摘 要：【目的】大花紫薇和‘丹紅紫葉’紫薇子代高度不育，為了解析其子代不育的機理?！痉椒ā勘驹囼炓源蠡ㄗ限弊髂副竞汀ぜt紫葉’紫薇作父本的雜交F1代‘瀟湘華秀’為材料，通過石蠟切片顯微技術(shù)觀察其雌雄蕊的生長發(fā)育過程及成熟花粉粒中的可溶性糖、淀粉、脂類物質(zhì)的積累情況；并對3種紫薇花蕾不同生長發(fā)育階段的可溶性糖含量、淀粉含量、游離脯氨酸含量進行分析測定?！窘Y(jié)果】1）‘瀟湘華秀’不育是雄性不育和雌性不育共同作用形成的，其花粉存在干癟、畸形、大小不均等異?，F(xiàn)象，絕大部分花粉不能萌發(fā)。2）與大花紫薇和‘丹紅紫葉’紫薇相比，F(xiàn)1代在減數(shù)分裂時期發(fā)生異常，具體表現(xiàn)為減數(shù)分裂時，有部分染色體無法正常聯(lián)會并排布到赤道板中央，染色體不均勻分離，發(fā)育成異常的二分體、帶微核二分體、帶微核四分體、五分體、六分體，且大部分花粉細(xì)胞核在二核期消解，成熟花粉粒大部分畸形，無內(nèi)含物且不能萌發(fā)，可萌發(fā)的花粉粒為2n花粉粒。3）大孢子在四分體時期萎縮消解，后期形成有少量胚囊痕跡的空洞。4）F1代花蕾的可溶性糖、淀粉、游離脯氨酸含量都低于同等時期的親本花蕾，且大部分花粉中未觀測到脂類、可溶性糖和淀粉積淀?！窘Y(jié)論】染色體行為異常導(dǎo)致異常四分體的出現(xiàn)和二核花粉粒時期細(xì)胞核的解體是花粉敗育的主要原因；四分體時期大孢子萎縮消解是雌性不育的主要原因。

關(guān)鍵詞：大花紫薇；丹紅紫葉紫薇；雜交后代不育；花粉內(nèi)含物；細(xì)胞學(xué)

中圖分類號：S792.99 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-923X（2024）07-0140-13

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2019YFD1001000）；湖南省花卉苗木產(chǎn)業(yè)發(fā)展項目（HH202201）。

Cytological studies of F1 hybrid sterility between Lagerstroemia speciosa and Lagerstroemia indica ‘Ebony Embers’

YANG Qi1，2， WANG Xiangying2， TANG Li1， WANG Xiaoming2， QIAO Zhongquan2， CHEN Yi2， ZENG Huijie2， LI Yongxin2

（1. College of Forestry， Central South University of Forestry Technology， Changsha 410004， Hunan， China； 2. Hunan Academy of Forestry， Changsha 410004， Hunan， China）

Abstract：【Objective】The progeny of Lagerstroemia speciosa and Lagerstroemia indica ‘Ebony Embers’ are highly sterile， In order to analyze the reasons for the sterility of their offspring.【Method】In this experiment， L. indica ‘Xiaoxiang Huaxiu’ was used as the material which was the F1 hybrid of L. speciosa as the female parent and L. indica ‘Ebony Embers’ as the male parent， by paraffin section microscopy to observe the growth and development process of the stamens and pistils of male， and the mature pollen grains in the accumulation of soluble sugar， starch， lipid； and the contents of soluble sugar， starch， free proline in different growth stages were determined.【Result】1） The sterility of L. indica ‘Xiaoxiang Huaxiu’ was the result of combined male and female sterility. Pollen grains exhibit aberrant characteristics including shriveled appearance， deformities， and size variations， leading to the majority of pollen grains being unable to germinate. 2） Compared with L. speciosa and L. indica ‘Ebony Embers’， abnormalities occurred in the F1 generation during meiosis， specifically， some chromosomes were not arranged normally to the center of the equatorial plate during meiosis， and the chromosomes segregation was not uniform， developing into abnormal dyads， micronucleated dyads， micronucleated tetrads， pentads and sexads， and most pollen nuclei dissolve during the binucleate pollen grains stage. Mature pollen grains were mostly deformed without contents and couldnot sprout， the germinable pollen grains were 2n pollen grains. 3） The megaspore atrophies and dissolved in the tetrad stage， and formed a cavity with a few embryo sac traces in the later stage. 4） The contents of soluble sugar，starch and free proline in F1 generation’s flower bud were lower than those in the parent’s flower bud of the same period. Lipid， soluble sugar and starch accumulation was not observed in most pollen.【Conclusion】The abnormal behavior of chromosomes leads to the appearance of abnormal tetrads and the disintegration of nuclei in the period of binucleate pollen grains are the main reasons for pollen abortion. Atrophy and disintegration of megaspore during tetrad is the main cause of female sterility.

