【關(guān)鍵詞】慢性乙型肝炎；環(huán)狀RNA；高通量芯片；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

【中圖分類號(hào)】R183.9 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2024-01-12

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）仍然是全球范圍的主要健康負(fù)擔(dān)，尤其是在中國(guó)[1-2]。世界衛(wèi)生組織報(bào)告稱，2019年全球約有300萬新發(fā)乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染者和2.96億慢性HBV 感染者[3]。HBV 感染是誘發(fā)主要CHB患者形成發(fā)展的直接因素，也是誘發(fā)肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）等嚴(yán)重肝臟疾病的關(guān)鍵原因[4]。雖然近年乙型肝炎疫苗接種率有一定提高，HBV 感染率有所下降，但CHB患者人數(shù)仍然居高不下。迄今為止，CHB的分子機(jī)制尚不完全清楚[5]。此外，CHB進(jìn)展的不可預(yù)測(cè)性也阻礙了CHB的治療[6]。臨床上，CHB的治療具有時(shí)間長(zhǎng)、治療效果差、預(yù)后差等特點(diǎn)，對(duì)人體健康產(chǎn)生巨大的負(fù)面影響[7]。因此，優(yōu)化或探索更完善的治療方法極為重要。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類內(nèi)源性非編碼RNA，在前mRNA階段由外顯子、內(nèi)含子或2者組合進(jìn)行反向剪接形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。circRNA具有RNAse R耐受和抗核酸酶活性，比線性RNA穩(wěn)定[8]。伴隨高通量芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析的快速發(fā)展，在真核轉(zhuǎn)錄組中已經(jīng)鑒定出許多circRNA[9]。circRNA 在CHB 患者肝臟組織中具有差異表達(dá)[10]。大量研究證實(shí)，circRNA通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合微小RNA（microRNA，miRNA）并充當(dāng)海綿或誘餌，抑制miRNA 活性，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞功能[11-14]。由此猜想，CHB患者血清外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中可能也存在一些異常表達(dá)的circRNAs，通過吸附miRNA 影響CHB 的發(fā)生發(fā)展。因此，本研究應(yīng)用高通量芯片和生物信息學(xué)技術(shù)分析cir?cRNA表達(dá)譜，尋找有效的分子靶點(diǎn)，為更深入的機(jī)制研究提供數(shù)據(jù)支持和研究思路。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

圖1展示本研究技術(shù)路線圖。本研究招募的24例CHB患者來源于2021年4月至6月在重慶市九龍坡區(qū)人民醫(yī)院感染科就診人員，24例年齡和性別匹配的健康對(duì)照為2021年4至5月在重慶市九龍坡區(qū)人民醫(yī)院體檢人員。本研究獲得重慶醫(yī)科大學(xué)倫理審查委員會(huì)支持，并遵循知情同意原則。CHB患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡為18～60歲；②HBsAg血清陽性且持續(xù)時(shí)間超過6個(gè)月，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《慢性乙型肝炎防治指南（2019 版）》；③同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他病毒性感染，如甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒或人類免疫缺陷病毒；②合并有冠心病、慢性阻塞性肺氣腫、終末期腎臟病、非小細(xì)胞肺癌等嚴(yán)重慢性疾??；③病歷資料不全。健康對(duì)照組沒有任何HBV感染史，HBV標(biāo)志物檢測(cè)陰性且生化肝功能正常。健康對(duì)照組不一定接受過HBV檢測(cè)，本研究主要納入肝功能檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示。

1.2 血樣采集及外周血單核細(xì)胞提取

使用肝素抗凝管和EDTA抗凝管分別采集2 mL和5 mL受試者外周靜脈血，24 h內(nèi)完成處理。其中肝素抗凝血用于檢測(cè)臨床生化指標(biāo)；EDTA抗凝血離心后，吸取中間淋巴細(xì)胞層，使用人全血單個(gè)核細(xì)胞分離液（灝洋生物，中國(guó)）提取PBMCs。

1.3 高通量芯片檢測(cè)

本研究選取5例CHB患者和5例健康對(duì)照PBMCs樣本進(jìn)行芯片分析。按照制造商說明，使用RNeasy總RNA分離試劑盒（qiagen，gmBH，Germany）和Trizol試劑（Life technolo?gies，Carlsbad，CA，US）分離總RNA，并使用RNeasy Mini試劑盒（qiagen，gmBH，Germany）進(jìn)行RNA 純化。通過AgilentBioanalyzer 2100（agilent technologies，Santa Clara，CA，US）檢查樣本中總RNA完整性。利用各組RNA樣品生成生物素化cRNA靶標(biāo)，隨后將cRNA靶標(biāo)與載玻片雜交。掃描過程在Agilent芯片掃描儀（agilent technologies，Santa Clara，CA，US）上完成。使用特征提取軟件10.7（agilent technologies，SantaClara，CA，US）進(jìn)行數(shù)據(jù)提取。用R 軟件“l(fā)imma”包中的quantile算法對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。

