【關鍵詞】膿毒癥；延髓內臟帶；膽堿能抗炎通路；神經炎癥

【中圖分類號】R114 【文獻標志碼】A 【收稿日期】2023-07-31

早期感染引起的失控的系統(tǒng)炎癥風暴與高死亡率密切相關[1]，抗炎治療可以顯著改善膿毒癥患者的死亡率和預后[2]，表明控制膿毒癥系統(tǒng)性炎癥對改善患者預后的重要性。雖然神經-免疫交互作用在調控系統(tǒng)性炎癥方面取得重要進展[3]，但炎癥調控的神經中樞在膿毒癥中的病理改變及其干預效應尚未明了。延髓內臟帶（medullary visceral zone，MVZ）是迷走神經調控系統(tǒng)性炎癥的初級中樞，同時將外周炎癥信息傳輸到高級神經中樞并接受高級中樞的調控[4]，其在系統(tǒng)性炎癥的調控中具有關鍵的作用。先前的研究證實：MVZ通過膽堿能抗炎途徑（cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP）有效地調節(jié)系統(tǒng)炎癥和免疫，選擇性α7煙堿乙酰膽堿受體激動劑3-（2，4-二甲氧基苯基）丙烯堿（GTS-21）明顯降低炎癥介質的血清水平[5]，例如可溶性CD14（Presepsin）、高遷移率族蛋白-1（high mobilitygroup box-1，HMGB-1）、白細胞介素（interleukin，IL）-10、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、TH17淋巴細胞百分比；相反，一種強有力的選擇性尼古丁乙酰膽堿受體拮抗劑甲基牛扁亭（methylly?caconitine，MLA）會惡化膿毒癥的系統(tǒng)炎癥和免疫功能[6-7]。已知GTS-21 和MLA 都可以穿過血腦屏障[8-9]，同時，CAP具有廣泛的中樞調節(jié)作用，如認知功能和系統(tǒng)性炎癥[10-11]，因此，GTS-21和MLA除了在外周激活或拮抗CAP影響系統(tǒng)性炎癥外，是否會進入中樞，直接影響CAP的調節(jié)中樞（MVZ）的神經炎癥并影響其結構與功能，從而進一步影響其對系統(tǒng)性炎癥的調控尚不得而知。

研究表明[12-13]：系統(tǒng)炎癥會誘導MVZ的神經炎癥，導致自主的調控紊亂。臨床上，重癥監(jiān)護室確診為膿毒癥腦病的患者與無腦病的患者相比，死亡率顯著提高[14]。由此推測，MVZ在膿毒癥早期階段受到全身性炎癥的攻擊，這可能是膿毒癥誘導CAP調節(jié)功能紊亂和早期炎性風暴的重要機制。因此在前期研究的基礎上，本研究擬探索膿毒癥誘導的MVZ 的病理改變，關鍵神經元的凋亡及其功能狀態(tài)，MVZ神經炎癥，損傷及修復相關的基因表達，以明確前期驗證的膿毒癥誘導CAP功能低下的原因，同時，以CAP激活與拮抗進行干預以探索其對MVZ病理的干預效應，從而探明膿毒癥誘導的MVZ的病理改變并證實中樞CAP的干預可能成為膿毒癥系統(tǒng)性炎癥與免疫紊亂的重要手段。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠（周齡：6周）64只，許可證號：SYXK（鄂）2018-0104；購自三峽大學實驗動物中心[出售許可證號：SCXK（鄂）2017-0012]，動物飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學動物房。光照/黑暗時間為12/12 h。溫度控制在（22±2） ℃。濕度保持在（60±10）%。進食及飲水自由。大鼠適應性喂養(yǎng)7 d之后開始實驗。所有操作均嚴格按照實驗動物關愛和使用協(xié)定指南執(zhí)行（IACUC），并得到貴陽市第一人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，批號：2019007。

