【關鍵詞】染色體核型分析；染色體微陣列分析；產(chǎn)前診斷；基因組拷貝數(shù)變異

【中圖分類號】R714.15 【文獻標志碼】A 【收稿日期】2023-08-31

據(jù)2012年我國出生缺陷防治報告，我國出生缺陷的發(fā)生率約為5.6%[1]，其中染色體畸變約占出生缺陷遺傳學病因的80%以上[2]，主要包括染色體數(shù)目異常和結構異常。羊水細胞染色體核型分析能夠檢出染色數(shù)目異常和易位、倒位、插入及較大片段缺失/重復等結構異常。隨著產(chǎn)前診斷技術的發(fā)展及對人類全基因組拷貝數(shù)變異（copy numbervariations，CNVs）的分析，由CNVs所致的染色體微缺失/微重復綜合征（microdeletion/microduplicationsyndromes，MMS）已明確300 余種，綜合發(fā)病率近1/600，占染色體畸變所致出生缺陷的一半[2-5]。染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）基于固態(tài)芯片平臺，能對微量DNA樣本進行分析，檢出gt;100 kb的CNVs。本研究聯(lián)合應用羊水細胞染色體核型分析和CMA 對1 575 例高危單胎孕婦羊膜腔穿刺羊水標本進行檢測，并對檢測結果進行回顧性分析，以評估兩者在產(chǎn)前診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2017年1月至2018年10月在重慶市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心就診的高危單胎孕婦1 575例，年齡（33±5）歲（范圍19～47歲），孕周（19.6±2.6）周（范圍15～33周）。病史資料記錄完整，符合衛(wèi)生部產(chǎn)前診斷指征，至少滿足以下１項：①高齡妊娠（妊娠年齡≥35歲）；②唐氏綜合征血清學篩查高風險；③無創(chuàng)產(chǎn)前篩查（noninvasive prenatal testing，NIPT）高風險；④超聲篩查異常；⑤不良孕產(chǎn)史或遺傳性疾病家族史（圖1）。

1.2 方法

1.2.1 羊水標本采集 孕婦和家屬均簽署《羊膜腔穿刺術及羊水染色體產(chǎn)前診斷知情同意書》和《經(jīng)腹羊膜腔穿刺術后注意事項知情同意書》，經(jīng)重慶市婦幼保健院醫(yī)學倫理委員會批準，1 575例入選孕婦在B超引導下經(jīng)腹行羊膜腔穿刺術，抽取30 mL羊水。

1.2.2 染色體核型分析 按細胞遺傳實驗室羊水細胞培養(yǎng)及染色體核型分析標準操 作程序：20 mL羊水離心，棄上清，雙線培養(yǎng)7～9 d（37 ℃，5%二氧化碳），收獲細胞、制片、G顯帶。至少計數(shù)20個中期分裂相，分析5個核型，參考《人類細胞遺傳學國際命名體制》（ISCN2013）描述核型分析結果。

1.2.3 CMA 按照Illumina Human CytoSNP-12芯片操作手冊10 mL 羊水離心，棄上清，DNeasy 核酸提取試劑盒（DNeasy Blood amp; Tissue Kit，Qiagen）提取羊水細胞DNA，美國Illumina CytoSNP-12芯片，ISCAN掃描系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)，應用Karyostudio軟件，結合國際常用基因組與表型公共數(shù)據(jù)庫，包括OMIM（https：//www.omim.org/）、ClinGen（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/dbvar/clingen/index.shtml/）、DGV（http：//dgv.tcag.ca/dgv/app/）、DECIPHER（http：//dgv.tcag.ca/dgv/app/）等分析結果。按照CNVs臨床意義界定指南[6]對gt;100 kb的CNVs進行分類：①致病性（pathogenic，P）；②可能致病性（likely pathogenic，LP）；③臨床意義不明確（variantsof unknown significance，VOUS）；④可能良性（likely benign，LB）；⑤良性（benign，B）。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行配對卡方檢驗，比較2種方法在不同指征分組中的差異。統(tǒng)計輸出Kappa 值，Kappa≥0.75，說明2種方法診斷結果一致性較好；0.4≤kappalt;0.75，說明2種方法診斷結果一致性一般；Kappalt;0.4，說明2種方法診斷結果一致性較差。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 染色體核型分析結果