1.4 circRNA的鑒定和特征分析

首先計(jì)算2 組間circRNA 的差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C），進(jìn)而得到log2FC。通過R 軟件中“ggplot2”包繪制cir?cRNA 的散點(diǎn)圖和火山圖，“pheatmap”包進(jìn)行聚類熱圖分析。當(dāng)|log2FC|≥1，Plt;0.05 認(rèn)為2 組間circRNA 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 GO和KEGG功能富集分析

基因本體論（gene ontology，GO）通過定義基因產(chǎn)物的功能，被廣泛應(yīng)用于基因、基因產(chǎn)物和序列注釋。京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）用于分析基因的潛在生物學(xué)功能。本研究對(duì)cir?cRNA對(duì)應(yīng)的來源基因進(jìn)行富集分析，以闡明受circRNA影響的特定生物學(xué)過程，深入了解其作用機(jī)制。當(dāng)Plt;0.05，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率小于0.1時(shí)被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，得到基因集富集結(jié)果。

1.6 circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用circBase數(shù)據(jù)庫獲取差異circRNA基本信息。通過circinteractome數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)前10個(gè)上調(diào)circRNA和前10個(gè)下調(diào)circRNA 吸附miRNA。使用miRDB、miRTarBase 和Tar?getScan 數(shù)據(jù)庫同時(shí)預(yù)測(cè)miRNA 結(jié)合靶mRNA，篩選出3個(gè)數(shù)據(jù)庫同時(shí)預(yù)測(cè)到的miRNA結(jié)合mRNA?？梢暬治鍪褂肅ytoscape 3.9.0完成。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證circRNA表達(dá)

鑒于circRNA的表達(dá)量變化差異及重要性，本研究選擇8個(gè)差異表達(dá)circRNAs，根據(jù)circRNA引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)特異性引物。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-timePCR，qRT-PCR）檢測(cè)與微陣列分析相同的樣本中circRNA相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)一步檢測(cè)所有樣本具有最高意義的2個(gè)cir?cRNAs。用Trizol試劑提取PBMCs樣本中總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RT Master Mix for qPCR，MCE，USA）的說明合成cDNA，采用熒光染料法進(jìn)行擴(kuò)增。使用的SYBR GreenqPCR Master Mix購自MCE公司，特異性引物由上海生工合成，見表2。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R 4.2.2、IBM SPSS 25.0和GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行繪圖和統(tǒng)計(jì)分析。使用來自至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2組間比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)（%）表示，采用卡方檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)circRNA篩選

芯片掃描得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化后繪制散點(diǎn)圖和火山圖。如圖2A散點(diǎn)圖所示，2組數(shù)據(jù)總體分布集中趨勢(shì)較好，表明歸一化結(jié)果可靠。如圖2B火山圖所示，與健康對(duì)照組相比，CHB患者PBMCs中共有870個(gè)circRNAs的表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，包括321個(gè)表達(dá)上調(diào)circRNAs和549個(gè)表達(dá)下調(diào)circRNAs。分層聚類分析表明，circRNA在2組樣本中的表達(dá)模式具有差異（圖2C）。表3展示前10個(gè)上調(diào)和下調(diào)circRNAs。

2.2 差異circRNA特征分析

為了進(jìn)一步了解差異circRNA，對(duì)CHB患者和健康對(duì)照組PBMCs中上調(diào)和下調(diào)circRNA進(jìn)行了特征分析。結(jié)果如圖3A所示，這些差異表達(dá)circRNA廣泛分布在除性染色體Y以外的所有染色體中，其中1號(hào)和2號(hào)染色體承載數(shù)量最多的circRNA。本研究統(tǒng)計(jì)了870 個(gè)差異circRNA 的產(chǎn)生方式，其中88.85%的circRNA來源于exon的剪接，7.47%的差異circRNA 來源于intergenic，極少數(shù)來源于intron（圖3B）。大多數(shù)失調(diào)的circRNA的長(zhǎng)度小于2000個(gè)核苷酸，中位長(zhǎng)度為733.5個(gè)核苷酸（圖3C）。

2.3 circRNA來源基因功能通路分析

GO富集通路結(jié)果顯示上調(diào)circRNA來源基因顯著富集在細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞分化和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等生物學(xué)術(shù)語（圖4A），而下調(diào)circRNA主要在囊泡、細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架富集較多（圖4B）。KEGG富集分析表明，CHB中上調(diào)circRNA來源基因涉及幾種常見的通路，mTOR信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移和Rap1信號(hào)通路（圖4C）。下調(diào)circRNA來源基因除了富集于常見的白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、ErbB 信號(hào)通路和Rap1 信號(hào)通路外，還參與多種細(xì)菌感染（耶爾森氏菌感染、致病性大腸桿菌感染）通路（圖4D）。