1.2 主要試劑

GTS-21，貨號：29834（dihydrochloride MCE）；MLA，貨號：HY-N2332A/CS-0021211（MCE）；熒光（FITC）標記羊抗兔IgG，武漢博士德生物，貨號：BA1105；熒光（Cy3）標記羊抗小鼠IgG：武漢博士德生物，貨號：BA1031；Anti-caspase 3，武漢三鷹生物，貨號：66470-2-IG；Anti-Tyrosine Hydroxylase，武漢博士德生物，貨號：BM4568；Anti-Choline acetyltransferase：武漢博士德生物，貨號：bs-2423R；細胞凋亡檢測試劑盒，上海翊圣生物，貨號：40308ES20；DAPI，碧云天，貨號：C1002；Trizol，Aidlab，貨號：252250AX；dNTP，TIANGEN，貨號：#P4325；Taq Plus DNA Polymerase，TIANGEN，貨號：ET105-01。

1.3 主要儀器

病理切片機：德國Leica RM 2016 輪轉式切片機；切片刀：日本羽毛R35一次性刀片；組織攤烤片機：武漢俊杰JK-6生物組織攤烤片機；顯微鏡：奧林巴斯BX53生物顯微鏡；實時熒光定量PCR儀：ABI-QuantStudio 6。

1.4 研究方法

1.4.1 動物及分組、處理方法 大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后按照隨機數字表分為3組并進行相應的干預。對照組8只：正常飼養(yǎng)，不做任何處理；假手術組8只：大鼠剖腹暴露盲腸但不進行穿刺結扎，并予哌拉西林（50 mg/kg，腹腔注射，每天3次，連續(xù)3 d）；膿毒癥組共48只，采用經典的盲腸結扎穿刺法（cecal ligation and puncture，CLP）膿毒癥模型制備[15]，制備成功后隨機再分為3 組，每組16 只。模型組：予哌拉西林（50 mg/kg，腹腔注射，3次/d，連續(xù)3 d）及生理鹽水（1 mL/100 g，腹腔注射，3次/d，連續(xù)3 d）；GTS-21組，哌拉西林使用同膿毒癥組，并以GTS-21（4 mg/kg[16]，腹腔注射，1次/d，連續(xù)3 d）進行干預；MLA 組：哌拉西林使用同膿毒癥組，并以MLA（4.8 mg/kg[17-18]，腹腔注射，1次/d，連續(xù)3 d）進行干預。3 d后處死大鼠取延髓組織分析。采用MSS（Murine Sepsis Score）評分系統(tǒng)對造模進行評價[19]，根據大鼠外觀、意識水平、行為表現(xiàn)、對刺激的反應、睜眼反應、呼吸頻率、呼吸質量等進行綜合積分，一般積分超過4分可認為膿毒癥造模成功，分值越高，表明膿毒癥越嚴重[20]。采用3名實驗人員進行單獨評分，取平均值來評價各組大鼠造模后的病情嚴重程度，見圖1。

1.4.2 病理學觀察 采用灌注取腦的方式，制備大鼠延髓中尾段的石蠟包埋切片，選取延髓組織（最后區(qū)平面到閂平面）石蠟切片脫蠟、蘇木素伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色、用100倍及400倍光學顯微鏡重點觀察孤束核、迷走運動背核與腹外側核組織病理特點，并使用Image J軟件進行手工計數各組切片神經元及神經膠質細胞數量以進行定量分析。

1.4.3 TdT mediated dUTP Nick End Labeling（TUNEL）與細胞凋亡檢測 選取延髓的石蠟包塊，常規(guī)切片脫蠟，PBS潤洗切片，加入2 mg/mL的Proteinase K溶液孵育，在延髓組織上加入TdT孵育緩沖液37 ℃孵育60 min，滴加DAPI復染細胞核，熒光顯微鏡下觀察采集圖像。熒光顯微鏡下組織切片上凋亡的細胞呈紅色熒光，細胞核呈藍色熒光。

