摘 要：【目的】探究基本培養(yǎng)基、激素類型及配比對油茶帶芽莖段芽誘導、芽增殖及無菌苗生根的影響，建立油茶高效快繁體系，為今后‘德油系列’油茶商品化育苗提供技術支撐?！痉椒ā恳杂筒鑳?yōu)良單株‘德油6號’的帶芽莖段為試材，研究基本培養(yǎng)基、生長素、激素配比對芽誘導初代培養(yǎng)，IBA、IAA、KT等激素配比對芽增殖培養(yǎng)，速蘸IBA、水楊酸等處理方法對瓶內外生根培養(yǎng)的影響，確定適宜的消毒方法以及增殖和生根培養(yǎng)基?！窘Y果】IAA與IBA誘導外植體腋芽萌發(fā)顯著高于NAA，且IAA在促進芽伸長方面明顯優(yōu)于IBA；WPM與1/2MS基本培養(yǎng)基對于芽誘導均有較好的生長效果，WPM培養(yǎng)基對芽生長速度方面有促進作用；油茶帶芽莖段芽誘導正交試驗設計采用6-BA、IAA、GA3 3種激素，因素主次：IAA>6-BA>GA3，組合A1 B1 C1：WPM+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+2.0 mg/L GA3，誘導率為93.8%；采用WPM+2.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L IBA+ 1.0 mg/L KT，增殖系數(shù)為3.14，且生長強壯，葉片翠綠；對單芽處理其基部速沾5.0 mg/mL IBA（10 s）+1.0 mg/L水楊酸（20 s），生根效果明顯，接入1/2MS（4 g/L瓊脂）空白培養(yǎng)基生根率高達90.9%，而接入扦插基質為蛭石+珍珠巖=1∶1時，生根率達到了87.5%?！窘Y論】建立了油茶帶芽莖段的組培快繁體系，尤其是采用速蘸高濃度生長素的方法，通過瓶內外生根的方式達到了較高的生根率。

關鍵詞：油茶；組織培養(yǎng)；帶芽莖段；誘導；叢生苗；生根

中圖分類號：S794.4 文獻標志碼：A 文章編號：1673-923X（2024）07-0130-10

基金項目：湖南省創(chuàng)新型省份建設專項（2021NK1007）；長沙市“揭榜掛帥”重大科技專項（Kq2102007-02）。

Tissue culture through the stem segment with buds of‘Deyou No. 6’ Camellia oleifera

LI Ziyu1， HOU Silu1， ZHOU Bicheng2， WU Juntao1， HU Yingjie1， YUAN Deyi1， FAN Xiaoming1

（1.a.The Key Laboratory of Non-wood Forest Products of National Forestry and Grassland Administration； b. Hunan Key Laboratory of Colleges and Universities of Oil Tea Breeding， Central South University of Forestry Technology， Changsha 410004， Hunan， China； 2. Forest Tree and Seedling Administrative General Station of Hubei Provincial Forestry Bureau， Wuhan 430079， Hubei， China）

Abstract：【Objective】To explore the effects of basic medium， hormone type and ratio on the bud and stem segment of Camellia oleifera belt， establish an efficient and rapid propagation system for C. oleifera in order to provide technical support for the commercial cultivation of C. oleifera in the future.【Method】The stem segment with bud of a superior C. oleifera plant ‘Deyou No. 6’ was used as the test material to study the effects of basic medium， growth hormone and hormone ratio on primary bud induction culture， IBA， IAA， KT and other hormone ratio on proliferation culture， and quick dip IBA， salicylic acid treatment methods on rooting culture inside and outside the bottle. Determine appropriate disinfection methods and breeding and rooting media.【Result】The axillary bud germination induced by IAA and IBA was significantly higher than NAA， and IAA was significantly better than IBA in promoting bud elongation. Both WPM and 1/2MS basic medium had good growth effect on bud induction， but WPM medium promoted the growth rate of bud. The orthogonal experiment of bud induction in stem segment of oil tea belt was designed with three hormones， 6-BA， IAA and GA3， and the main factors were IAA>6-BA>GA3， A1B1C1： WPM+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+2.0 mg/L GA3， and the induction rate was 93.8%. With WPM+2.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L IBA+1.0 mg/L KT， the proliferation coefficient was 3.14， and the leaves were strong and green. For single bud treatment， the rooting effect was obvious when the base of the bud was rapidly soaked with 5.0 mg/mL IBA（10 s）+1.0 mg/L salicylic acid （20 s）. The rooting rate reached 90.9% when the blank medium of 1/2MS （4g/L Agar） was added， and the rooting rate reached 87.5% when the medium of vermiculite+perlite was 1∶1.【Conclusion】The tissue culture and rapid propagation system of buds and stems of C. oleifera was established， especially the method of rapid dipping with high concentration of auxin was used to achieve a higher rooting rate by rooting inside and outside the bottle.

