【關(guān)鍵詞】3A亞基；海馬；行為學(xué)；髓鞘；少突膠質(zhì)細胞

【中圖分類號】R74 【文獻標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2024-01-06

3A亞基（N-methyl-D-aspartate receptor sub?type 3A，GluN3A）是N-甲基-D-天冬氨酸受體（Nmethyl-d-aspartate receptor，NMDAR）的構(gòu)成亞基之一，其在大腦呈現(xiàn)“先升后降”的表達時序性，即在出生后第1周結(jié)束時達到峰值，隨后急劇下降，在成年大腦內(nèi)維持低表達水平[1-2]。然而，臨床研究發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥患者大腦中GluN3A mRNA 水平較健康對照者高32%[3]，提示GluN3A可能在精神分裂癥中發(fā)揮作用；本研究團隊前期也在地唑西平（dizo?cilpine，MK-801）長期腹腔注射誘導(dǎo)的精神分裂癥小鼠模型大腦中發(fā)現(xiàn)GluN3A mRNA表達較對照小鼠增高[4]。另有研究報道，GluN3A 異常還與孤獨癥[1]、亨廷頓舞蹈綜合征[5]、阿爾茨海默病[6]及抑郁癥[7] 等精神類疾病的發(fā)生也高度相關(guān)，這提示GluN3A在精神分裂癥等精神類疾病的發(fā)生中具有重要的調(diào)控意義。

以往研究表明，GluN3A對發(fā)育早期突觸成熟、修剪具有重要調(diào)控功能[8]。以轉(zhuǎn)基因操控技術(shù)調(diào)控發(fā)育早期GluN3A 維持高表達至出生后第25 天，GluN3A 高表達轉(zhuǎn)基因小鼠可出現(xiàn)樹突棘密度降低、突觸數(shù)量減少、突觸后致密區(qū)長度減少等現(xiàn)象并伴長期記憶儲存受損、空間記憶力下降等行為學(xué)改變，提示GluN3A亞基可能通過調(diào)控突觸參與上述精神類疾病[8]。然而，GluN3A亞基可能還通過其他路徑參與。GluN3A已被證明在少突膠質(zhì)細胞和髓鞘上表達豐富，且介導(dǎo)缺血后的少突膠質(zhì)細胞突起萎縮等髓鞘損傷[9-10]；抑郁、焦慮及精神分裂癥等精神類疾病也被證明存在髓鞘完整性受損等現(xiàn)象[11-13]。目前，尚不清楚GluN3A是否通過對髓鞘的影響發(fā)揮其參與抑郁、焦慮等精神類疾病的作用。本研究擬通過腦立體定位注射病毒技術(shù)制備GluN3A過表達小鼠模型，觀察GluN3A過表達對小鼠行為學(xué)以及對髓鞘和少突膠質(zhì)細胞相關(guān)蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

本實驗采用7～8周齡，體質(zhì)量為20～23 g的C57BL/6N小鼠共30只，由重慶恩斯維爾生物公司提供。飼養(yǎng)環(huán)境為重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心IVC 級動物房，12 h/12 h 光暗循環(huán)，溫度（25±1） ℃，每周更換墊料。小鼠自由獲得食物和水，動物倫理批件號為：IACUC-CQMU-2023-11032。

1.2 GluN3A重組腺相關(guān)病毒（recombination adeno-associatedvirus，rAAV）腦立體定位注射

用于本實驗的30只小鼠在適應(yīng)周圍環(huán)境1周后，被隨機分為對照組（n=15）和GluN3A-OE 組（GluN3A overexpres?sion，GluN3A OE，n=15）。1%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后，以冠狀縫和矢狀縫匯合處（即前囟）為原點，根據(jù)以下坐標(biāo)：AP，-2.3 mm； ML，±1.8 mm；DV，-2 mm[7]，鉆孔后緩慢將5 μL微量注射器推入腦內(nèi)海馬處。對照組小鼠雙側(cè)海馬內(nèi)注射對照空病毒（rAAC-CMV-HA-WPRES，rAAV-control），滴度為5.39×1012 vg/mL；GluN3A-OE 組小鼠雙側(cè)海馬內(nèi)注射過表達GluN3A 病毒（rAAV-CMV-Grin3a-HA-WPRES，rAAV-GluN3A），滴度為5.8×1012 vg/mL。每側(cè)海馬注射1.5 μL病毒，注射速度為0.3 μL/min。注射3周后進行行為學(xué)測試。