運用常規(guī)的標記指數（LI）表示，選取3個高倍視野（400倍），每個高倍視野計數視野標記指數=各視野陽性細胞數/視野所有細胞，每個病例的凋亡指數（AI）等于各視野標記指數的平均值

1.4.4 免疫熒光雙標 選取延髓中尾段的石蠟包埋切片，分別用于標記Caspase 3及膽堿乙酰轉移酶（choline acetyltrans?ferase，CHAT）或酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）的一抗混合物中孵育24 h、然后將切片與熒光標記的二抗（Cy3，F(xiàn)ITC 標記的山羊抗兔IgG）4 h、最后將切片用帶有DAPI 媒介對切片中所有細胞進行核染色，使用奧林巴斯BX53生物顯微鏡拍攝，用image pro（ipp6.0）軟件分析每組3幅圖像，計算平均光密度。

1.4.5 RT-PCR 取大鼠延髓組織50 mg，Trizol 法提取RNA，RT逆轉錄成cDNA，加入所設計的引物（表1），實時熒光定量反應（SYBR Green染料法），繪制擴增曲線及熔解曲線，以β-actin作內參，采用QPCR算法（相對定量，2-ΔΔCt法）計算生長相關蛋白43（grouth associated protein-43，GAP-43）mRNA，少突膠質細胞轉錄因子2（oligodendrocyte transcrip?tion factor 2，Olig-2）mRNA，血管內皮生長因子（vascular en?dothelial growth factor，VEGF）mRNA，膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）mRNA，和基質金屬蛋白（matrix metalloprotein，MMP）-9 mRNA的表達。

1.5 統(tǒng)計學方法

實驗數據用SPSS 19.0軟件包進行統(tǒng)計處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組樣本比較采用單因素方差分析，先進行Leven方差齊性檢驗，方差齊的2組資料之間的比較采用Bonferroni 結果判定；方差不齊的2 組資料的比較以Tamhane結果判定；計數資料以構成比表示。采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

術后第3 天，膿毒癥模型組共死亡9 只，死亡率為：56.3%；GTS-21組死亡8只，死亡率為：50%；MLA組死亡11只，死亡率為：68.8%；對照組與假手術組無死亡。5組死亡率有明顯差異（χ2=14.210，P=0.003），但膿毒癥模型組、GTS-21 組及MLA 組死亡率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.210，P=0.107）。

按照MSS評分規(guī)則，膿毒癥模型組均造模成功（MSS評分均大于15分），因此所有模型均造模成功。膿毒癥模型組，GTS-21組及MLA組評分明顯高于對照組（P=0.000），且MLA組評分明顯高于GTS-21組（P=0.000）[21]。

2.1 腦組織大體標本觀察

5組大鼠延髓外觀沒有明顯的差異，腹側面模型組和MLA組大鼠前正中線稍淺，提示該2組大鼠延髓組織水腫明顯，見圖2。

2.2病理學觀察

對照組和假手術組延髓組織結構清晰，層次分明，孤束核（nucleus tractus solitary，NTS），背側迷走運動核（dorsal va?gus motor nucleus，DVMN），腹內測網狀核（ventrolateral re?ticular nucleus，VLRN）細胞排列整齊，高倍鏡下神經元數量較多，膠質細胞較少；膿毒癥3組可組織水腫明顯，見神經元減少及膠質增生；MLA組神經元較對照組和假手術組明顯減少（123.44±20.20 及112.78±15.59 vs. 80.44±22.44，P=0.001，P=0.024），膠質細胞有增多的趨勢，細胞排列紊亂，5組細胞總數差異無統(tǒng)計學意義。見圖3。

2.3 TUNEL

從5組大鼠MVZ的TUNEL圖像及凋亡指數的柱狀圖可以看出：與對照組及GTS-21組相比，模型組與MLA組大鼠MVZ區(qū)細胞明顯凋亡，凋亡指數（AI）高于對照組（[ 25.40±9.13）% vs. （0.53±0.09）%，P=0.000]，GTS-21具有降低膿毒癥導致的凋亡的趨勢（[ 17.03±4.16）% vs.（ 25.40±9.13）%，P=0.000]，MLA 較GTS-21 增加凋亡（[ 29.11±4.60）% vs.（17.03±4.16）%，P=0.000]，見圖4。