Keywords： Camellia oleifera； tissue culture； stem segment with bud； induction； clustered seedlings； rooting

油茶Camellia oleifera作為我國特有的木本油料樹種[1]，具有巨大的發(fā)展優(yōu)勢和潛力，并且油茶林兼生態(tài)效益、經濟效益和社會效益于一身，也可作為我國糧油保障的后盾和支持。通過油茶組織培養(yǎng)可以對一些優(yōu)良種質資源離體保存和快速繁育，不僅能周年供苗，而且成本低廉。然而油茶組織培養(yǎng)面臨繁殖系數(shù)低、生根困難和移栽成活率低等問題，致使組培技術難以應用于實際生產。選用帶芽莖段作為外植體，利用組織培養(yǎng)的方式進行快繁誘導叢生芽，培養(yǎng)周期短，可短時間大量繁殖，既能保持其優(yōu)良基因性狀，也能產生整齊一致的苗木。部分物種已經建立起較為完善高效的快繁體系[2-4]，而對于油茶前人也有一定的研究，如黃莉雅[5]發(fā)現(xiàn)7月是采集的帶芽莖段最佳時期，通過篩選植物激素配比得到MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA 誘導愈傷組織和芽的效果最優(yōu)。由于油茶的遺傳背景和倍性較為復雜，品種也較多，使得不同品種之間的培養(yǎng)條件差異較大，且大部分油茶可以順利進行芽誘導和增殖，卻難以攻克生根和移栽的環(huán)節(jié)，因此直接影響了油茶的工廠化生產步伐以及組培技術的推廣應用。

‘德油6號’為“德油系列”油茶優(yōu)良單株之一，該系列均為攸縣油茶良種‘攸雜2號’與普通油茶良種‘華碩’種間雜交后代，由中南林業(yè)科技大學經濟林培育與保護教育部重點實驗室袁德義教授團隊通過10余年遠緣雜交技術選育出的新種質。該種質具有果大皮薄、含油量高，品質優(yōu)，抗病性強等優(yōu)點。本研究以‘德油6號’油茶帶芽莖段為材料，對油茶組培快繁體系中芽誘導、增殖和高效生根培養(yǎng)進行研究，從而建立起完善的油茶組培快繁體系，為油茶的大量生產和種苗繁育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

2022年4—5月，于湖南長沙中南林業(yè)科技大學油茶試驗基地，剪取油茶優(yōu)良單株‘德油6號’強壯且健康的半木質化帶芽莖段。本研究初代和增殖培養(yǎng)基均附加30 g/L蔗糖、7.5 g/L瓊脂，調制其pH值為5.8。

1.2 方 法

1.2.1 芽誘導生長素的篩選

以1/2MS為基本培養(yǎng)基，固定添加2.0 mg/L 6-BA，同時分別添加激素IAA、IBA、NAA（均為1.0 mg/L）以誘導油茶腋芽分化。1.2.2 芽誘導基本培養(yǎng)基的篩選

