù)研究計劃設置不同濃度梯度，研究腸道中不同甲烷馬賽球菌豐度對血液中TMAO水平和機體炎癥水平的影響，為甲烷馬賽球菌作為益生菌的應用開發(fā)提供依據(jù)。

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（編輯 范子娟）