2.4 免疫熒光雙標（CHAT，TH/Caspase 3）

各組TH/ Caspase 3及CHAT/Caspase 3免疫熒光雙標的結果顯示膿毒癥誘導MVZ兒茶酚能神經元和膽堿能神經元較對照組Caspase 3 表達顯著升高（0.001 94±0.000 72 vs.0.000 39±0.000 34；0.003 38±0.001 25 vs. 0.000 39±0.000 28，P=0.021，P=0.000），TH 表達顯著降低（0.001 62±0.000 73vs. 0.004 58±0.001 48，P=0.000），但CHAT僅有下降的趨勢（0.003 70±0.002 82 vs. 0.005 27±0.001 86，P=0.761）；GTS-21具有降低膿毒癥兒茶酚胺能和膽堿能神經元Caspase 3表達（0.002 53±0.001 02 vs. 0.003 38±0.001 25；0.001 16±0.000 82 vs. 0.001 94±0.000 72，P=0.741，P=0.002），并上調膿毒癥TH 與CHAT 表達的趨勢（其結果分別為0.002 58±0.000 69，0.004 85±0.001 51，P=0.488，P=0.994）；MLA 則促進膿毒癥導致的兒茶酚胺能和膽堿能神經元Caspase 3表達（0.003 61±0.001 91，0.003 73±0.001 07，P=0.066，P=0.000），顯著降低TH與CHAT表達（0.001 17±0.000 69，0.002 41±0.000 47，P=0.000，P=0.019），見圖5、6。

2.5 RT-PCR

以β-actin 作內參，計算GAP-43 mRNA，GFAP mRNA，VEGF mRNA，MMP-9 mRNA and" Olig-2 mRNA相對表達量。這些基因的表達與神經炎癥，損失，修復，髓鞘化，膠質化等神經重塑密切相關。與對照組相比，膿毒癥顯著上調了關鍵基因GAP-43 mRNA、GFAP mRNA、VEGF mRNA 和MMP-9mRNA 的表達（2.188±0.238 vs. 1.022±0.231，2.825±0.267vs. 1.071±0.062，3.689±0.320 vs. 1.060±0.120，3.169±0.241 vs. 1.073±0.153，P=0.000），下調了Olig-2 mRNA的表達（0.534±0.067 vs. 1.027±0.172，P=0.000）。GTS-21 的干預下調了膿毒癥GAP-43 mRNA、GFAP mRNA、VEGF mRNA和MMP-9 mRNA的表達（1.655±0.125，1.676±0.106，2.085±0.308，2.043±0.255，P=0.000，P=0.195，P=0.005，P=0.002），具有上調Olig-2 mRNA的表達趨勢（0.718±0.068，P=0.001）；反之，與GTS-21相比，MLA則顯著上調了GAP-43 mRNA、GFAP mRNA、VEGF mRNA和MMP-9 mRNA的表達（3.029±0.180，3.756±0.376，4.768±0.342，3.949±0.408，P=0.000），顯著下調了Olig-2 mRNA 的表達（0.232±0.053，P=0.000），見圖7。