1.3 行為學(xué)檢測

1.3.1 曠場實驗 測試前2 h，將動物放入安放有曠場箱的房間以適應(yīng)環(huán)境。曠場箱大小為25 cm（長）×25 cm（寬）×30 cm（高），頂部帶有攝像頭，箱底自動劃分為左上、上邊、左邊、中央、右邊、左下、下邊、右邊9個區(qū)域。將小鼠放入中央?yún)^(qū)域任其自動活動，記錄5～10 min。

1.3.2 Y迷宮 測試前2 h，將動物放入安放有Y迷宮的房間以適應(yīng)環(huán)境。將小鼠放在Y迷宮中間處（任意一臂末端），任其自由探索迷宮8 min，視頻分析系統(tǒng)記錄總進臂次數(shù)和連續(xù)進入3個不同臂的次數(shù)，并按公式計算交替率：交替率=連續(xù)進入3個不同臂的次數(shù)（/ 總進臂次數(shù)-2）。

1.3.3 強迫游泳 測試前2 h，將動物放入實驗房間以適應(yīng)環(huán)境。實驗時將小鼠放置在1個直徑為20 cm，高35 cm的玻璃圓柱體中，圓柱體中裝有20 cm深的溫水（24±1）℃。每只小鼠測試6 min，測試結(jié)束，以干毛巾擦拭小鼠后將其放回籠盒中。實驗由固定的攝像機錄像，分析錄像后4 min內(nèi)小鼠的不動時間。

1.3.4 懸尾實驗 測試前2 h，將動物安放在實驗房間以適應(yīng)環(huán)境。實驗時將每只小鼠的尾巴用膠布懸掛在金屬環(huán)上，實驗持續(xù)6 min，計數(shù)錄像后4 min不動時間。結(jié)束后用70%酒精清理器材。

1.4 蛋白質(zhì)免疫印跡

每組選取小鼠8只，獲取單側(cè)海馬組織，使用RIPA裂解液和PMSF混合液提取蛋白。采用BCA法對蛋白定量后，進行SDS-PAGE電泳，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，牛奶封閉2 h，一抗孵育過夜：抗肌動蛋白（actin），1∶7 000，購自博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號：bs-0061R；抗微管蛋白（tubulin），1∶3 000，購自absin 公司，貨號：abs830032；抗GluN3A；1∶1 000，購自Biorbyt公司，貨號：orb157999；抗髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP），1∶3 000，購自Abcam公司，貨號：ab218011；抗少突膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)錄因子2（Oligoden?drocyte Lineage Transcription factor 2，Olig2），1∶3 000，購自Abcam，貨號：ab109186；抗髓鞘相關(guān)糖蛋白（myelin associ?ated glycoprotein，MAG），1∶500，購自santa cruz 公司，貨號：sc-166849，過夜后用TBST漂洗3次并加入對應(yīng)的二抗（山羊抗小鼠IgG，1∶10 000，購自博奧森公司，貨號：bs-0296G；山羊抗兔IgG，1∶10 000，購自博奧森公司，貨號：bs-0295G），室溫孵育1 h后用TBST洗滌3次，最后經(jīng)增強型化學(xué)發(fā)光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）液曝光。以Actin抗體或抗微管蛋白作為內(nèi)對照，經(jīng)Image J軟件進行灰度分析，用目的蛋白與內(nèi)參蛋白的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reversetranscription-polymerase chain" reaction，qRT-PCR）