Keywords： Lagerstroemia speciosa， Lagerstroemia indica ‘Ebony Embers’， hybrid sterility， nutrients in pollen， cytology

紫薇Lagerstroemia indica與大花紫薇Lagerstroemia speciosa分類學(xué)上同屬不同亞組，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。研究發(fā)現(xiàn)紫薇與大花紫薇Lagerstroemia speciosa雜交后代存在高度不育現(xiàn)象[1-2]，已有研究初步分析了大花紫薇和紫薇遠(yuǎn)緣雜交后代的不育性[2]，但并沒有從細(xì)胞學(xué)層面深入系統(tǒng)地觀察雜交后代雌蕊和雄蕊的生長發(fā)育狀況，沒有闡明雜交后代的不育機理?！ぜt紫葉’紫薇Lagerstroemia indica ‘Ebony Embers’葉片紫黑色，花深紅色，其與大花紫薇遠(yuǎn)緣雜交后代的花色比大花紫薇深，為深紫色，花徑和葉片比‘丹紅紫葉’紫薇大，抗寒性比大花紫薇強，能在湖南長沙安全越冬，且抗蚜蟲和白粉病的能力較強，是性狀優(yōu)良的紫薇新種質(zhì)。本研究以大花紫薇與‘丹紅紫葉’紫薇的雜交后代為試驗材料，通過顯微觀察雜交后代花蕾生長發(fā)育過程，從細(xì)胞學(xué)層面對雜交后代不育的原因進行探析，并結(jié)合生理指標(biāo)測定，旨在探明大花紫薇和‘丹紅紫葉’紫薇雜交后代不育的細(xì)胞學(xué)機理，為大花紫薇和紫薇遠(yuǎn)緣雜交育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以湖南省林業(yè)科學(xué)院試驗林場紫薇基地的大花紫薇（可育）、‘丹紅紫葉’紫薇（可育）、‘丹紅紫葉’紫薇作父本和大花紫薇作母本的雜交F1代‘瀟湘華秀’Lagerstroemia indica ‘Xiaoxiang Huaxiu’（不育）為試材。

1.2 試驗方法

1.2.1 花器官觀察及雜交試驗

2023年7月25日早晨7：00前采集3種紫薇未散粉的花朵進行花器官結(jié)構(gòu)觀察，使用英國皇家園林協(xié)會RHS植物比色卡對花色和葉色進行比色。用鑷子剝離母本的花藥并套袋標(biāo)記，于9：00左右柱頭可授性最強時用新鮮花粉授粉，套袋。每隔3日觀察一次，7日后解開硫酸紙袋。設(shè)計5個雜交組合，分別是‘瀟湘華秀’♀ב丹紅紫葉’♂、‘瀟湘華秀’♀×大花紫薇♂、大花紫薇♀ב瀟湘華秀’♂、‘丹紅紫葉’♀ב瀟湘華秀’♂、‘瀟湘華秀’自交。每組重復(fù)30次。

1.2.2 細(xì)胞學(xué)觀察

2023年6月，采集‘瀟湘華秀’花蕾，參照羅雪夢等[3-4]的切片方法切去花蕾頂端，剝離花瓣，置入FAA固定液：（V70%乙醇∶V甲醛∶V冰乙酸=18∶1∶1）抽氣30 min浸泡24 h后轉(zhuǎn)入70%乙醇4 ℃保存。常規(guī)石蠟切片，切片厚度10～18 μm。染色方法：鐵蘇木素染色、愛式蘇木素-伊紅對染，中性樹膠封片，Olympus BX51光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。對照‘丹紅紫葉’紫薇樣本為本研究團隊已制作完成的鐵蘇木素染色石蠟切片。

1.2.3 花粉掃描電鏡觀察

參照Zhou等[5]的試驗方法取當(dāng)日盛開的花藥散出的花粉，2.5%戊二醛固定1.5 h，磷酸緩沖液沖洗2次，每次15 min，不同濃度乙醇逐級脫水，叔丁醇冷凍干燥，樣品粘貼至掃描電鏡銅板上鍍金20 min，掃描電子顯微鏡拍照觀察。對照‘丹紅紫葉’為本研究團隊已有的電鏡掃描照片。