3 討論

研究表明[22-23]：在膿毒癥大鼠的中樞，LPS能通過Toll-like receptor 4激活星形膠質細胞，產生促炎細胞因子，誘導神經炎癥；此外，外周血循環(huán)中的細胞因子也能通過破損的血腦屏障進入中樞，直接誘導神經炎癥[24-25]。神經炎癥可通過抑制核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）/STAT3/ERK通路和線粒體介導的凋亡誘導神經細胞凋亡，神經變性及代謝紊亂[26-27]，并影響區(qū)域神經功能。據此，并結合前期研究[21]推測，膿毒癥可誘導MVZ的神經炎癥并影響其對系統(tǒng)性炎癥的調控，可能與膿毒癥早期失控的炎癥風暴相關，基于α7nAChR激活可通過多種途徑保護神經元免受炎癥的攻擊[28]，激活α7nAChR遏制膿毒癥的炎癥風暴可能涉及到其對中樞MVZ神經元的保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然膿毒癥早期大鼠腦組織的外觀無明顯改變，但HE染色發(fā)現(xiàn)，膿毒癥各組MVZ神經元明顯下降，神經膠質細胞明顯增生，表明膿毒癥誘導的神經炎癥通過氧化應激，導致MVZ神經元損傷與凋亡；同時，神經炎癥可能上調了GFAP，使膠質細胞數量增加并處于活化狀態(tài)。

進一步的TUNEL實驗證實了膿毒癥誘導MVZ神經元凋亡及膽堿能抗炎通路中樞干預具有明確的效果，GTS-21能明顯減少膿毒癥MVZ細胞凋亡，而MLA則可使凋亡進一步加重的趨勢，驗證了中樞CAP 激活能發(fā)揮抗凋亡作用。研究證實[29-31]：CAP終端分泌的乙酰膽堿能激活小膠質細胞表面的α7nAChR，α7nACHR被激活后通過Janus激酶/信號轉導及轉錄激活因子（janus kinase/signal transducersand activator of transcription，JAK/STAT）信號通路，NF-κB 信號轉導通路，從而減少腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、高遷移率族蛋白1、白細胞介素-1β、白細胞介素-6等炎癥因子的產生，并提高白細胞介素-10等抗炎因子水平，減少小膠質細胞激活，使小膠質細胞生長受到限制，從而快捷有效地抑制神經炎癥，減少凋亡。

MVZ區(qū)域包含多種類型的神經元，膽堿能神經元直接參與系統(tǒng)性炎癥的調控[32]；兒茶酚胺能神經元投射到迷走神經背側運動核和延髓網狀結構，也參與了MVZ 對炎癥與免疫及應激反應的調控[33]。為進一步驗證2種神經元的活性及凋亡情況，本課題組進行了CHAT/Caspase 3 and TH/Caspase 3免疫熒光雙標記測定，結果表明：膿毒癥導致2種神經元明顯凋亡，伴隨凋亡，TH表達明顯下降，GTS-21明顯減少了兒茶酚胺能神經元的凋亡并增加TH 表達，MLA明顯增加了兒茶酚胺能神經元的凋亡并進一步降低了TH 的表達；GTS-21 能升高膿毒癥CHAT 表達的趨勢，MLA 則明顯降低膿毒癥CHAT表達。提示激活中樞CAP能降低神經炎癥水平，在抗凋亡同時，改善腦組織損傷，并提高了功能神經元的活性[34-35]。在此，本課題組發(fā)現(xiàn)膿毒癥對膽堿能神經元和兒茶酚胺能神經元影響并不同步，伴隨著MVZ 神經元凋亡的加重，TH 表達同步降低，而CHAT表達并無明顯影響，可能與膿毒癥促使MVZ膽堿能系統(tǒng)功能活化，以增加迷走輸出，從而發(fā)揮系統(tǒng)性抗炎的重要機制[36-37]，也間接表明MVZ中對炎癥起調節(jié)作用的主要為膽堿能神經元。

病理學研究提示，膿毒癥導致MVZ神經凋亡及組織重構，即膠質細胞增生及神經元減少。為進一步明確MVZ神經組織重構的傾向及調控機制，本課題組依次檢測了各組GAP-43 mRNA，Olig-2 mRNA，VEGF mRNA，GFAP mRNA，MMP-9 mRNA 表達水平。與對照組比較，GAP-43 mRNA，VEGF mRNA，GFAP mRNA，MMP-9 mRNA 在膿毒癥模型組中表達明顯上調，Olig-2 mRNA表達則明顯下調；GTS-21可明顯降低GAP-43 mRNA，VEGF mRNA，GFAPmRNA，MMP-9 mRNA 的表達，提升Olig-2 mRNA表達；MLA則相反。