以上述8只小鼠的另一半海馬組織，使用TRIzol試劑提取總的RNA，總RNA中的基因組DNA使用PrimerScript? RT試劑盒去除，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行PCR反應(yīng)。qPCR反應(yīng)體系為10 μL：cDNA 模板（1 μL），SYBR Green PCR mix（5 μL），上下游引物（各0.5 μL，終濃度為1 μmol/L），DEPC水（3 μL）。反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，第2、3步重復(fù)39個循環(huán)。以Actin作為內(nèi)參基因，目的基因相對表達量使用2-ΔΔCt方法計算。本研究中使用的引物序列見表1。

1.6 免疫熒光染色

小鼠心臟灌注后，取出腦組織，蔗糖脫水，之后進行冰凍切片，每片約30 μm厚。經(jīng)PBS清洗30 min后，0.3%Triton+0.1%Tween 破膜1 h，置于1×檸檬酸鹽中抗原修復(fù)6 min，10%的山羊血清或驢血清封閉2 h，一抗：[抗結(jié)腸腺瘤樣息肉（adenomatous polyposis coli clone，CC1），1∶500，購自millipore公司，貨號OP80-100-UG；抗血小板衍生生長因子受體（platelet derived growth factor receptor alpha，PDGFRɑ），1：500，購自Ramp;D systems，貨號：AF1062]4 ℃孵育過夜。PBS清洗3次后，加入對應(yīng)的二抗（山羊抗小鼠 DyLight488，1∶500，購自Abbkin 公司，貨號：A23210；驢抗山羊 DyLight488，1：500，購自Abbkin公司，貨號11：A24231），37 ℃避光孵育2 h，PBS洗滌3次后，加入4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）進行細胞核染色，室溫避光孵育5 min，洗滌后用抗熒光淬滅劑封片，于共聚焦顯微鏡下采集圖片。圖片采集后導(dǎo)入PS中計算出圖片的實際面積，用圖片中的陽性個數(shù)除以實際面積得出此圖片陽性細胞的密度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

所有統(tǒng)計分析均采用Prism 8軟件進行，計量資料符合正態(tài)分布且方差齊用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用獨立樣本t 檢驗對2組數(shù)據(jù)進行分析，非正態(tài)分布用中位數(shù)（四分位間距）[Md （P25，P75）]表示，采用Mann-Whitney U 檢驗進行分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 海馬注射rAAV- GluN3A后表達情況

將帶GFP的病毒腦立體定位注射，3周后將小鼠冰凍切片腦片置于共聚焦顯微鏡下觀察主要在海馬區(qū)域表達，提示病毒注射部位正確（圖1A）。蛋白質(zhì)免疫印跡驗證雙側(cè)海馬注射rAAV-GluN3A 后海馬腦區(qū)GluN3A 蛋白表達量高于對照組（[0.547（0.340，0.739）] vs. [1.199（0.861，1.249）]，Z=4.779，P=0.005）（圖1B～C）。

2.2 海馬腦區(qū)過表達GluN3A對小鼠行為學(xué)的影響

曠場實驗結(jié)果顯示：對照組小鼠和GluN3A OE組小鼠總運動距離（12.478±2.28 vs. 11.321±2.954，t=1.680，P=0.256）和中央?yún)^(qū)域停留時間（51.786±30.763 vs. 44.143±26.529，t=1.513，P=0.487）相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2A～B），提示海馬腦區(qū)過表達GluN3A未引發(fā)小鼠焦慮樣行為。Y迷宮結(jié)果顯示：GluN3A OE組小鼠進臂總次數(shù)低于對照組小鼠（35.000±11.308 vs.25.133±8.663，t=2.592，P=0.015），但2組小鼠的進臂交替率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（0.557±0.075 vs.0.624±0.123，t=1.738，P=0.381）（圖2C～D），提示海馬腦區(qū)過表達GluN3A未引發(fā)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力改變。2組小鼠在強迫游泳（100.467±48.071 vs. 116.533±40.505，t=0.910，P=0.347）和懸尾實驗（106.200±38.578 vs.116.400±35.185，t=1.223，P=0.471）中的不動時間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2E～F），提示海馬腦區(qū)過表達GluN3A未引發(fā)小鼠出現(xiàn)絕望樣抑郁行為。