1.2.4 花粉萌發(fā)試驗

2023年6月，參照張良英等[6-7]的試驗方法，于7：00前采集未散粉的長短雄蕊置于通風(fēng)陰涼干燥處，等待其脫水散粉后用毛筆輕刷入花粉培養(yǎng)基（蒸餾水1 000 mL、瓊脂0.5 g、氯化鈣20 mg、硼酸150 mg、蔗糖200 g）中，培養(yǎng)12 h后置于體式顯微鏡下取5個不同視野拍照觀察并計算萌發(fā)率。使用亞歷山大染色法、碘-碘化鉀染色法對花粉染色并觀察花粉活性，置于Olympus BX51光學(xué)顯微鏡下取5個不同視野拍照觀察并計算花粉活性。

1.2.5 花粉內(nèi)可溶性糖、脂質(zhì)染色觀察

2023年6月采集成熟期花蕾，使用常規(guī)石蠟切片切取成熟期花蕾進行蘇丹黑B溶液染色，觀察花粉脂肪積累情況；希夫試劑染色，觀察可溶性糖積累情況。

1.2.6 花蕾營養(yǎng)物質(zhì)含量測定

參照朱栗瓊等[8]的方法確定紫薇花蕾的發(fā)育時期，隨機采集‘瀟湘華秀’各直徑的花蕾的花藥各15個，游標(biāo)卡尺測量花蕾直徑，結(jié)合花藥壓片、醋酸洋紅染色確定不同直徑花蕾發(fā)育時期：減數(shù)分裂時期（3.0～5.2 mm）、四分體時期（5.3～6.0 mm）、單核小孢子時期（6.1～6.5 mm）、單核靠邊時期（6.5～6.8 mm）、二核花粉粒期（6.9～7.5 mm）、成熟期（>7.5 mm）。按各自直徑采集3種紫薇5個時期的花蕾各20個，液氮速凍后-80 ℃冰箱保存，使用北京索萊寶公司可溶性糖含量、淀粉含量、游離脯氨酸含量檢測試劑盒，嚴(yán)格按照說明書操作，進行3個指標(biāo)含量的測定，各指標(biāo)測定重復(fù)3次。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

圖片處理使用Photoshop CS6軟件；數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用Excel 2016軟件，數(shù)據(jù)分析制圖使用GraphPad Prism軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 花葉性狀觀察

‘丹紅紫葉’紫薇花色深紅（RHS 46A），花徑平均3.20 cm，花瓣邊緣褶皺明顯，葉片中等大小，平均長6.32 cm、平均寬4.24 cm，葉片褐色（RHS 203B）；大花紫薇花色紫（RHS N78C），花徑平均：7.96 cm，花瓣邊緣褶皺較平緩，葉片甚大，平均長19.82 cm，平均寬10.73 cm，葉片深綠（RHS NN137A）；‘瀟湘華秀’花色深紫（RHS N80A），花徑4.21 cm，大小介于親本之間，花瓣褶皺較為明顯，葉片較大，平均長14.29 cm，平均寬7.18 cm，葉片紫綠色（RHS 147A）。由圖1可知，大花紫薇、‘丹紅紫葉’紫薇、‘瀟湘華秀’均為兩性花，三角形花萼6片、花瓣六枚、‘丹紅紫葉’紫薇和‘瀟湘華秀’具長雄蕊6枚、短雄蕊若干，3種紫薇花藥均為丁字著藥，大花紫薇花藥的花粉囊扭曲至花絲花藥連接處，呈現(xiàn)環(huán)狀姿態(tài)；‘丹紅紫葉’紫薇花藥的花粉囊并未向花藥花絲連接處延伸；‘瀟湘華秀’花藥的花粉囊介于親本之間，有少部分向花藥花絲連接處延伸，但并不成環(huán)狀姿態(tài)。

2.2 雜交結(jié)實性

由表1可知，雜交授粉3日后，‘瀟湘華秀’♀ב丹紅紫葉’紫薇♂有30%的花留存，‘丹紅紫葉’紫薇♀ב瀟湘華秀’♂有3.33%的花留存，‘瀟湘華秀’♀×大花紫薇♂組合有26.67%的花留存，而大花紫薇♀ב瀟湘華秀’♂及‘瀟湘華秀’自交的花全部脫落。雜交授粉7日后，五組雜交組合的花全部脫落，均未見子房發(fā)育為果實，且絕大多數(shù)雜交組合的子房未見膨大跡象，全部掉落。這表明‘瀟湘華秀’與可育的‘丹紅紫葉’和大花紫薇正交及反交均不結(jié)實，說明大花紫薇與‘丹紅紫葉’紫薇的雜交后代‘瀟湘華秀’同時存在雄性和雌性不育。