針對所有樣本染色體核型分析檢出染色體多態(tài)性變異68例，染色體異常92例，異常檢出率5.84%（92/1 575），其中染色體數(shù)目異常51例，包括21三體29例、18三體7例、性染色數(shù)目異常15例；染色體結構異常35例，包括平衡易位25例、倒位4例、缺失3例、重復1例、衍生染色體2例；嵌合體6例，包括2例性染色體嵌合，2例平衡易位嵌合，1例21三體嵌合和1例標記染色體嵌合（表1）。

2.2 CMA結果

針對所有樣本CMA 檢出異常184 例，異常檢出率11.68%（184/1 575），其中非整倍體51例，嵌合體4例，雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）11例，CNVs 118例，包括致病性CNVs（pCNVs）18 例，可能致病性CNVs（lpCNVs）9例，VOUS 91例（表2）。

2.3 聯(lián)合應用核型分析和CMA結果分析

針對所有樣本聯(lián)合2項技術共檢出異常215例，異常檢出率13.65%。其中核型分析和CMA均異常61例，核型異常而CMA正常31例，核型分析額外檢出率1.97%；核型分析正常而CMA異常123例，CMA額外檢出率7.81%，其中pCNVs和lpCNVs共21例，檢出率為1.33%（表3）。

2.4 染色體核型分析未見異常病例CMA檢出結果分析

染色體核型分析正常病例共計1 483例，其中超聲檢查結構異常132例，軟指標（ultrasound soft markers，USM）提示259例，超聲檢查未見異常1 092例。核型分析正常樣本中共檢出pCNVs和lpCNVs 20例，檢出率1.35%，其中超聲檢查結構異常病例pCNVs和lpCNVs共4例，檢出率3.03%，USM提示病例pCNVs 和lpCNVs 共4 例，檢出率1.54%，超聲檢查未見異常病例pCNVs 和lpCNVs 共12 例，檢出率1.10%（表4）。

2.5 不同臨床指征組間核型分析與CMA檢出結果分析

根據(jù)產(chǎn)前診斷指征不同1 575例樣本可分為6組：高齡組、唐篩高風險組、NIPT高風險組、超聲異常組、USM提示組（包括NT增厚、單臍動脈、鼻骨發(fā)育不良等）和不良孕產(chǎn)史及遺傳性疾病家族史組（包括夫婦染色體異常）。通過對各組核型分析和CMA檢出結果分析，除NIPT高風險組和不良孕產(chǎn)史及遺傳性疾病家族史組外，核型分析與CMA檢出率均有明顯差別。NIPT 高風險組兩種方法檢出結果一致性好（Kappa=0.828，Plt;0.001）；不良孕產(chǎn)史及遺傳性疾病家族史組2種方法檢出結果一致性較差（Kappa=0.102，Pgt;0.05）；其他各組2種方法檢出結果一致性較好（表5）。

2.6 妊娠結局

2.6.1 染色體數(shù)目異常 羊水細胞染色體核型分析染色體數(shù)目異常55例，54例涉及18、21和性染色體數(shù)目異常，均終止妊娠；1例標記染色體嵌合體（母親輕微智力障礙，外院外周血染色體檢查異常，拒絕提供報告）順產(chǎn)未見明顯異常，隨訪至4+歲，監(jiān)護人述語言和智力發(fā)育遲緩（表6 case 1）。

2.6.2 染色體結構異常 羊水細胞染色體核型分析染色體結構異常37 例，6 例非平衡性結構異常與CMA 檢出結果一致，終止妊娠（表6 case 2～7）。染色體易位或倒位31 例繼續(xù)妊娠，其中17 例染色體結構異常遺傳自表型正常的親本。

