【關(guān)鍵詞】支氣管哮喘；NLR家族的Pyrin域蛋白3；Th17/Treg；氣道慢性炎癥

【中圖分類號】R332.3 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-11-29

氣道慢性炎癥是哮喘的病理基礎(chǔ)，很多研究證實NLR 家族的NLRP3（NLR family，pyrin domaincontaining protein 3）炎性小體參與哮喘等氣道疾病的炎癥過程[1-2]。NLRP3 控制caspase-1 的活化，調(diào)控IL-1β等促炎細(xì)胞因子的修飾與活化，IL-1β可以促進(jìn)Th17的分化、維持Th17相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，也可以促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的募集[3]。激活NLRP3炎癥小體對調(diào)節(jié)Th17和Treg的控制有重要的作用[4]。已經(jīng)證實Th17/Treg 平衡失調(diào)介導(dǎo)哮喘氣道炎癥，是哮喘重要的發(fā)病機(jī)制之一[5]。因此，本研究推測NLRP3炎癥小體參與Th17/Treg平衡失調(diào)介導(dǎo)的氣道炎癥發(fā)病過程，目前尚未見相關(guān)報道。MCC950是作用強(qiáng)且具有特異性的NLRP3炎癥小體抑制劑，常常選用MCC950作為NLRP3相關(guān)疾病動物模型的干預(yù)劑[6]。本研究擬建立哮喘小鼠模型，通過NLRP3抑制劑MCC950干預(yù)，觀察Th17/Treg水平及其細(xì)胞因子水平、肺組織病理學(xué)改變和肺組織NLRP3、Caspase-1蛋白水平，探討NLRP3炎癥小體介導(dǎo)Th17/Treg失衡在哮喘小鼠氣道炎癥中的作用及其機(jī)制，并為哮喘的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

無特定病原體6～8 周18～20 g BALB/C 雌性小鼠（萊彼特生物科技有限公司，重慶）倫理批準(zhǔn)號MKLLY（A）-2021-128；OVA（美國 Sigma公司）；MCC950（美國MedChe?mExpress 公司）；NLRP3 抗體（美國GeneTex 公司）；Anti-Caspase-1抗體（英國abcam公司）；FITC anti-mouse CD4、PEanti-mouse CD25、APC anti-mouse CD127（IL-7Rα）、PerCPanti-mouse CD45、PE anti-mouse IL-17（美國Biolegend 公司）；小鼠IL-17A、IL-1β、IL-10、IL-18、IL-33、IL-35 的ELISA試劑盒（江萊生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗小鼠分組、模型的建立與干預(yù) 32只無特定病原體6～8周BALB/C雌性小鼠隨機(jī)分為哮喘模型組（AS組）、正常對照組（NS組）、MCC950干預(yù)組（MC組）及地塞米松組（Dex組），每組8只。參照Kim DI等[7]制作哮喘小鼠模型的方法，并根據(jù)本課題組[8]多年制作哮喘小鼠模型的方法進(jìn)行改進(jìn)，AS組第1天和第13天給予小鼠10% OVA氫氧化鋁凝膠混懸液腹腔注射聯(lián)合頸部及雙側(cè)大腿根部皮下注射以致敏，第19～23天每天給予小鼠10% OVA霧化吸入激發(fā)。NS組：注射劑OVA以PBS代替、霧化用生理鹽水代替，余處理同哮喘組。MC組和Dex組分別采用MCC950和地塞米松干預(yù)，具體方法是在AS組處理的基礎(chǔ)上每次霧化激發(fā)前30 min分別腹腔注射MCC950 10 mg/kg[9]和地塞米松2 mg/kg[10]進(jìn)行干預(yù)。