2.3 海馬腦區(qū)過表達GluN3A下調(diào)髓鞘相關(guān)蛋白的表達

為驗證海馬腦區(qū)過表達GluN3A對髓鞘的影響，通過蛋白質(zhì)免疫印跡和qRT-PCR 檢測海馬中髓鞘相關(guān)蛋白和mRNA表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：雙側(cè)海馬注射rAAV-GluN3A后，GluN3A OE 組小鼠海馬組織MBP 蛋白（3.715±1.203vs. 1.416±0.343，t=3.184，P=0.019）和MBP mRNA（0.993±0.112 vs. 0.675±0.325，t=2.263，P=0.043）表達低于對照組小鼠（圖3A～C）；MAG蛋白[2.942（2.694，2.962）] vs. [0.896（0.661，1.358）]（Z=0.909，P=0.022）和MAG mRNA（1.000±0.164 vs.0.716±0.269，t=2.383，P=0.032）表達低于對照組小鼠（圖3D～F）。髓鞘是由少突膠質(zhì)細胞包裹軸突形成，進一步對海馬中Olig2蛋白和Olig2 mRNA 檢測，結(jié)果顯示，GluN3A OE組小鼠的Olig2蛋白（0.493±0.113 vs.0.286±0.027，t=3.079，P=0.022）和Olig2 mRNA（1.000±0.083 vs. 0.459±0.317，t=4.369，Plt;0.001）表達均低于對照組小鼠（圖3G～I）。

2.4 海馬腦區(qū)過表達GluN3A對少突膠質(zhì)細胞的影響

為了檢測海馬中少突膠質(zhì)細胞的分化情況，使用免疫熒光染色對海馬中不同發(fā)育階段的少突膠質(zhì)細胞進行計數(shù)，CC1陽性指示成熟少突細胞、PDGFRα陽性表示少突膠質(zhì)前體細胞。免疫熒光結(jié)果顯示：與對照組相比，GluN3A OE組小鼠海馬中PDGFRα陽性少突膠質(zhì)細胞[546.875（546.875，781.250）] vs. [507.813（507.813，781.250）]（Z=549.842，P=0.496）無明顯改變（圖4A～C），CC1陽性成熟少突膠差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=13.903，Plt;0.001）（圖4D～F）。

3討論

以往研究報道，GluN3A異常與精神分裂癥、孤獨癥、亨廷頓舞蹈綜合征、阿爾茨海默病及抑郁癥等精神類疾病的發(fā)生高度相關(guān)[1，5-8]。如Robert應(yīng)用基因操控技術(shù)調(diào)控GluN3A高表達至出生后第25天或成年期（海馬CA1區(qū)典型高表達），GluN3A過表達轉(zhuǎn)基因成年小鼠較對照小鼠表現(xiàn)出較強的空間學(xué)習(xí)能力，但長時程記憶能力減弱[8]；Zhang MM等[7]發(fā)現(xiàn)慢性束縛抑郁小鼠模型海馬腦區(qū)GluN3A表達下調(diào)，以rAAV-GluN3A 挽救海馬腦區(qū)GluN3A 下調(diào)，慢性束縛引發(fā)的抑郁樣行為可被逆轉(zhuǎn)。此外，尚有團隊發(fā)現(xiàn)GluN3A基因敲除小鼠表現(xiàn)出運動功能障礙、學(xué)習(xí)記憶能力增強[6，14]及社交功能受損[15]等表型。本研究中，采用雙側(cè)海馬注射rAAV-GluN3A制備海馬區(qū)GluN3A過表達成年小鼠模型，Y迷宮行為學(xué)檢測結(jié)果顯示，海馬區(qū)GluN3A過表達小鼠進臂總次數(shù)明顯下降，但進臂交替率在兩組小鼠間無明顯差異，表明僅在海馬區(qū)過表達GluN3A并未引發(fā)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的顯著性改變。盡管海馬被證明在儲存和檢索新記憶以及空間導(dǎo)航方面有重要意義[16]，但僅改變海馬區(qū)GluN3A可能不足以引發(fā)行為學(xué)改變，推測可能是大腦內(nèi)GluN3A的綜合改變而非單獨的大腦區(qū)域參與了異常行為學(xué)的發(fā)生。