2.3 花粉掃描電鏡觀察

由圖2可知，‘瀟湘華秀’花粉形狀極不規(guī)則，表面粗糙、干癟，大小差異顯著，部分花粉無明顯萌發(fā)溝。大花紫薇和‘丹紅紫葉’花粉為飽滿圓潤的花粉粒，3條萌發(fā)溝明顯。

2.4 ‘瀟湘華秀’及其親本花粉活性觀察

由圖3可知，‘瀟湘華秀’的花粉在體外萌發(fā)實驗中基本不萌發(fā)，花粉萌發(fā)率僅為3%（圖3d），花粉幾乎沒有活力；‘丹紅紫葉’紫薇大多數(shù)花粉都可以萌發(fā)，花粉管生長狀態(tài)良好，萌發(fā)率為68%（圖3a）；大花紫薇花粉萌發(fā)率也較高，萌發(fā)率為53%（圖3c）?；ǚ鄣?碘化鉀試劑染色結(jié)果顯示‘瀟湘華秀’大部分花粉未著色，只有少部分直徑較大的花粉被染成紅褐色，說明大部分花粉內(nèi)部無淀粉積累（圖3e）；親本 ‘丹紅紫葉’紫薇與大花紫薇的大部分花粉都被染成紫褐色，表明花粉內(nèi)部有淀粉積累（圖3b，h）；亞歷山大染色劑染色結(jié)果中‘瀟湘華秀’的花粉大部分呈現(xiàn)藍(lán)綠色，只有少數(shù)花粉呈紫紅色，大部分花粉無活性（圖3f），親本只有少數(shù)花粉被染成藍(lán)綠色，大部分花粉都呈現(xiàn)出紫紅色，說明花粉活性較高（圖3c，i）。這說明‘瀟湘華秀’的花粉萌發(fā)率和花粉活性很低，顯著低于親本。

2.5 ‘瀟湘華秀’小孢子的異常發(fā)育階段

由圖3可知‘瀟湘華秀’雄配子體敗育原因有絨氈層程序性死亡異常（圖4a，b，d，e）、花藥萎縮（圖4c）和四分體異常（圖4f）3種情況，其中二核期（圖4b）和單核靠邊期（圖4e）可觀察到明顯無內(nèi)含物積累和細(xì)胞核消解的透明狀態(tài)花粉粒，主要的敗育類型為四分體時期小孢子異常導(dǎo)致的敗育。至花粉母細(xì)胞時期，不育系‘瀟湘華秀’的小孢子體發(fā)育未出現(xiàn)異常，與親本的發(fā)育相似性較高。減數(shù)分裂期后的四分體時期，出現(xiàn)異常五分體、六分體（圖5a）和二分體（圖5b），與可育系‘丹紅紫葉’紫薇的正常四面體型四分體存在顯著差異（圖6a）。

紫薇形成四分體時胞質(zhì)分裂方式為同時型，多分體的出現(xiàn)代表‘瀟湘華秀’在減數(shù)分裂時期染色體的行為出現(xiàn)了異常，染色體的聯(lián)會配對及減數(shù)分裂后染色體的分配有異。四分體時期后期，細(xì)胞板和細(xì)胞壁形成，隨后絨氈層分泌出胼胝質(zhì)酶將包圍在四分體周圍的胼胝質(zhì)溶解，小孢子釋放于花藥的花粉囊中進一步生長發(fā)育，可見到不育系‘瀟湘華秀’的單核中央期小孢子（圖5c）為大小極不均勻且?guī)捉该鞯呐轄钚℃咦樱?xì)胞內(nèi)部未見內(nèi)含物與細(xì)胞核存在。而‘丹紅紫葉’紫薇單核小孢子大小均勻，形狀規(guī)整，內(nèi)含物充足（圖6b）?！疄t湘華秀’單核靠邊期小孢子大小差異顯著，逐漸出現(xiàn)四棱形的畸形小孢子（圖5e）；單核靠邊期至二核花粉粒時期，液泡化的細(xì)胞質(zhì)將細(xì)胞核擠至緊貼細(xì)胞壁處，細(xì)胞核將進行一次有絲分裂產(chǎn)生一個營養(yǎng)核和一個生殖核?！ぜt紫葉’紫薇此階段可明顯觀察到位于細(xì)胞壁邊緣的生殖細(xì)胞細(xì)胞核（圖6c），特征明顯（圖6d），但‘瀟湘華秀’大部分花粉粒細(xì)胞核都在此階段發(fā)生消解，細(xì)胞內(nèi)無明顯的細(xì)胞核（圖4e），唯一觀察到的細(xì)胞核未消解的二核花粉粒的細(xì)胞核仍處于細(xì)胞中央，未被擠壓到緊貼細(xì)胞壁處（圖5f）。