1.2.2 外周血、支氣管肺泡灌洗液、肺和脾組織標(biāo)本采集與制備 末次激發(fā)24 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，眼眶靜脈叢采血用于制作外周血單個核細(xì)胞懸液（peripheralblood mononuclear cell，PBMC），然后打開腹腔，腹主動脈處放血，取脾臟備用。打開胸腔，暴露雙肺，結(jié)扎右肺肺門，取出整個右肺，右肺中葉用于制作單個核細(xì)胞懸液；右肺下葉置于4%多聚甲醛常溫固定，后續(xù)免疫組織化學(xué)（immunohis?tochemistry，IHC）檢測。暴露頸部氣管，在環(huán)狀軟骨上方用靜脈留置針插管固定，無菌PBS灌洗，收集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），30 min 內(nèi)行細(xì)胞計數(shù)，1 200 r/min 4 ℃離心，取沉渣涂片瑞氏吉姆薩染色，其余標(biāo)本迅速凍存在-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 外周血、脾及肺組織單個核細(xì)胞懸液的制備 ①PBMC的制備：加入等量的樣本稀釋液到采集血液中混勻，小心加至淋巴細(xì)胞分離液上層，吸取PBMC，裂紅離心棄上清，800 μLPBS重懸計數(shù)。②脾組織單個核細(xì)胞懸液的制備：取新鮮小鼠脾臟，冷PBS清洗放到40 μm細(xì)胞篩網(wǎng)，注射器活塞輕柔按壓研磨，用3 mL PBS 輕輕沖洗篩網(wǎng)。余步驟同PBMC。③右肺中葉單個核細(xì)胞懸液的制備：先配制酶消化工作液，按照銀維謀[11]等的方法用，1 mg/mL膠原酶（collagenase V）+0.2 mg/mL DNse I，溶于1640培養(yǎng)基中，將取出的右肺中葉用冷的PBS清洗，加入1 mL酶消化工作液；剪碎肺組織，37 ℃搖床消化30～40 min；其余步驟同脾組織單個核細(xì)胞懸液的制備。

1.2.4 外周血、肺及脾單個核細(xì)胞懸液流式細(xì)胞染色 參照劉紅云等[12-13]流式細(xì)胞技術(shù)檢測Th17和Treg流式細(xì)胞染色的方法，按照說明書使用。①Treg染色：將前面的單個核細(xì)胞懸液計數(shù)，分裝，分別加染色抗體和對照CD4、CD45、CD25、CD127；4 ℃避光孵育；2%多聚甲醛4 ℃避光固定，洗滌、離心棄上清；Staining Buffer重懸，上機(jī)。②Th17染色：取前面剩余單個核細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù)，按照（1～2）×10⁶/mL個細(xì)胞，加入1640培養(yǎng)基+血清鋪板；加三聯(lián)體Cell activationcocktail with Brefeldin A（PMA+離子霉素+高爾基體阻斷劑）混勻后37 ℃培養(yǎng)4～6 h；收集細(xì)胞，染色緩沖液重懸；表面染色，分別加入CD4、CD45、CD69和對照CD4、CD45；固定破膜，加入Cyto-Fast? Fix Perm Buffer，室溫避光孵育，洗滌，Cyto-Fast? Perm Wash Solution 重懸；胞內(nèi)染色，加入Cyto-Fast? Perm Wash Solution，分別加IL-17抗體和IL-17對照抗體，室溫避光孵育；洗滌、離心、棄上清；加入Cell StainingBuffer重懸，上機(jī)。

1.2.5 肺組織石蠟切片的制作 肺組織在4%的多聚甲醛固定14～20 h，分別置于50%和70%乙醇12 h和4 h，80%和90%乙醇30min，95%和100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各浸泡45 min，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片。

1.2.6 NLRP3、caspase-1蛋白水平免疫組化 肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，微波抗原修復(fù)后自然降到常溫，3%的H₂O₂室溫避光孵育，封閉用山羊血清封閉，滴加相應(yīng)一抗孵育沖洗后滴加對應(yīng)的二抗及DAB顯色，設(shè)空白對照，陰性對照和陽性對照，陽性表達(dá)為黃色、淡黃色和棕黃色。用LeicaV4.2采圖系統(tǒng)采圖；每組在相同條件下隨機(jī)選擇5個直徑約70 μm完整氣道，應(yīng)用圖像分析軟件Image-proplus 6.0，以積分光密度及區(qū)域為指標(biāo)進(jìn)行定量分析，計算平均積分光密度值（integrated optical density，IOD）。

1.2.7 BALF 中IL-17A、IL-1β、IL-10、IL-18、IL-33、IL-35濃度（ELISA） 平衡至室溫，按說明書配制標(biāo)準(zhǔn)品工作液濃度梯度分裝，設(shè)立復(fù)孔和空白對照，配制洗滌緩沖液、生物素化抗體工作液和酶結(jié)合物工作液即配即用。按操作步驟分別加樣、加生物素化抗體、酶結(jié)合物工作液、加底物、終止，用450 nm波長對各孔吸光度（absorbance，A）值進(jìn)行測量。采用ELISAcalc 軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)（X軸），對應(yīng)的A 450 nm值為縱坐標(biāo)（Y軸），繪制出標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸線，按曲線方程計算各樣本的濃度值（以Y值計算X值）再乘以稀釋倍數(shù)，得出對應(yīng)的濃度（pg/mL）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件分析數(shù)據(jù)，根據(jù)資料的屬性對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。對多樣本均數(shù)比較時采用單因素方差分析，有差異者進(jìn)一步采用LSD-t 檢驗行兩兩比較。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠行為學(xué)的變化