GAP-43涉及到神經元的再生，軸突的延伸，突觸發(fā)育與重建調控，從而恢復受損的神經功能[38-39]，根據神經受損的情況而動態(tài)改變其表達水平[40]，與神經炎癥，神經損傷和修復相關。MMP是一類具有重構細胞外基質功能的蛋白酶[41-42]，在神經組織受到各種生理刺激和病理損傷后，神經炎癥水平升高，從而促使其含量，活性和基因表達水平明顯上調，通過控制樹突棘的形狀和興奮性突觸的功能參與突觸可塑性的動態(tài)調節(jié)[43-44]，其表達可反應神經炎癥的水平。GFAP是神經炎癥的生物標記物[45-46]，其表達增高表明膠質細胞的激活和神經組織的膠質化。血管內皮生長因子（vascular endothelialgrowth factor，VEGF）通過刺激內皮細胞遷移，增殖和生成成來促進血管新生，也與神經損傷，神經炎癥，神經恢復等相關[47-48]。本研究可以看出，膿毒癥導致其MVZ神經炎癥，神經損傷與修復。GTS-21能抑制神經炎癥，促進神經恢復；MLA則惡化神經炎癥。因此，膿毒癥誘導的炎癥風暴與MVZ 的損傷，CAP調控紊亂相關，干預中樞CAP對系統(tǒng)性炎癥有重要影響。Olig-2是少突膠質細胞特異性標記物，其表達的下降提示髓鞘化降低[49]，Olig-2水平升高與髓鞘破壞后代償性再生有關[50]。可見前期研究所示膿毒癥導致心率變異性下降與膿毒癥誘導的神經炎癥進一步導致髓鞘化異常，從而導致CAP指令傳出障礙相關。GTS-21 通過抗炎而促進髓鞘化，MLA則惡化神經炎癥，加劇髓鞘破壞而進一步損傷CAP對外周炎癥風暴的調控。

本研究揭示了MVZ的神經炎癥可能是膿毒癥系統(tǒng)性炎癥調控紊亂的重要機制，中樞CAP的激活可能成為遏制膿毒癥早期炎癥風暴的有效干預措施。但本研究亦有以下不足：首先，本研究沒有直接探索MVZ的神經炎癥及干預CAP對外周CAP調控的影響，比如對迷走神經電活動及脾組織釋放乙酰膽堿的影響，因此尚不能完全說明中樞MVZ的病理損害及干預是否為系統(tǒng)性炎癥失控及干預的根本原因。此外，本研究采用腹腔給予α7nAChR的激動劑與拮抗劑進行干預，因其對中樞及外周都有作用，究竟是對系統(tǒng)性炎癥的直接干預導致MVZ的病理變化，還是因為直接干預MVZ的炎癥導致系統(tǒng)性炎癥水平的變化為主，尚不能完全明確。最后，Olig-2 mRNA表下調是否意味著MVZ脫髓鞘，從而導致CAP的傳出障礙與系統(tǒng)性炎癥的失控，需要進一步證實。下一步，本研究將聚焦以上幾個問題進一步探索，為中樞抗炎，促髓鞘化等手段治療膿毒癥提供理論基礎。

本研究初步證實了膿毒癥誘導MVZ神經炎癥、功能神經元凋亡及活性的改變、髓鞘化異常等，從而導致CAP 對系統(tǒng)性炎癥的調控障礙，可能是膿毒癥誘導炎癥風暴的重要機制；膽堿能抗炎通路的干預能明顯影響上述過程。激活α7nAChR可改善MVZ 中樞病理結構，使其向“正?；狈较虬l(fā)展，可能是其遏制外周炎癥風暴的重要機制之一；而α7nAChR的拮抗劑則相反，因此，抑制MVZ神經炎癥可能成為膿毒癥炎癥失控的重要干預靶點。