‘瀟湘華秀’成熟期的花粉粒呈半透明狀，無明顯細(xì)胞質(zhì)積累，花粉畸形，可觀察到六面體花粉粒、半月形花粉粒、三棱花粉粒和四棱花粉粒（圖5g），部分花粉囊內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重皺縮、排列緊密的干癟花粉粒（圖5h），但其花藥可正常開裂，花粉可正常散出，且僅直徑較大的花粉粒內(nèi)含物較充足，其他花粉粒呈透明狀（圖5i）。同時期‘丹紅紫葉’紫薇的花粉粒細(xì)胞質(zhì)濃厚，花粉形狀規(guī)則，大小均勻（圖6e—f）。由此得出‘瀟湘華秀’單核期小孢子的細(xì)胞核在有絲分裂生成營養(yǎng)核和生殖核過程中出現(xiàn)了異常。

2.6 ‘瀟湘華秀’小孢子發(fā)育減數(shù)分裂時期、四分體時期異常情況觀察

綜合石蠟切片觀察結(jié)果和花粉萌發(fā)實驗結(jié)果，對‘瀟湘華秀’小孢子母細(xì)胞的減數(shù)分裂時期和四分體時期進一步的研究，觀測到7個重要的減數(shù)分裂階段。

‘瀟湘華秀’減數(shù)第一次分裂前期，細(xì)胞核消失，核仁解體，此時染色體進行同源染色體聯(lián)會（圖7a）；減數(shù)第一次分裂中期，同源染色體著絲點對稱排列于赤道板兩側(cè)（圖7b，c），此時部分染色體并未被紡錘絲牽引至赤道板中央進行聯(lián)會配對活動，明顯落后于其他染色體（圖7b）；減數(shù)第一次分裂后期，同源染色體分離，非同源染色體自由組合后被紡錘絲牽引至細(xì)胞兩側(cè)（圖7d）。

減數(shù)第二次分裂末期，核仁再次出現(xiàn)，形成兩個細(xì)胞核（圖7e）。此時部分細(xì)胞將停止減數(shù)進行減數(shù)分裂，并逐漸形成細(xì)胞壁和細(xì)胞板，最終演變?yōu)槎煮w（圖7m）；有落后的染色體的細(xì)胞將形成一個微核，并逐漸成為一個帶微核的二分體（圖7n）；繼續(xù)進行減數(shù)分裂的細(xì)胞在減數(shù)第二次分裂中期同樣可以觀測到大量行為異常的染色體（圖7f，g），這些異常染色體的出現(xiàn)，是形成多分體的根本原因。減數(shù)第二次分裂末期，可以見到大量異常的細(xì)胞，即擁有兩個細(xì)胞核（多數(shù)大小不均且有部分帶有1個微核）、四個細(xì)胞核（多數(shù)帶有1～2個微核）、五個細(xì)胞核（多數(shù)大小不均）、六個細(xì)胞核（多數(shù)大小不均）的細(xì)胞（圖7i—l），并最終形成異常的多分體。

對‘瀟湘華秀’的四分體階段進行切片觀察，發(fā)現(xiàn)只進行了減數(shù)第一次分裂的二分體數(shù)量雖然較多，但多數(shù)二分體的染色體在減數(shù)第一次分裂中期發(fā)生異常從而形成了帶微核的二分體（圖 8a，e，f），二分體和帶微核的二分體在單核期形成了直徑最大的單核小孢子（圖8c，g），直徑較小的小孢子來源于四分體、五分體、六分體（圖8b），直徑最小的小孢子是減數(shù)分裂時落后的染色體形成的微核攜帶少量細(xì)胞質(zhì)形成的。成熟期的花粉粒大部分內(nèi)含物空洞，未見細(xì)胞核，呈透明狀，少數(shù)直徑較大的花粉粒被染成藍(lán)紫色（圖8d，h），說明二分體形成的花粉粒有內(nèi)含物積累。在‘瀟湘華秀’的花粉體外萌發(fā)實驗中，直徑最大的花粉能萌發(fā)出花粉管（圖8j），直徑較小的花粉粒則不具有萌發(fā)能力。部分由帶微核二分體轉(zhuǎn)變的花粉粒在減數(shù)第一次分裂期丟失了部分染色體，雖然直徑大但也不具萌發(fā)能力（圖8i）。說明雄配子體敗育的根本原因是染色體丟失。