將油茶帶芽莖段接種在MS、1/2MS和WPM 3種不同的基本培養(yǎng)基上，添加相同水平的植物激素2.0 mg/L 6-BA和1.0 mg/L IAA。

1.2.3 芽誘導植物激素及配比的篩選

以WPM為基本培養(yǎng)基，并采用以下3種植物激素IAA（1，1.5，2.0 mg/L）、6-BA（1.0，1.5，2.0 mg/L）和GA3（0，1.0，2.0 mg/L）進行了L9（34）正交試驗設計，共9個處理。

1.2.4 叢生芽誘導單因素試驗

以WPM為基本培養(yǎng)基，將初代培養(yǎng)中獲得的無菌芽接種于增殖培養(yǎng)基中。按篩選順序分為A、B、C、D 4組，A組篩選增殖最適生長素種類，B組篩選增殖最適生長素濃度，C組篩選最適6-BA濃度，D組篩選最適增殖培養(yǎng)基。培養(yǎng)40 d后觀察芽的生長狀況，以增殖芽數(shù)、芽長勢作為評價指標。

1.2.5 生根培養(yǎng)

1）瓶內生根

將增殖培養(yǎng)中所獲得的生長健壯，長勢基本一致的無菌苗（高2～4 cm）作為材料，去除靠近基部的葉片，下部留有1 cm之后進行速沾處理。按篩選順序分為A、B、C、D 4組，A組篩選IBA最適速沾時間，B組篩選IBA+水楊酸最適速蘸搭配時間，C組篩選最適基本培養(yǎng)基，D組在前3組（A組、B組、C組）所得最佳處理方法的基礎上，進行降低蔗糖濃度、添加維生素B3和添加蛭石3組實驗（表1）。40 d后統(tǒng)計存活率與生根率，觀察小苗生長狀態(tài)，以及根系數(shù)量、長度、狀態(tài)和發(fā)生部位等，以篩選最優(yōu)生根處理方法與生根培養(yǎng)基。

2）瓶外生根

選取生長狀況一致的單芽，采用瓶內生根最適處理方法處理后，按照A. 蛭石∶椰土∶泥炭= 1∶1∶2、B. 蛭石∶椰土=1∶1和C. 蛭石∶珍珠巖= 1∶1扦插入基質中。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2022和SPSS 25.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 生長素對油茶芽誘導的影響

當細胞分裂素6-BA濃度一定時（2.0 mg/L），分別添加相同濃度（1.0 mg/L）的IAA、IBA、NAA中腋芽誘導率和生長表現(xiàn)存在明顯差異（表2）。6-BA與IAA組合的培養(yǎng)基，其誘導率最高，萌發(fā)速度最快，芽體健壯，葉片大而翠綠，且有一定的增殖效果；6-BA與IBA組合的培養(yǎng)基誘導率略低，雖也有一定的增殖效果，但生長速率明顯慢于IAA組合；6-BA+NAA處理組，芽萌動明顯晚于其他兩組，且多數(shù)芽呈現(xiàn)隱而不發(fā)，基部生長出大量愈傷組織，最終整個帶芽莖段褐化死亡（圖1）。

結合芽萌動的時間和芽的長勢綜合分析，IAA在3種激素處理中對芽的誘導效果最好，IBA次之，NAA最差。由此得出結論，在WPM作為芽誘導基本培養(yǎng)基的同時，最適合芽誘導的生長素為IAA。

2.2 基本培養(yǎng)基對油茶芽誘導的影響

接種在MS和1/2MS培養(yǎng)基上的帶芽莖段均在16 d后開始萌動，1/2MS培養(yǎng)基的腋芽翠綠色，長勢良好；MS培養(yǎng)基中帶芽莖段不僅誘導率低，芽淺綠色并且長勢一般（表3）。而WPM中接種的帶芽莖段則在12 d左右腋芽開始萌動，約35 d時抽出1～2 cm芽體，隨后葉片展開，50 d后新芽生長至4～5 cm（圖2）。因此，WPM培養(yǎng)基為油茶帶芽莖段誘導的理想基本培養(yǎng)基，不僅誘導率高，且芽體長勢好，嫩莖粗，莖節(jié)長，葉片翠綠健康，植株生長健壯。