2.6.3 部分CNVs CMA檢出pCNVs 18例，6例染色體部分缺失或重復，包含較多基因，與核型分析結果一致，均終止妊娠。12例MMS，分別為DiGeorge綜合征3例，16p11.2微重復綜合征2例和微缺失綜合征2例，16p13.11微缺失綜合征1例，Potocki-Lupski綜合征1例（17p11.2微重復），腓骨肌萎縮綜合征（charcot-marie-tooth syndrome type 1A，CMT1A）1 例（17p12 微重復），腎囊腫與糖尿病綜合征（Renalcysts andDiabetes syndrome，RCAD）1例（17q12微缺失），血小板減少伴橈骨缺失綜合征（Thrombocytopenia with Absent Radii syn?drome，TAR）1例（1q21.1q21.2微重復）（詳見表7）

另case 2、case 10、case 16、case 18同時進行了全外顯子組高通量測序（whole exome wequencing，WES）檢測，結果均與CMA一致，臨床表型相符。

CMA檢出lpCNVs 9例，攜帶劑量敏感基因，或公共數(shù)據(jù)庫中有相關片段的致病性報道等。6例孕婦及家屬行外周血CMA 驗證，其中1 例遺傳自輕微智力障礙的母親（表6case 1），5例遺傳自無表型的親本，繼續(xù)妊娠，隨訪至出生，新生兒外觀無異常；3例未驗證選擇繼續(xù)妊娠，隨訪至3+歲，生長發(fā)育正常。

CMA檢出VOUS 91例，40例孕婦及家屬行外周血CMA驗證，其中38例遺傳自無表型的親本，繼續(xù)妊娠，隨訪至出生，新生兒外觀無異常；2例為新發(fā)突變，1例終止妊娠，1例繼續(xù)妊娠，隨訪至3+歲，生長發(fā)育正常。

3 討論

傳統(tǒng)的染色體核型分析技術從20世紀70年代早期發(fā)展以來，目前普遍應用分裂中期細胞染色體G顯帶400～500條帶，可明確檢出gt;10 Mb的缺失、重復、易位、倒位等較大片段的結構重排和染色體數(shù)目異常，但核型分析有賴于工作人員的經(jīng)驗，細胞培養(yǎng)時間和檢測周期長且存在細胞培養(yǎng)失敗的風險。CMA分為比較基因組雜交微陣列（array-basedcomparative genomic hybridization，aCGH）和單核苷酸多態(tài)性微陣列（single nucleotide polymorphismarray，SNP array），具備高分辨率、高通量、高靈敏度、高自動化等優(yōu)勢，可精確定位異常片段，顯示受累基因，利于識別并鑒定疾病相關基因[7]，但CMA不能檢出平衡性結構重排和芯片探針未覆蓋的染色體區(qū)域異常如異染色質區(qū)和隨體區(qū)域，不能分辨易位型三體，還有可能檢出大量VOUS[8-9]，導致孕婦及家屬焦慮擔憂，甚至錯誤終止妊娠。

本研究以1 575例高危單胎孕婦羊膜腔穿刺羊水標本為研究對象，同時應用核型分析和CMA進行檢測，結果顯示在染色體數(shù)目異常方面，核型分析與CMA檢出結果一致性高。其中核型分析48，X？，+21，+mar 1例，CMA結果僅顯示21三體，未顯示其他染色體片段重復，提示該標記染色體可能位于芯片探針覆蓋區(qū)域以外而漏檢。核型分析46，X？，t（13;21）（p10;q10）mat 1例，經(jīng)驗證遺傳自羅伯遜易位的母親，但CMA無法區(qū)分易位型21三體也不能驗證親本的羅伯遜易位。提示對于胎兒21三體的孕婦及家屬建議行外周血染色體核型分析，為再次妊娠提供臨床指導。