2.7 ‘瀟湘華秀’大孢子發(fā)育的顯微結(jié)構(gòu)

紫薇為單孢子蓼型胚囊，對各時期的子房進行了石蠟切片，發(fā)現(xiàn)‘瀟湘華秀’大孢子二分體前的各階段發(fā)育正常（圖9a—b），胚囊母細(xì)胞在經(jīng)過減數(shù)第一次分裂后形成二分體（圖9c），大部分二分體進一步分裂為四分體時出現(xiàn)異常，四分體的細(xì)胞核出現(xiàn)消解現(xiàn)象，且大孢子細(xì)胞開始萎縮解體（圖9d），少部分四分體可以正常發(fā)育為單核胚囊（圖9e），但單核胚囊后，大孢子無法繼續(xù)生長發(fā)育，萎縮為干癟棒狀細(xì)胞（圖9f），隨著花蕾逐漸生長，大孢子進一步消解（圖9h），至花蕾開放時，只在珠心處觀測到一個仍殘留有部分絮狀物的空洞（圖9i）。說明減數(shù)分裂時期大孢子二分體不能進一步分裂為大孢子四分體，導(dǎo)致后期大孢子消解是‘瀟湘華秀’雌性敗育的主要原因。

2.8 ‘瀟湘華秀’及其親本花粉內(nèi)脂類、可溶性糖積累情況檢測

淀粉、可溶性糖和脂質(zhì)是花粉內(nèi)的重要內(nèi)含物，其含量會影響花粉萌發(fā)和花粉管生長。蘇丹黑B溶液可以將脂質(zhì)著色，花粉壁富含脂類物質(zhì)。由圖10可知，3種紫薇的花粉粒都有不同程度的著色?！疄t湘華秀’親本染色較深（圖10a，c），‘瀟湘華秀’的著色程度明顯淺于親本，呈透明狀（圖10b），說明‘瀟湘華秀’花粉粒內(nèi)部空洞，脂類物質(zhì)積累很少，大花紫薇的和花粉粒也呈現(xiàn)出大小不均勻的狀態(tài)（圖10c），且較小的花粉既無內(nèi)含物積累也無萌發(fā)能力，具體原因有待進一步研究。

高碘酸可將花粉內(nèi)含的可溶性糖氧化為二醛基，進而與希夫試劑中的無色品紅結(jié)合形成紫紅色?！ぜt紫葉’紫薇、大花紫薇成熟花粉?？扇苄蕴呛控S富，大部分花粉被希夫試劑染成深紅色（圖10d，f），而‘瀟湘華秀’大部分花粉都呈現(xiàn)出淡紅色，只有直徑較大的一些花粉粒被希夫試劑染成深紅色（圖10e），說明‘瀟湘華秀’大部分花粉粒內(nèi)部可溶性糖的沉積很少。

2.9 ‘瀟湘華秀’及親本不同時期花蕾可溶性糖、淀粉和游離脯氨酸含量檢測

由圖11可知，3種紫薇花蕾發(fā)育過程中整體為上升趨勢，在總體含量水平上，‘丹紅紫葉’紫薇花蕾中可溶性糖含量在五個時期都高于大花紫薇，但在四分體時期和成熟期，三者花蕾中可溶性糖的含量并無顯著差別。‘瀟湘華秀’的可溶性糖在各階段的含量都低于親本?！疄t湘華秀’可溶性糖含量均值在成熟期與親本差異顯著，‘瀟湘華秀’為16.54 mg·g-1，大花紫薇為21.20 mg·g-1，比‘瀟湘華秀’高28.2%，‘丹紅紫葉’為21.63 mg·g-1，比‘瀟湘華秀’高30.8%。3種紫薇花蕾的可溶性糖含量在四分體時期到二核花粉粒時期上升較快，大花紫薇可溶性糖含量一直在增長、‘瀟湘華秀’和‘丹紅紫葉’紫薇可溶性糖含量在二核花粉粒時期后逐漸趨于平穩(wěn)。