2.3 植物激素配比對油茶芽誘導的影響

已有研究表明，GA3促進油茶芽誘導，因此本研究在確定以WPM作為基本培養(yǎng)基，添加6-BA和IAA基礎上，進一步開展加入GA3的正交試驗。結果表明，隨著GA3濃度的增加，芽誘導率隨之增加（表4），即GA3對油茶芽誘導有積極的影響。通過極差分析可知，3個因素指標值為B>A>C，即IAA>6-BA>GA3；生長素IAA是油茶帶芽莖段芽誘導的主要影響因素（R=0.52）。因此，油茶帶芽莖段芽誘導最適培養(yǎng)基配方為：WPM+ 1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+2.0 mg/L GA3。

2.4 植物生長調節(jié)劑對油茶芽增殖的影響

IAA與IBA生長素對芽苗均有一定的增殖效果，IAA主要促進了芽苗縱向生長，莖節(jié)增長，而IBA濃度達到0.5 mg/L時，雖然增殖效果明顯，但長時間繼代后激素累積導致芽苗葉片發(fā)黃，頂芽預熱漸漸褐化死亡，之后將IBA濃度降低至 0.25 mg/L時，芽苗長勢健康，并且有十分明顯的增殖效果；雖然高濃度的細胞分裂素可以有效促進芽苗增殖，但是當6-BA濃度達到4.0 mg/L時，新生芽弱小且容易死亡，葉面卷曲畸形，當6-BA濃度降低為2.0 mg/L時，增殖效果好，且芽苗生長健康；添加0.2～1.0 mg/L TDZ時芽苗均死亡（表5）。

A組篩選出最適增殖的生長素為IBA；B組篩選出最適增殖的IBA濃度為0.25 mg/L；C組篩選出最適增殖的6-BA濃度為2.0 mg/L；最終篩選出最適增殖培養(yǎng)基為WPM+2.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/ L IBA+1.0 mg/L KT，增殖系數(shù)為3.14，且生長強壯翠綠（圖3）。

2.5 生根培養(yǎng)

2.5.1 瓶內生根

A組：通過速沾IBA外源激素可誘導生根，誘導率隨著處理時間的增加而升高。當處理時間為10 s時，無菌苗生根率高，根數(shù)量多且強壯，可見側根產生，且后期生長狀態(tài)好。而處理時間降低為5 s時，生根率低，根數(shù)量少，根細弱；處理時間提高至15 s時，雖然無菌苗生根率最高，根數(shù)量最多且長，但無菌苗葉片邊緣枯萎，部分葉片變黃掉落的現(xiàn)象，后期生長狀態(tài)差。

B組：通過IBA（10 s）+水楊酸（20 s）處理下，平均根長最長，平均根數(shù)較多，根毛豐富，有側根長出，且單苗生長狀況健康。

C組：選擇1/2MS作為基本培養(yǎng)基時，生根率最高，為90.9%。選擇1/4MS作為基本培養(yǎng)基時，生根率相較于1/2MS有所降低但仍然高于MS，過低濃度的無機鹽含量會導致根數(shù)細弱，根數(shù)少；選擇MS作為基本培養(yǎng)基時，生根率只為27.2%，可能是因為MS培養(yǎng)基氮含量較高造成的。

D組：選擇1/2MS培養(yǎng)基內蔗糖含量為15 g/L時，無菌苗生長狀態(tài)差，生根率明顯降低；添加1 mg/L B3時，雖然B3有促進生根的作用，但添加后生根率反而降低；選擇蛭石+1/2MS時，基部生長出明顯的愈傷組織，平均根長較短，根系質量較好，但整體生根率較低（表6）。