2.4 circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

為進(jìn)一步探索差異circRNA在CHB中的潛在作用，本研究擬構(gòu)建circRNA、miRNA及mRNA組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)探尋其相互作用關(guān)系。首先，通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)得到前10個(gè)上調(diào)和下調(diào)circRNA 的吸附miRNA。接下來，通過miRDB、miRTarBase 和TargetScan 在線數(shù)據(jù)庫共同預(yù)測(cè)上述得到的miRNA對(duì)應(yīng)的mRNA，得到639個(gè)miRNA-mRNA對(duì)，其中存在427個(gè)重復(fù)基因。最后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0顯示該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)包括11個(gè)circRNA節(jié)點(diǎn)，17個(gè)miRNA節(jié)點(diǎn)以及212個(gè)mRNA節(jié)點(diǎn)，如圖5所示。

2.5 差異circRNA表達(dá)驗(yàn)證

首先使用qRT-PCR 檢測(cè)與芯片分析相同的CHB 患者和健康對(duì)照組PBMC 中circRNA 表達(dá)。與對(duì)照組相比，hsa_circ_0018744、hsa_circ_0018455、hsa_circ_0055625 及hsa_circ_0000081 表達(dá)在CHB 組中顯著上調(diào)（F=2.832，Plt;0.01；F=0.205，Plt;0.05；F=1.225，Plt;0.05；F=2.439，Plt;0.01），同時(shí)，與對(duì)照組比較，hsa_circ_0015269、hsa_circ_0085744和hsa_circ_0080913 的表達(dá)在CHB 組中顯著下調(diào)（F=38.335，Plt;0.01；F=2.414，Plt;0.01；F=15.367，Plt;0.01），但hsa_circ_0028075表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.541，P=0.053；圖6A）。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)與24例健康對(duì)照組比較，hsa_circ_0018744表達(dá)在24 例CHB 患者中明顯上調(diào)（F=4.382，Plt;0.01），hsa_circ_0085744表達(dá)顯著下調(diào)（F=4.906，Plt;0.05；圖6B）。以上結(jié)果與芯片檢測(cè)一致，表明芯片結(jié)果具有可靠性。

3 討論

本研究采用高通量芯片技術(shù)，展示CHB 患者PBMCs中circRNA表達(dá)譜，探究了CHB患者發(fā)生發(fā)展的潛在調(diào)控機(jī)制。芯片表達(dá)譜分析結(jié)果表明，與健康對(duì)照組相比，大量circRNAs在CHB中具有差異表達(dá)，且差異倍數(shù)在2 倍以上，表明這些差異cir?cRNAs可能與CHB的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。CHB相關(guān)差異circRNA來源基因GO分析結(jié)果表明細(xì)胞發(fā)育生長(zhǎng)、細(xì)胞分化和活性調(diào)節(jié)是明顯富集的生物學(xué)過程。KEGG富集分析顯示，來源基因主要在白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、mTOR 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路和Rap1信號(hào)通路中富集。以上結(jié)果提示感染通路、免疫和炎癥反應(yīng)在CHB中明顯失調(diào)，表明差異表達(dá)circRNA 可能在HBV 感染和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[15-18]。

本研究通過生物信息學(xué)分析分別預(yù)測(cè)circRNA和mRNA 的多個(gè)miRNA 吸附位點(diǎn)。在預(yù)測(cè)的cir?cRNA吸附miRNA中，miR-212-3p在HBeAg處理的細(xì)胞中上調(diào)，并通過靶向MAPK1抑制炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生[19]。其他吸附miRNA與CHB的發(fā)病機(jī)制是否相關(guān)尚需進(jìn)一步研究。此外，TGFBR2[20]、IGF1R[21]和DDX17[22]等靶mRNA與HBV感染和CHB相關(guān)疾病之間存在密切聯(lián)系。通過qRT-PCR證實(shí)，7個(gè)circRNAs相對(duì)表達(dá)量與芯片表達(dá)的趨勢(shì)基本一致，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性。特別地，本研究選擇差異表達(dá)最明顯的circRNAs在所有患者中進(jìn)行qRTPCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，hsa_circ_0018744和hsa_circ_0085744在CHB患者中明顯失調(diào)。盡管目前還未見這些差異circRNAs與HBV感染相關(guān)的報(bào)道，有研究證實(shí)這些circRNAs與某些疾病的相關(guān)性[23-24]。另有報(bào)道發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0018744和hsa_circ_0085744 來源基因DDIT4 和PTK2 可能是HBV 相關(guān)HCC 的潛在診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物[25-26]。以上結(jié)果均表明hsa_circ_0018744 和hsa_circ_0085744可能作為CHB的潛在有價(jià)值的新型標(biāo)志物。

綜上所述，鑒于circRNA在疾病或病毒中的重要作用，本研究基于高通量芯片技術(shù)篩選并驗(yàn)證CHB中差異表達(dá)的circRNA。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)circRNAs 可能參與CHB 的發(fā)病機(jī)制，作為CHB患者潛在的治療靶點(diǎn)。本研究的局限性在于circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的潛在機(jī)制尚不清楚，未通過具體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證準(zhǔn)確性。接下來的研究應(yīng)進(jìn)一步驗(yàn)證這些候選標(biāo)志物在體內(nèi)和體外對(duì)CHB的影響。