由圖11可知，3種紫薇淀粉含量在花蕾發(fā)育過程中變化趨勢與可溶性糖含量類似，呈上升趨勢。但在成熟期‘丹紅紫葉’紫薇的淀粉含量（38.38 mg·g-1）明顯高于大花紫薇（31.50 mg·g-1）和不育的‘瀟湘華秀’（24.45 mg·g-1），四分體時期至成熟期‘丹紅紫葉’紫薇和大花紫薇的淀粉含量一直在遞增。而‘瀟湘華秀’的淀粉含量只在四分體時期（19.37 mg·g-1）至單核花粉粒時期（23.54 mg·g-1）有少量增長現(xiàn)象，單核靠邊期后，淀粉含量無顯著變化，且5個時期的淀粉含量差異并不顯著。

由圖11可知，3種紫薇脯氨酸含量在花蕾發(fā)育過程中變化趨勢與可溶性糖和淀粉含量也類似，呈上升趨勢，但大花紫薇、‘丹紅紫葉’紫薇各時期游離脯氨酸含量差異顯著，而‘瀟湘華秀’花蕾中游離脯氨酸只在單核中央期（11.86 μg·g-1）至單核靠邊期（19.91 μg·g-1）增長顯著，其他時期增長無顯著性差異。大花紫薇、‘丹紅紫葉’紫薇、‘瀟湘華秀’花蕾內(nèi)游離脯氨酸含量差異顯著，‘丹紅紫葉’紫薇的游離脯氨酸含量在五個時期均顯著高于其他兩個紫薇品種?！ぜt紫葉’紫薇的游離脯氨酸含量在成熟期（55.25 μg·g-1）明顯高于大花紫薇（42.53 μg·g-1）和‘瀟湘華秀’（22.99 μg·g-1）。大花紫薇和‘瀟湘華秀’在四分體時期至單核中央期的游離脯氨酸含量沒有顯著差異。大花紫薇二核期（31.85 μg·g-1）和成熟期（42.53 μg·g-1）花蕾內(nèi)游離脯氨酸含量顯著高于‘瀟湘華秀’的二核期（21.98 μg·g-1）和成熟期（22.97 μg·g-1）。這進一步證明了‘瀟湘華秀’花蕾內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的積累低于親本。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，‘瀟湘華秀’與可育的‘丹紅紫葉’和大花紫薇正交及反交均不結(jié)實，大花紫薇與‘丹紅紫葉’紫薇的雜交后代‘瀟湘華秀’同時存在雄性和雌性不育。

研究結(jié)果表明，‘瀟湘華秀’不育是雄性不育和雌性不育共同作用形成的。其花粉存在干癟、畸形、大小不均等異常現(xiàn)象，絕大部分花粉不能萌發(fā)。雄性不育的根本原因是減數(shù)分裂時期染色體行為異常，部分染色體無法正常排列到赤道板上后逐漸形成微核，造成小孢子染色體丟失或染色體不均勻分配從而無法進行正常的生長發(fā)育。導(dǎo)致‘瀟湘華秀’四分體時期形成異常二分體、帶微核二分體、帶微核四分體、五分體、六分體；使單核小孢子時期形成大小不均勻的畸形單核小孢子；二核花粉粒時期大部分花粉粒內(nèi)含物空洞，花粉?；?，細(xì)胞核消解；成熟花粉粒中大部分花粉?？瞻T無萌發(fā)能力，只有直徑較大的由二分體發(fā)育而來的2n花粉粒內(nèi)含物豐富且能夠萌發(fā)。

‘瀟湘華秀’的雌性敗育從二分體時期開始，二分體無法正常發(fā)育成四分體并萎縮凋亡，推測雌性不育與雄性不育的原因類似，都是減數(shù)分裂異常所導(dǎo)致的不育，由于染色體分裂不均勻等異常原因，致使二分體階段后的大孢子細(xì)胞無法正常進行生長發(fā)育等生命活動，從而導(dǎo)致雄性不育。

‘瀟湘華秀’花粉中無脂質(zhì)、可溶性糖、淀粉的積累，花蕾中可溶性糖、淀粉、游離脯氨酸的含量顯著低于親本‘丹紅紫葉’和大花紫薇，說明‘瀟湘華秀’花蕾內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)積累較少，這可能與其不育性有關(guān)。