瓶內生根的無菌苗約在培養(yǎng)20 d時大部分產生1～3 mm的根；40 d時根系生長明顯，長度約2～3 cm；經過一次繼代后，根系長度達到4～ 6 cm，且可見側根產生，部分根系變粗（圖4），最終選擇基部速沾5.0 mg/mL IBA（10 s）+1.0 mg/L水楊酸（20 s）誘導生根。

2.5.2 瓶外生根

將健壯的無菌苗經IBA（10 s）+水楊酸（20 s）處理，扦插入基質后及時噴灑定根水，10 d時基部出現(xiàn)明顯的愈傷組織；20 d 時可見部分根部長出為1～3 mm，愈傷組織變大；40 d時根系明顯，根系變長，根毛明顯；60 d時可明顯看見有側根長出（圖5B）。

扦插至2號基質的苗短時間內存活率較高達到76.1%，但生根率最低（23.2%），1個月后基質內仍然潮濕，拔出苗可見基部變黑，出現(xiàn)爛根現(xiàn)象；1號基質需補澆1～2次，生根率達到57.9%；3號基質雖需要經常查看濕度，頻繁補澆3～5次，然存活率最高，為85.0%，且生根率最高（87.5%），爛根現(xiàn)象少，大部分苗生長健康。因此，最佳的生根基質為3號基質，生根率為 87.5%（表7），這說明瓶外生根基質對無菌苗生根率和成活率有較大的影響。

3 討 論

3.1 植物生長調節(jié)劑對油茶芽誘導與增殖的影響

植物生長調節(jié)劑對組培苗的生長和增殖有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在芽誘導階段中只使用6-BA+IAA時，腋芽萌發(fā)率已達到92.6%，通過后續(xù)正交實驗證明IAA對芽誘導的影響最大，張騏飛等[6]海大4號的芽誘導中也有類似的發(fā)現(xiàn)[7]。當然，前人對油茶芽誘導研究中也有與此不同的結果[8-11]，如柯丹萍[8]發(fā)現(xiàn)油茶品種‘長林166’腋芽萌發(fā)誘導中NAA影響最為顯著，劉海英[9]發(fā)現(xiàn)NAA對油茶腋芽啟動率有極顯著影響等，這可能是品種之間的差異性導致的。6-BA和GA3也對芽誘導有積極的影響，但影響小于IAA。GA3本身對植物芽葉的生長和莖的伸長就有著重要的促進作用，植物可通過赤霉素合成和赤霉素細胞信號轉導途徑調控植物的生長發(fā)育過程[12]，且結果顯示赤霉素對芽誘導的影響隨著0～2.0 mg/L的增加效果越明顯，這說明本研究中選取的赤霉素濃度之間梯度過小，之后提高赤霉素濃度（>2.0 mg/L）可能對油茶芽誘導有更顯著的影響。

不同植物生長調節(jié)劑對增殖培養(yǎng)的影響各不相同[13-14]，且較高濃度的細胞分裂素對大部分組培苗增殖有較好的效果，常以高濃度細胞分裂素和低濃度生長素協(xié)同使用效果較為理想，如王瑞等[15]使用5.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+1.0 mg/L生物素為最佳組合，增殖系數(shù)高達3.90。但生長調節(jié)劑的種類過多或水平過高，也會刺激外植體的多酚氧化酶活性，加速外植體褐變甚至壞死[16]。本研究發(fā)現(xiàn)在添加了相同濃度IBA（0.25 mg/L）時，隨著6-BA濃度增加時，增殖系數(shù)呈先增加后下降的趨勢，以2.0 mg/L 6-BA配方增殖系數(shù)最高，過高的6-BA（4.0 mg/L）影響芽苗伸長，較嫩的無菌芽在增殖過程中容易發(fā)生褐化、葉面卷曲畸形和葉片脫落，最終死亡[6]。相較于只使用6-BA，6-BA和KT配合使用時，試管苗獲得了最大增殖效率。在細胞分裂素與生長素協(xié)同使用方面，IBA和IAA均有促進增殖的效果，但在長時間培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，添加IBA時芽苗生長健壯，效果更佳，而添加IAA時莖尖褐化死亡的現(xiàn)象極易發(fā)生，有部分學者發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基內添加CA、PVP、甘露醇和AgNO3等能有效防止褐化[17-18]，可在之后實驗中進一步探究。

