【關(guān)鍵詞】黨參多糖；瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞；增殖；細(xì)胞周期；PI3K/AKT信號(hào)通路

【中圖分類號(hào)】R739 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2024-01-02

瘢痕疙瘩是良性皮膚纖維增生性腫瘤，其生長(zhǎng)超出原始傷口邊緣的邊界并侵入鄰近組織。瘢痕疙瘩是自發(fā)的或在真皮的傷口愈合過(guò)程中產(chǎn)生的，未經(jīng)治療很少會(huì)消退[1]。此外，因其復(fù)發(fā)率很高，瘢痕疙瘩的治療長(zhǎng)期以來(lái)一直是整形外科醫(yī)生的治療難點(diǎn)[2]。目前已經(jīng)采用了多種形式的治療方法，包括手術(shù)切除，放療，皮質(zhì)類固醇注射，物理治療以及這些治療方法的組合，但是，還沒(méi)有令人滿意的治療方法[3]。近來(lái)，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到瘢痕疙瘩的主要病理特征為成細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過(guò)度累積以及纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖[4]。黨參多糖（codonopsis pilosula polysaccharide，CPP）是一種從黨參中提取的常用的活性化合物，已被確定具有抗疲勞，抗氧化，提高免疫力，以及抗腫瘤等多種藥理活性[5-6]。據(jù)報(bào)道，CPP能夠通過(guò)磷脂酰肌醇-3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/絲蘇氨酸蛋白激酶（protein kinase B，AKT）通路抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[7]。先前的研究提供了證據(jù)，表明天然物質(zhì)能夠通過(guò)抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖及ECM的沉積，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為瘢痕疙瘩的臨床治療提供新的方向[8]。然而，CPP是否能減輕瘢痕疙瘩的病理過(guò)程尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在探究CPP對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響及其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞由上海信裕生物科技有限公司提供；黨參多糖（純度≥98%）、四唑鹽比色測(cè)定法[3-（4，5-Di?methylthazol-2-yl） -2， 5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]、RIPA裂解液購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；胎牛血清，杜氏改良eagle培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM），膜聯(lián)蛋白v-異硫氰酸酯（Annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑和比霉素酸測(cè)定法（bicinchoninic acid assay，BCA）蛋白定量測(cè)定試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)研究所；增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、細(xì)胞周期蛋白（Cyclin D1）、Ⅰ型膠原蛋白（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型膠原蛋白（Collagen Ⅲ）、磷脂酰肌醇激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）和絲蘇氨酸蛋白激酶（proteinkinase B，AKT）、磷酸化的磷脂酰肌醇-3 激酶（phospho-phosphoinositide 3-kinase，p-PI3K）和磷酸化的絲蘇氨酸蛋白激酶（phospho-proteinkinase B，p-AKT）單克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶聯(lián)的二抗購(gòu)于美國(guó)CST公司；十二烷基磺酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒購(gòu)于北京雷根生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO₂ 條件下，培養(yǎng)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞。

1.2.2 MTT檢測(cè) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞接種至96 孔板中，采用不同濃度（0、10、20、40、80、160、320 μmol/L）的黨參多糖干預(yù)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，24 h時(shí)后10 μL MTT 試劑加入至各孔中共孵育4 h。棄上清，將150 μL二甲基亞砜加入到每孔中以溶解MTT結(jié)晶。最后記錄570 nm處的光密度值（optical density，OD值），隨后計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 對(duì)數(shù)期的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞種至6孔板中，不同濃度黨參多糖處理24 h后，消化細(xì)胞并收集，采用磷酸緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌3次，以500 μL緩沖液重懸細(xì)胞，依次加入250 μL PI和10 μLRnaseA染液，37 ℃避光反應(yīng)30 min，上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期比例分布。收集處理24 h后的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為106 個(gè)/mL，使用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 對(duì)數(shù)期的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞種至6孔板中，接種密度為3×10²個(gè)細(xì)胞，采用不同濃度（0、10、20、40 μmol/L）的黨參多糖干預(yù)細(xì)胞，每隔2 d更換1次培養(yǎng)液，2周后待肉眼可見(jiàn)細(xì)胞克隆時(shí)，采用甲醇固定，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，以細(xì)胞克隆形成數(shù)反映細(xì)胞克隆形成能力。

1.2.5 Western blot檢測(cè) 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞以不同濃度（0、10、20、40 μmol/L）的黨參多糖干預(yù)24 h，收集細(xì)胞，RIPA提取總蛋白，采用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞濃度。 隨后分離蛋白標(biāo)本并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。采用相應(yīng)一抗稀釋液（PCNA、Cyclin D1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、PI3K、AKT、p-PI3K和p-AKT均為1：800稀釋）于膜4 ℃下孵育12 h，取出膜再與HRP 標(biāo)記的IgG 二抗室溫孵育2 h，以ECL化學(xué)發(fā)光進(jìn)行顯影，使用Image J評(píng)估信號(hào)強(qiáng)度，采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydroge?nase，GAPDH）為內(nèi)參分別計(jì)算PCNA、Cyclin D1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、PI3K、AKT、p-PI3K 和p-AKT 蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0版軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間差異和2組間差異比較分別采用單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 黨參多糖對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞存活率的影響