3.2 討 論

植物不育類型分為雄性不育、雌性不育、雌雄性皆不育。目前國內(nèi)外對植物雄性不育系研究較多，在水稻、柑橘[7]、油茶[9]、煙草[10]、楊樹[11]、白菜[12]等重要經(jīng)濟植物種中都有報道。雄性不育的發(fā)生一般是減數(shù)分裂時期的染色體行為[13]、紡錘體行為[14]、絨氈層程序性死亡[15]、胼胝質(zhì)沉積、花藥開裂等生命活動發(fā)生異常引起?！疄t湘華秀’的雄性不育是以染色體行為異常為主，絨氈層程序性死亡異常和花藥萎縮協(xié)同導(dǎo)致的雄性不育。植物雌性不育一般是減數(shù)分裂異常[16]、雌蕊柱頭或花柱退化或發(fā)育異常[17]、胚珠發(fā)育異常[18]造成的，但是大部分的雌性不育現(xiàn)象，都是減數(shù)分裂異常無法分化出正常的功能性大孢子導(dǎo)致，這與本研究結(jié)果一致。

在植物界中，遠(yuǎn)緣雜交通常會出現(xiàn)生殖隔離，表現(xiàn)為父母本雜交不親和的合子前生殖障礙[19]和雜交受精卵不能正常發(fā)育為單獨個體的合子后生殖障礙[20]，有學(xué)者對紫薇屬的種間雜交的生殖隔離與不育現(xiàn)象進行了相應(yīng)的報道，發(fā)現(xiàn)川黔紫薇和紫薇的正反交組合會由于花柱中胼胝質(zhì)的大量積累導(dǎo)致花粉管無法正常伸長到子房，合子前生殖障礙讓二者無法產(chǎn)生受精卵[21]；在有關(guān)不育紫薇‘湘韻’的細(xì)胞學(xué)研究之中，指出了不育紫薇的花粉存在內(nèi)含物缺失，花粉?？瞻T等現(xiàn)象，并且發(fā)現(xiàn)不育花蕾的花絲細(xì)胞存在嚴(yán)重變形現(xiàn)象[5，22]。

‘瀟湘華秀’高度不育，但其自然狀態(tài)下產(chǎn)生的可萌發(fā)的2n花粉粒可作為紫薇育種的重要材料。2n雄配子是自然界中三倍體植物的重要來源，一般認(rèn)為高溫等外界條件的影響可以促使小孢子減數(shù)分裂時期發(fā)生異常，從而誘導(dǎo)植物產(chǎn)生2n雄配子。‘瀟湘華秀’中存在只進行一次減數(shù)分裂的二分體，和只有一半染色體排列在赤道板上在進行著絲點的分裂的減數(shù)第二次分裂中期的細(xì)胞，這與高溫誘導(dǎo)油茶產(chǎn)生2n花粉粒的相關(guān)研究之中誘導(dǎo)2n雄配子時出現(xiàn)的染色體異常分裂行為相似[23]，至于二者2n雄配子出現(xiàn)的內(nèi)在機理是否一致，還需進一步研究。

植物花粉內(nèi)含物中的可溶性糖和淀粉是與花粉管萌發(fā)相關(guān)的重要營養(yǎng)物質(zhì)，游離脯氨酸廣泛存在于植物體內(nèi)，在植物各項生命活動中承擔(dān)重要功能，尤其是在植物生長旺盛的組織內(nèi)和生殖器官中含量較高，游離脯氨酸在花粉發(fā)育及花粉萌發(fā)等生命進程中作用較大[24]，它是合成相關(guān)蛋白和酶的重要原料[25]，同時也是花粉管萌發(fā)和生長的重要氨源，因此游離脯氨酸含量也在一定程度上與植物可育性存在關(guān)聯(lián)。

大花紫薇[8]和‘丹紅紫葉’紫薇[23]雌雄配子體發(fā)育已有相關(guān)文獻發(fā)表，但大花紫薇和‘丹紅紫葉’紫薇雜交后代不育機理尚是空白，至今未見到從細(xì)胞學(xué)層面解析大花紫薇和紫薇雜交后代不育機理的相關(guān)研究報道。本研究對大花紫薇和‘丹紅紫葉’紫薇雜交后代‘瀟湘華秀’的雌雄配子體發(fā)育過程進行的細(xì)胞學(xué)觀察與相關(guān)生理實驗，可為紫薇不育新品種創(chuàng)制提供重要的理論依據(jù)，但本研究只觀測到了減數(shù)分裂終變期及以后的染色體行為，未對細(xì)線期、偶線期、粗線期及雙線期的染色體行為進行觀察，無法對上述時期的染色體行為進行判斷，下一步應(yīng)該對減數(shù)分裂各相關(guān)時期的染色體進行詳細(xì)觀察，找到染色體落后等異常情況發(fā)生的原因，并從分子層面對‘瀟湘華秀’紫薇的不育機理進行研究。

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[本文編校：吳 毅]