在嵌合體方面核型分析與CMA檢出結果一致性差。有研究表明[10-11]羊水細胞體外培養(yǎng)過程中染色體單體細胞增值率和存活率高于三體細胞，因此羊水染色體核型分析基于培養(yǎng)后的羊水標本無法反映其真實嵌合比例；而CMA檢測的基因拷貝數(shù)會被同一染色體拷貝數(shù)的增加或減少所平衡，因而不能精確地描述單體和三體并存的嵌合水平[12]。核型分析mos 47，XXX[21]/45，X[6] 1例，CMA結果顯示性染色體三體，并未提示嵌合現(xiàn)象，可能與體外培養(yǎng)過程中單體細胞優(yōu)勢生長以及CMA檢測X染色體單體拷貝數(shù)被三體平衡相關[12-13]。提示對于染色體單體和三體同時存在的嵌合體，建議采用未培養(yǎng)的羊水標本行熒光原位雜交（fluorescence in situ hy?bridization，F(xiàn)ISH），以明確嵌合比例。核型分析45，X 2例CMA結果顯示為嵌合體，可能與母體細胞污染相關，羊水細胞培養(yǎng)貼壁生長，可在一定程度上排除母體細胞干擾。核型分析mos 46，X？，t（7;8）（q21;q23）[5]/46，X？[45] 1例和mos 46，X？，t（4;5）（q12;q35）[8]/46，X？[22] 1例，為平衡性結構重排且嵌合比例低，CMA不能檢出，孕婦及家屬驗證外周血染色體核型，均正常，推斷該嵌合體為假性嵌合，異常核型由胎兒脫落細胞或非胚胎細胞體外培養(yǎng)發(fā)生畸變并繼續(xù)增殖產(chǎn)生。據(jù)文獻報道[14]，產(chǎn)前羊水細胞診斷中嵌合體發(fā)生概率為3.4%～8.6%，但大部分屬于假性嵌合。提示當羊水核型分析發(fā)現(xiàn)結構異常嵌合體時應首先進行胎兒臍帶血染色體復查以驗證結果，同時采用其他檢測手段如FISH 等輔助驗證，但應警惕在某些特殊情況下臍血染色體不能完全代表胎兒的真實核型。核型分析mos 47，X？，+mar[11] /46，X？[16] 1例，結合CMA檢測結果分析該標記染色體為15號染色體部分片段，遺傳自有輕微智力障礙的母親，隨訪至4+歲，患兒語言和智力發(fā)育遲緩。提示對于核型分析無法確定來源和性質的片段，CMA可準確提示亞顯微水平的信息，對遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷具有指導意義。由此可見，產(chǎn)前診斷嵌合體病例建議結合染色體核型分析、CMA、FISH、臨床超聲檢查等多種檢測手段，采用培養(yǎng)和未培養(yǎng)羊水、臍血、絨毛等多種檢測樣本，綜合分析檢測結果，為產(chǎn)前診斷提供科學準確的信息。

針對所有樣本聯(lián)合2 項技術共檢出異常215例，異常檢出率13.65%，高于核型分析的異常檢出率5.84%和CMA的異常檢出率11.68%。核型分析額外檢出率1.97%；CMA 額外檢出率7.81%，其中pCNVs和lpCNVs檢出率1.33%。由此可見，核型分析在可及的分辨率范圍內可發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目異常和結構異常，而CMA能夠實現(xiàn)全基因組水平掃描，準確反映變異區(qū)帶、變異類型、基因數(shù)目，在染色體微結構變異方面具有突出優(yōu)勢[15]。有報道核型分析未見異常但超聲提示結構異常的胎兒中有3.1% ～7.9%存在pCNVs或lpCNVs[4，8，16-17]；核型分析和超聲均未發(fā)現(xiàn)異常的胎兒中，有1.0%～1.7%存在pCNVs或lpCNVs[4][8]。本研究核型分析未見異常病例中，超聲檢查異常者共檢出pCNVs和lpCNVs 4例，檢出率3.03%，超聲檢查未發(fā)現(xiàn)異常者共檢出pCNVs 和lpCNVs 12例，檢出率為1.10%，與文獻報道基本一致。2014年我國專家共識即提出，產(chǎn)前超聲檢查異常而染色體核型分析正常是CMA的主要臨床應用指征之一[18]。2016年美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學院（ameri?can college of obstetricians and gynecologists，ACOG）及母胎醫(yī)學會society for maternal-fetal medicine，SMFM）發(fā)布的指南明確提出，超聲發(fā)現(xiàn)胎兒結構異常時，CMA可作為一線產(chǎn)前診斷方法[19][20]。目前比較明確，可直接進行CMA檢測的超聲結構異常包括心臟、泌尿系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道畸形等[21-25]。本研究核型分析正常病例中檢出pCNVs和lpCNVs共20例，其中5例有USM，3例超聲結構異常，包括1例室間隔缺損、1例腎發(fā)育不良和1例重度腦積水，涉及心臟、泌尿系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。提示將染色體核型分析未發(fā)現(xiàn)異常病例進一步行CMA檢測可明確染色體微結構變異的致病風險，尤其是對于超聲檢查結構異常者，pCNVs和lpCNVs檢出對精準產(chǎn)前診斷具有重要意義。另有研究提示[26]，鑒于非整倍體基礎風險高，高齡孕婦不論超聲檢查是否提示異常，建議同時行羊水核型分析和CMA檢測，避免浪費時間造成孕晚期臍穿驗證。