AS組小鼠經(jīng)過OVA 致敏和激發(fā)后，表現(xiàn)出呼吸急促、時而躁動不安、抓耳撓腮，時而精神萎靡、口唇、眼瞼發(fā)紺、進(jìn)食差、不活潑、活動減少；MC組、Dex組上述表現(xiàn)較AS組明顯減輕，NS組無上述表現(xiàn)。

2.2 BALF總細(xì)胞計數(shù)、瑞士-吉姆薩染色白細(xì)胞分類計數(shù)的變化

AS組細(xì)胞計數(shù)、白細(xì)胞計數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞占白細(xì)胞分類計數(shù)百分比較NS組增高；MC組、Dex組較AS組降低，均Plt;0.01。見表1、圖1。

2.3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測外周血、肺及脾組織單個核細(xì)胞懸液CD4細(xì)胞Th17比例和Treg比例及Th17/Treg比例的變化

參照流式細(xì)胞技術(shù)[14-15]檢測Th17、Treg細(xì)胞的方法，以CD4 細(xì)胞IL-17（CD4⁺IL-17⁺）和CD4⁺CD25⁺CD127^low 占CD⁴⁺細(xì)胞比例分別反映Th17和Treg水平。AS組外周血、肺、脾組織單個核細(xì)胞懸液中Th17較NS組高，Treg較NS組低，MC組、Dex 組Th17 較AS 組減低，Treg 較AS 組升高，P=0.000。見圖2、3、4，表2。

2.4 肺組織NLRP3、Caspase-1蛋白水平的變化

NLRP3主要表達(dá)在肺上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞，Caspase-1蛋白在肺和脾臟中大量表達(dá)，染色中黃色、棕黃色為其陽性表達(dá)，見圖5。AS組NLRP3、Caspase-1肺組織蛋白水平較NS組高，MC組、Dex組較AS低，P=0.000。見圖6，表3。

染色中黃色、棕黃色為其陽性表達(dá)，AS組小鼠肺組織中NLRP3、Caspase-1 的表達(dá)呈強(qiáng)陽性，NS 組表達(dá)較弱；MCC950及地塞米松干預(yù)后上述蛋白的表達(dá)強(qiáng)度較AS組進(jìn)一步減弱。

2.5 BALF 中IL-17A、IL-1β、IL-10、IL-18、IL-33、IL-35 濃度變化

AS組BALF的IL-17A、IL-1β、IL-18及IL-33濃度較NS增高，P 均lt;0.01，IL-10、IL-35 濃度較NS 降低，Plt;0.05；MC組、Dex 組IL-17A、IL-1β、IL-18、IL-33 濃度較AS 組降低，P 均lt;0.01，IL-10、IL-35濃度較AS組高，Plt;0.05；見表4。

3 討 論

哮喘的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)有的理論不能完全闡明哮喘的發(fā)病機(jī)制，使哮喘的控制面臨巨大的挑戰(zhàn)，進(jìn)一步深入研究哮喘的發(fā)病機(jī)制有重要意義。研究表明，哮喘患者中存在Th17/Treg 細(xì)胞平衡失調(diào)，NLRP3參與哮喘的發(fā)病過程，本研究通過制作小鼠哮喘模型，探討NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)Th17/Treg失衡在哮喘氣道炎癥中的作用，使用NLRP3抑制劑MCC950干預(yù)哮喘小鼠，觀察MCC950干預(yù)對哮喘小鼠氣道炎癥、Th17/Treg失衡的影響，進(jìn)一步探討哮喘的發(fā)病機(jī)制，并為哮喘的治療提供新的思路。

本研究觀察到AS組的小鼠呼吸頻率增快、呼吸困難、口唇發(fā)紺、煩躁抓耳、活動減少，檢測發(fā)現(xiàn)BALF 細(xì)胞計數(shù)及EOS 百分比和IL-17A、IL-18 及IL-33濃度增高，通過對肺組織切片HE染色后觀察到以嗜酸性粒細(xì)胞為主的氣道炎癥。成功的哮喘動物模型[16-18]表現(xiàn)為氣道炎性指標(biāo)增加（如BALF的EOS、細(xì)胞因子IL-17、IL-18及IL-33等）、肺組織炎癥細(xì)胞浸潤、黏液分泌物增多等及氣道反應(yīng)性增加。評價哮喘動物模型成功的指標(biāo)包括氣道炎癥細(xì)胞浸潤增加和氣道反應(yīng)性增高。氣道反應(yīng)性測定包括無創(chuàng)和有創(chuàng)兩種方法，其干擾因素多，實施繁雜，儀器設(shè)備昂貴，且不能模擬哮喘自然發(fā)病狀態(tài)，目前應(yīng)用較少。復(fù)習(xí)大量國內(nèi)外哮喘動物模型的相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)研究將以嗜酸粒細(xì)胞浸潤為主的氣道炎癥改變作為判斷哮喘小鼠模型成功的主要指標(biāo)，氣道反應(yīng)性測定少用。