采用MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于0 μmol/L組（[ 100.00±9.62）% ]，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的存活率在80 μmol/L（[ 80.04±8.11）%]、160 μmol/L（[ 63.42±6.06）%]、320 μmol/L（[ 41.38±4.27）%]的黨參多糖處理下降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=20.769，P=0.000）。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇無(wú)明顯細(xì)胞毒性作用的3個(gè)濃度（10、20、40 μmol/L）作為黨參多糖加藥標(biāo)準(zhǔn)濃度。

2.2 黨參多糖對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞克隆形成能力的影響

采用平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)黨參多糖對(duì)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞克隆形成能力的影響，結(jié)果顯示（表1），10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L黨參多糖干預(yù)組細(xì)胞克隆形成數(shù)相較于0 μmol/L 處理組明顯減少（F=68.423，P=0.000），此外，PCNA的表達(dá)在10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L黨參多糖干預(yù)組細(xì)胞中的表達(dá)較0 μmol/L處理組明顯下調(diào)（F=78.926，P=0.000，圖1 和表1）；Cyclin D1 的表達(dá)在10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L 黨參多糖干預(yù)組細(xì)胞中的表達(dá)較0 μmol/L處理組也明顯下調(diào)（F=45.578，P=0.000，圖1和表1），且隨黨參多糖濃度的升高細(xì)胞克隆形成能力、PCNA 和Cyclin D1的表達(dá)隨之降低，具有濃度依賴性。

2.3 黨參多糖對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞周期進(jìn)程的影響

表2結(jié)果顯示，與0 μmol/L組相比，20 μmol/L、40 μmol/L黨參多糖干預(yù)組G₀/G₁期細(xì)胞比例升高；與0 μmol/L組相比，20 μmol/L、40 μmol/L 黨參多糖干預(yù)組G₂/M 期細(xì)胞比例降低；與10 μmol/L和20 μmol/L組相比，40 μmol/L黨參多糖干預(yù)組G₀/G₁期細(xì)胞比例升高；與10 μmol/L和20 μmol/L組相比，40 μmol/L黨參多糖干預(yù)組G2/M期細(xì)胞比例降低。以上比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（G₀/G₁期，F(xiàn)=14.159，P=0.002；G₂/M期，F(xiàn)=17.580，P=0.001）。

2.4 黨參多糖對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與0 μmol/L組相比，20 μmol/L、40 μmol/L黨參多糖干預(yù)組細(xì)胞中Collagen Ⅰ的表達(dá)下調(diào)；與0 μmol/L組相比，20 μmol/L、40 μmol/L黨參多糖干預(yù)組細(xì)胞中Collagen Ⅲ的表達(dá)下調(diào)；與10 μmol/L組相比，20 μmol/L和40 μmol/L 黨參多糖干預(yù)組細(xì)胞中Collagen Ⅰ的表達(dá)下調(diào)；與10 μmol/L組相比，20 μmol/L和40 μmol/L黨參多糖干預(yù)組細(xì)胞中Collagen Ⅲ的表達(dá)下調(diào)；與20 μmol/L 組相比，40 μmol/L黨參多糖干預(yù)組細(xì)胞中Collagen Ⅰ的表達(dá)下調(diào)；與20 μmol/L 組相比，40 μmol/L 黨參多糖干預(yù)組細(xì)胞中Collagen Ⅲ的表達(dá)下調(diào)（圖2和表3）。以上比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Collagen I，F(xiàn)=113.600，P=0.000；Collagen Ⅲ，F(xiàn)=67.867，P=0.000）。

2.5 黨參多糖對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)黨參多糖對(duì)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示（圖3），與0 μmol/L組（6.41±1.23）相比，10（12.94±2.41）、20（18.81±2.73）、40 μmol/L（26.47±4.05）黨參多糖干預(yù)組細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=28.066，P=0.000），且隨黨參多糖濃度的升高細(xì)胞凋亡率隨之升高，具有濃度依賴性。

2.6 黨參多糖對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路激活水平的影響

如圖4 和表4 所示，Western blot 檢測(cè)顯示，相較于0 μmol/L組，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L黨參多糖干預(yù)的人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中p-PI3K 的表達(dá)升高；相較于0 μmol/L 組，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L黨參多糖干預(yù)的人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中p-AKT的表達(dá)升高；且隨黨參多糖濃度的升高細(xì)胞中p-PI3K和p-AKT的表達(dá)隨之升高，具有濃度依賴性。以上比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p-PI3K，F(xiàn)=72.797，P=0.000；p-AKT，F(xiàn)=70.897，P=0.000）。