不同臨床指征組間結果分析顯示在高齡、NIPT高風險、超聲異常、USM提示等分組中CMA均顯著提高了異常檢出率。NIPT高風險組2種方法結果一致性好且具有統(tǒng)計學意義，這與NIPT的實驗性質相關，NIPT以篩查非整倍體為主，2種方法在染色體非整倍體方面檢出結果一致好，提示在NIPT高風險的人群中，2 種方法具有同等優(yōu)勢，可綜合考慮時間、花費等多方面因素選擇合適的檢測方法。在不良孕產(chǎn)史及遺傳性疾病家族史組中，2種方法檢出結果一致性較差，與該組包含較多夫婦染色體結構異常人群的分組依據(jù)相關，平衡性結構重排是核型分析的優(yōu)勢和CMA的盲點，但CMA可以檢出核型分析無法發(fā)現(xiàn)的染色體微缺失和微重復，提示對于該組人群建議同時行羊水染色體核型分析和CMA檢測，確認染色體結構異常的同時進一步明確微結構變異的致病風險。

本研究中CMA 檢出12 例MMS，其中3 例Di?George綜合征，該綜合征是智力發(fā)育遲滯最常見的病因之一，僅次于唐氏綜合征，也是先天性心臟病的第二大遺傳學病因，其癥狀差異大，常累及全身多個臟器[27]。5例MMS累及16號染色體，16號染色體富含低拷貝重復序列（low copy repeats，LCRs），LCRs易發(fā)生非等位基因同源重組，從而造成拷貝數(shù)的重復或缺失[26]。16p11.2 區(qū)域包含TBX6 基因，16p13.11區(qū)域包含NDE1基因，均涉及神經(jīng)發(fā)育表型，臨床表現(xiàn)多樣，主要為孤獨癥、智力障礙、語言障礙、發(fā)育遲緩、脊柱畸形等，且存在臨床外顯不全的情況[28-29]。提示對于明確致病的MMS，建議行親本CMA驗證，但應當明確告知致病性及外顯率和表現(xiàn)度等情況，為再次生育作遺傳風險評估。

本研究中CMA 檢出11例LOH 和91例VOUS，經(jīng)驗證38例VOUS遺傳自無表型的親本，初步判讀為家族性良性CNVs，隨訪至出生，新生兒外觀無異常；1例新發(fā)突變隨訪至3+歲，生長發(fā)育正常。提示對于VOUS應該向孕婦及家屬充分告知該檢測結果的局限性，建議夫婦行外周血CMA檢測以明確是否新發(fā)突變，結合超聲檢查及家族譜系綜合分析，更合理的遺傳咨詢指導胎兒預后的判斷。

4 結論

在產(chǎn)前診斷中聯(lián)合應用染色體核型分析和CMA可有效提高染色體異常檢出率，尤其是超聲結構異常人群。嵌合體病例需根據(jù)具體情況選擇適宜的檢測技術和樣本，綜合分析檢測結果。特殊微結構變異位點應當進行有效的病例隨訪，指導臨床咨詢，完善染色體疾病譜，最終為遺傳咨詢和生育指導提供臨床依據(jù)。