以往研究報道，精神分裂癥患者GluN3A表達上調(diào)僅發(fā)生在大腦背外側(cè)前額葉皮質(zhì)區(qū)而非下顳葉新皮層[3]。后續(xù)將制備全腦GluN3A過表達小鼠，以探討GluN3A過表達的對行為學(xué)影響的綜合效應(yīng)。此外，曠場實驗結(jié)果顯示，曠場中總運動距離、中央?yún)^(qū)域運動時間在兩組小鼠中也無顯著性差異，提示僅在海馬區(qū)過表達GluN3A未引發(fā)小鼠運動能力及焦慮樣行為的改變；懸尾實驗和強迫游泳結(jié)果提示，僅在海馬區(qū)過表達GluN3A未引發(fā)小鼠抑郁樣行為。

以往研究表明，GluN3A對突觸成熟、修剪具有重要調(diào)控功能：例如，過表達GluN3A亞基可導(dǎo)致紋狀體或海馬CA1區(qū)樹突棘密度降低、突觸數(shù)量減少及突觸后致密區(qū)度減少[5，8]。既往研究證明NMDAR還表達在少突膠質(zhì)細胞突起和髓鞘上，并參與缺血誘導(dǎo)的髓鞘/白質(zhì)損傷，顛覆以往“NMDAR僅表達在神經(jīng)元、突觸后膜PSD”的研究發(fā)現(xiàn)[10，17-18]。而少突膠質(zhì)細胞突起/髓鞘NMDAR區(qū)別于突觸NMDAR的特點就是GluN3A亞基含量豐富[19]，Henson MA等[9]提出，可能正是含GluN3A亞基的NMDAR介導(dǎo)了缺血后的少突膠質(zhì)細胞突起萎縮等白質(zhì)損傷。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，MK-801誘導(dǎo)的精神分裂癥模型小鼠腦內(nèi)GluN3A亞基轉(zhuǎn)錄水平增加的同時，其胼胝體內(nèi)髓鞘蛋白MBP表達下調(diào)、髓鞘板層分離、細小有髓神經(jīng)纖維丟失等神經(jīng)損傷[20]。依據(jù)前述證據(jù)推測，除了調(diào)控突觸，GluN3A亞基可能還通過調(diào)控髓鞘、影響白質(zhì)完整性參與抑郁、焦慮等精神類疾病的發(fā)生。本研究顯示在雙側(cè)海馬區(qū)過表達GluN3A 可顯著下調(diào)海馬區(qū)髓鞘蛋白MBP 和MAG的表達。少突膠質(zhì)細胞是中樞內(nèi)成髓鞘細胞，其發(fā)育大致可分為少突膠質(zhì)前體細胞、不成熟少突膠質(zhì)細胞和成熟少突細胞等階段[21]。本研究中，采用少突膠質(zhì)細胞不同發(fā)育時期的標(biāo)志物進行了少突膠質(zhì)細胞譜系分析，結(jié)果顯示，少突膠質(zhì)細胞全譜系標(biāo)志物蛋白Olig2及成熟少突膠質(zhì)細胞標(biāo)志物CC1在雙側(cè)海馬區(qū)過表達GluN3A小鼠海馬均顯著性降低，但少突膠質(zhì)前體細胞PDGFRɑ無顯著性改變，提示GluN3A過表達可能通過影響少突膠質(zhì)細胞分化成熟而非通過影響少突膠質(zhì)細胞的增殖發(fā)揮對髓鞘形成的調(diào)控作用。

綜上所述，本研究分析了在雙側(cè)海馬過表達GluN3A基因?qū)π∈笮袨閷W(xué)及髓鞘和少突膠質(zhì)細胞的影響，研究首次揭示GluN3A過表達可導(dǎo)致脫髓鞘和少突膠質(zhì)細胞生成分化障礙。盡管僅在雙側(cè)海馬過表達GluN3A并未引發(fā)明顯的行為學(xué)改變，但全腦過表達GluN3A對行為學(xué)的影響及其可能的機制值得深入探討。