3 討論

瘢痕疙瘩是一種皮膚纖維增生性疾病，通常伴有觸覺(jué)，疼痛和瘙癢感喪失，以及其他身體和社會(huì)心理癥狀，包括關(guān)節(jié)活動(dòng)受限，焦慮，抑郁，自尊心低下等[9]。瘢痕疙瘩通常在皮膚傷口異常愈合后繼發(fā)，并以侵入性方式生長(zhǎng)，并延伸到原始受傷的組織區(qū)域之外。組織病理學(xué)檢查顯示，與正常皮膚相比，瘢痕疙瘩的特征在于成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖，成肌纖維細(xì)胞比例增加以及ECM成分（Collagen Ⅰ和Collagen" Ⅲ）的過(guò)多沉積[10-11]。ECM 膠原蛋白合成的增加被認(rèn)為與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的過(guò)度活化有關(guān)[12]。盡管使用了多種治療方式來(lái)治療瘢痕疙瘩，例如局部手術(shù)切除結(jié)合放療，激光治療，冷凍療法和化學(xué)療法，但臨床效果仍不令人滿意。由于瘢痕疙瘩切除術(shù)后復(fù)發(fā)率高，經(jīng)典的抗瘢痕疙瘩藥物5-氟尿嘧啶通常在手術(shù)后被用作輔助化療藥物[13]。盡管已開(kāi)發(fā)出各種小分子化合物來(lái)改善瘢痕疙瘩治療的臨床結(jié)果，但它們的低藥效和多種不良副作用仍需要更先進(jìn)的解決方案。中藥治療作為傳統(tǒng)的治療方法，具有毒副作用小等特點(diǎn)，目前研究已顯示其在治療瘢痕疙瘩中具有巨大的潛力[14]。例如，Tang ZM等[15]通過(guò)體內(nèi)和體外研究表明，五倍子軟膏通過(guò)抑制成纖維細(xì)胞增殖和促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡來(lái)抑制瘢痕疙瘩的形成，潛在的機(jī)制涉及p-Akt和p-mTOR的下調(diào)以及磷酸酶和張力蛋白同源（phosphatase and tensin homolog，PTEN）的上調(diào)。白藜蘆醇能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，對(duì)瘢痕疙瘩起到治療的作用[16]。黃芩素通過(guò)促進(jìn)miR-29 的表達(dá)并激活p38MAPK/JNK途徑減弱瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞活力并抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth fac?tor-β1，TGF-β1）誘導(dǎo)的總可溶性膠原蛋白以及1型膠原蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscleactin，α-SMA）的表達(dá)，來(lái)阻礙瘢痕形成[17]。本研究中，CPP能夠有效抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且可有效抑制膠原蛋白的合成，這些結(jié)果提示黨參多糖可能用于治療瘢痕疙瘩。

CPP是一種天然的化合物，存在于中藥黨參干燥的根中。在過(guò)去的十年中，CPP在抗癌治療中獲得了很多關(guān)注，因其在抗癌作用中的抗增殖和促凋亡特性而被公認(rèn)[18]。早期Xin T等[19]研究顯示，CPP可有效抑制上皮性卵巢癌HO-8910細(xì)胞的侵襲和遷移，而且還對(duì)腫瘤細(xì)胞具有有效的抗增殖作用。最近研究顯示，CPP能夠抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，其潛在機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT通路有關(guān)[7]。已鑒定成纖維細(xì)胞不受控制的增殖對(duì)于瘢痕疙瘩形成是必不可少的[20]。瘢痕疙瘩在某種程度上表現(xiàn)出永生地生長(zhǎng)，類似于腫瘤組織。在本研究觀察到CPP處理可抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞周期至G₀/G₁期，抑制膠原蛋白Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表達(dá)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這表明使用CPP治療瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞具有治療價(jià)值。此前，已證明PI3K/AKT 信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖，分化，凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)[21]。先前已經(jīng)描述了PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)參與瘢痕疙瘩細(xì)胞異常功能中，提示能夠有效抑制PI3K/AKT途徑的藥物可能是瘢痕疙瘩治療的良好候選藥物[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CPP干預(yù)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中PI3K和AKT的磷酸化水平明顯降低，暗示CPP 可能通過(guò)抑制PI3K/AKT通路發(fā)揮作用。

總之，CPP通過(guò)阻礙PI3K/AKT信號(hào)通路的激活抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程和ECM相關(guān)蛋白的表達(dá)，同時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，CPP可能是瘢痕疙瘩的潛在治療藥物，并且可以作為一種新的治療方向應(yīng)用于臨床。