本研究應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測AS組外周血、肺及脾組織的單個核細(xì)胞懸液中Th17占CD4+細(xì)胞的百分比均高于NS組，而Treg占CD4⁺細(xì)胞的百分比均低于NS組，同時Th17/Treg的比值升高。哮喘發(fā)生與Th17升高、Treg降低及Th17/Treg平衡失調(diào)有關(guān)。有研究表明哮喘患者病情的嚴(yán)重程度與患者外周血中Th17細(xì)胞IL-17的表達(dá)量呈正相關(guān)，其痰液的IL-17A 水平升高[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)在哮喘小鼠中，Th17不僅在外周血中升高，在肺組織、脾組織中同樣升高，考慮哮喘的炎癥不僅累及肺，還在外周血和脾組織中有表達(dá)。研究表明Treg的數(shù)目變化或功能缺陷也在哮喘氣道炎癥中發(fā)揮重要作用[21]。本研究進(jìn)一步采用MCC950 干預(yù)后Th17 比例下降，Treg 比例上升，Th17/Treg 比例較AS 組下降，MCC950干預(yù)有助于改善這種平衡失調(diào)。文獻(xiàn)報道，MCC950干預(yù)抑制小鼠氣管移植后Th1/Th17反應(yīng)和促進(jìn)Treg反應(yīng)改善閉塞性細(xì)支氣管炎[22]，未見MCC950改善哮喘Th17/Treg平衡的報道，將為探索哮喘患者NLRP3抑制劑和Th17與Treg調(diào)節(jié)作用方面的機(jī)制和治療藥物提供新思路。

應(yīng)用ELISA測各組小鼠BALF液中的Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-17A 和Treg 相關(guān)細(xì)胞因子IL-10、IL-35的濃度，結(jié)果顯示AS組BALF中IL-17A濃度較NS增高，IL-10、IL-35水平均低于NS組，MC組IL-17A濃度較AS組降低，IL-10、IL-35高于AS組。這一結(jié)果表明哮喘小鼠中Th17相關(guān)細(xì)胞因子增加，Treg相關(guān)細(xì)胞因子降低。研究表明氣道中IL-17A、IL-17F等因子的水平與哮喘疾病嚴(yán)重程度和氣道反應(yīng)相關(guān)[23-24]。Kearley J[25] 等研究發(fā)現(xiàn)將CD4⁺CD25⁺Treg輸入哮喘小鼠體內(nèi)，分泌的IL-10可緩解哮喘小鼠氣道高反應(yīng)、減輕嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，本研究使用OVA建立的哮喘小鼠模型中Treg相關(guān)細(xì)胞因子降低。與此同時使用MCC950干預(yù)可以抑制Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-17A和促進(jìn)Treg相關(guān)細(xì)胞因子IL-10、IL-35 的產(chǎn)生，可以調(diào)節(jié)Th17 和Treg 功能，MCC950可能成為Th17/Treg失衡所致哮喘的潛在治療藥物。由此，本研究得出結(jié)論哮喘中Th17/Treg比例升高，并且其相關(guān)細(xì)胞因子水平也有相應(yīng)改變，Th17/Treg 比例失衡可能是哮喘發(fā)病機(jī)制之一。經(jīng)MCC950干預(yù)可調(diào)節(jié)Th17/Treg比例失衡和調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子的濃度。