3.2 油茶瓶內外生根對比及移栽

本研究通過速沾高濃度生長素的方法[19-21]進行瓶內外生根，發(fā)現(xiàn)瓶內生根中未添加蛭石時生根率為90.9%，但根系常浮于培養(yǎng)基表面不向下扎根，而添加蛭石時，根系全部向下扎根，但生根率降低至66.6%。此結果與吳麗君等[22]發(fā)現(xiàn)使用沙蛭石基質在前期進行無糖培養(yǎng)最優(yōu)和趙潔等[23]發(fā)現(xiàn)使用珍珠巖作為基質不如普通瓊脂中生根的結果相似，這可能與油茶根系需要較好的通氣性有關。進行瓶外生根時發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基質為V蛭石∶V珍珠巖= 1∶1時，生根率達到87.5%，而在V蛭石∶V椰土∶ V泥炭=1∶1∶2的培養(yǎng)基質時生根率最低（23.2%），這可能與泥炭的保水性好，通氣性差，導致基質內含水率過高使芽苗基部腐爛不易生根，從而不利于植株的生長[24]有關，該結果表明不同的培養(yǎng)基質對于油茶生根有影響顯著。

在移栽過程中，瓶內生根的苗長期處于高濕度，溫度波動小的無菌環(huán)境[25]，雖然生根率較高，但瓶內生根的苗較難適應外界變化，移栽死亡率高，移栽難度大。而瓶外生根的苗移栽成活率高于瓶內生根，因為瓶外生根所產生的根恢復能力和吸收功能更強，且在生根過程中逐步經過了自然環(huán)境的鍛煉，適應了自然環(huán)境，弱苗在此過程中便已被淘汰[26]?？傮w來說，雖然瓶外生根率（87.5%）相較于瓶內生根率（90.9%）低，但結合移栽情況發(fā)現(xiàn)瓶外生根的苗存活率遠高于瓶內生根，且通過直接瓶外生根的方式可以將煉苗與生根同時進行，大幅度降低生產成本，本研究認為油茶瓶外生根法最優(yōu)。

3.3 展 望

近年來，由于油茶細胞工程育種與基因工程育種的興起[26]，對組織培養(yǎng)技術有了更高的需求。目前中國的油茶組織培養(yǎng)具有大量的研究成果，但仍然存在生根困難，移栽存活率低等問題。相關研究表明[27]，不同油茶物種組織培養(yǎng)的適宜基本培養(yǎng)基、生長調節(jié)劑、培養(yǎng)環(huán)境均有所不同，因此需要建立不同種類油茶組織培養(yǎng)的體系。針對其他未進行組培探索的油茶品種，可以在此基礎上進一步調整植物激素濃度和其他添加物類型，進而更有效地提高油茶組培快繁的效率，縮短快繁體系的建立時間。

4 結 論

最優(yōu)芽誘導培養(yǎng)基為WPM+1.0 mg/L 6-BA+ 1.0 mg/L IAA+2.0 mg/L GA3，主要影響因子為IAA，誘導率為93.8%。

最適芽增殖培養(yǎng)基為WPM+2.0 mg/L 6-BA+ 0.25 mg/L IBA+1.0 mg/L KT，增殖系數(shù)為3.14，且生長強壯，葉片翠綠。

最適生根方法為瓶外生根，單苗速沾5.0 mg/mL IBA（10 s）+1.0 mg/L 水楊酸（20 s）后，插入蛭石+珍珠巖=1∶1基質中，40 d生根率達87.5%，苗木長勢較好，且將煉苗與生根同時進行，有效縮短了油茶快繁體系建立的時間。

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[本文編校：吳 毅]