應(yīng)用免疫組化法觀察到AS組肺組織NLRP3和Caspase-1蛋白水平高于NS組，ELISA測定顯示AS組BALF中IL-1β、IL-18、IL-33濃度較NS組增高，考慮哮喘小鼠中炎癥小體NLRP3和Caspase-1及其下游細(xì)胞因子濃度增加，炎癥小體NLRP3 和Cas?pase-1及其下游細(xì)胞因子IL-1β、IL-18、IL-33參與小鼠哮喘的發(fā)生發(fā)展。應(yīng)用MCC950干預(yù)后MC組IL-1β、IL-18、IL-33 濃度較AS 組降低。該結(jié)果表明NLRP3、Caspase-1 及其下游細(xì)胞因子的增高與哮喘有關(guān)，使用MCC950干預(yù)后可使其濃度下降，可能有助于哮喘氣道慢性炎癥的控制。Rossios C等[26]研究證實患者痰液樣本中的NLRP3炎癥小體與哮喘病情呈正相關(guān)，哮喘病情越重則NLRP3炎癥小體表達(dá)水平越高。本研究應(yīng)用MCC950干預(yù)后哮喘小鼠BALF液的IL- 1β、IL-33及IL- 18濃度和肺組織NLRP3 蛋白水平、Caspase-1 蛋白水平較AS 組降低，證實MCC950干預(yù)可阻滯哮喘小鼠NLRP3及其下游細(xì)胞因子IL- 1β、IL-33及IL- 18表達(dá)。IL-1β和IL-18可誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th1和Th17分化，IL-1β可促進(jìn)Th17細(xì)胞分化、維持Th17相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，也可促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的募集。在炎癥條件下，在有IL-2存在的前提下IL-1β可誘導(dǎo)Treg轉(zhuǎn)化為促炎Th17，且在炎癥和自身免疫之間建立起功能聯(lián)系[27]。上述結(jié)果證實之前的推測，NLRP3炎癥小體參與Th17/Treg平衡失調(diào)介導(dǎo)的氣道炎癥發(fā)病過程，NLRP3炎性小體及其下游細(xì)胞因子IL-1β、IL-33及IL-18參與哮喘的發(fā)生與發(fā)展，MCC950可能是NLRP3炎性小體介導(dǎo)的哮喘氣道炎癥藥物治療的新思路或新途徑。

糖皮質(zhì)激素因?qū)ρ装Y細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和炎癥反應(yīng)等多途徑均有抑制作用而成為目前治療哮喘的一線用藥。Dex作為糖皮質(zhì)激素的代表藥，本研究設(shè)立Dex干預(yù)組，對比MCC950干預(yù)組哮喘小鼠氣道炎癥的影響，結(jié)果顯示，Dex干預(yù)與MCC950干預(yù)相比，Dex組外周血、肺組織及脾組織中Th17較MC低，Treg較MC組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；BALF液中IL-1β、IL-10、IL-17A、IL-33、IL-18 表達(dá)及肺組織中Caspase-1 蛋白水平與MC組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Dex 組BALF 細(xì)胞數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞比例低于MC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，綜合分析Dex干預(yù)哮喘小鼠優(yōu)于MCC950，其機(jī)制是糖皮質(zhì)激素作為抗炎藥從多個環(huán)節(jié)全面抑制哮喘氣道炎癥，MCC950主要作用于NLRP3 及其細(xì)胞因子所致的氣道炎癥有關(guān)。盡管MCC950對哮喘小鼠作用不如Dex，但非激素類藥物類似于白三烯受體的拮抗劑孟魯司特鈉，也為探索哮喘發(fā)病機(jī)制、新藥的研究、聯(lián)合治療等提供新的思路。

綜上所述，在哮喘小鼠模型中，NLRP3、Cas?pase-1及NLRP3下游細(xì)胞因子IL-1β、IL-18及IL-33升高，Th17產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-17A升高，Treg產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-10、IL-35降低，Th17/Treg比例升高，NLRP3炎癥小體可通過介導(dǎo)Th17/Treg失衡，參與或加重哮喘氣道炎癥的發(fā)生。MCC950可通過下調(diào)哮喘小鼠Th17 功能，上調(diào)Treg 功能，從而調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡，降低支氣管肺組織IL-17A、IL-1β、IL-18、IL-33、NLRP3 及Caspase-1 水平，上調(diào)支氣管肺組織IL-10、IL-35 水平，減輕哮喘氣道炎癥。然而，NLRP3及相關(guān)細(xì)胞因子的調(diào)控以及Th17和Treg之間的轉(zhuǎn)化調(diào)控復(fù)雜精細(xì)，涉及復(fù)雜的炎癥和免疫異常，許多問題還未得到闡釋。因此，進(jìn)一步研究NLRP3和Th17與Treg在哮喘發(fā)病機(jī)理中的作用及相互影響，探索NLRP3 及相關(guān)因子的調(diào)控和Th17與Treg之間的轉(zhuǎn)化調(diào)控將有助于進(jìn)一步闡明哮喘的發(fā)病機(jī)制，為哮喘的治療提供新的思路。