摘 要：【目的】多巴雙加氧酶（4，5-DOPA dioxygenase extradiol）是甜菜色素生物合成途徑的關(guān)鍵酶之一，能催化多巴分解形成甜菜醛氨酸，也是最可能與三角梅最終的花色形成相關(guān)的酶蛋白?？寺∪敲范喟碗p加氧酶基因的開放閱讀框（ORF），對(duì)其編碼的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探討三角梅花色變化機(jī)理和甜菜色素代謝途徑?！痉椒ā恳匀敲菲贩N‘綠葉櫻花’的苞片為材料，提取其RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，之后快速轉(zhuǎn)化完成基因的克隆和基因PCR擴(kuò)增，最后對(duì)其編碼的氨基酸序列進(jìn)行保守區(qū)預(yù)測、信號(hào)肽分析、磷酸化位點(diǎn)預(yù)測、跨膜信號(hào)預(yù)測、同源性比對(duì)、構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹以及二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，研究其氨基酸序列的結(jié)構(gòu)和功能?！窘Y(jié)果】‘綠葉櫻花’的多巴雙加氧酶基因ORF序列長801 bp，編碼266個(gè)氨基酸。ORF序列所編碼的氨基酸序列具有cd07363保守結(jié)構(gòu)域，其編碼蛋白是一種穩(wěn)定的酸性親水蛋白，分子量為29 734.76 kD，等電點(diǎn)為6.26，二級(jí)結(jié)構(gòu)包含了11個(gè)α螺旋、7個(gè)β轉(zhuǎn)角、20個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)，具有4個(gè)磷酸化位點(diǎn)，沒有跨膜結(jié)構(gòu)，可能只在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用。該序列還與66個(gè)序列高度同源，與同科的‘金心雙色’、膠果木和梭房葉子花有著相同的進(jìn)化分支，符合自然進(jìn)化規(guī)律?！窘Y(jié)論】‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶開放閱讀框ORF的氨基酸序列屬于第三類雌二醇雙加氧基因家族，具有該基因家族具有的保守氨基酸序列，表明多巴雙加氧酶基因在生成甜菜色素植物中具有獨(dú)特的保守性，且屬于穩(wěn)定、酸性的親水蛋白，沒有跨膜結(jié)構(gòu)，可能只在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用。三角梅中控制花色變化的主要是甜菜色素，研究三角梅甜菜色素合成途徑中的關(guān)鍵酶，解析其甜菜色素的合成代謝機(jī)制，可為三角梅花色形成機(jī)制提供理論參考，有望在今后的工作中，利用轉(zhuǎn)基因手段豐富三角梅花色。

關(guān)鍵詞：三角梅；多巴雙加氧酶；開放閱讀框；氨基酸序列；克隆

中圖分類號(hào)：S718.46 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-923X（2024）07-0153-12

基金項(xiàng)目：云南省重大科技計(jì)劃專項(xiàng)（202302AE090018）。

Cloning and analysis of open reading frame （ORF） of 4，5-DOPA dioxygenase in Bougainvillea peruviana

LI Jianyun1， YAO Guoqiong2， WANG Fei1， ZHU Wen1， LI Zihan1， SUN Zhenghai1， XIN Peiyao1

（1. Southwest Landscape Architecture Engineering Technology Research Center of National Forestry and Grassland Administration， Southwest Forestry University， Kunming 650224， Yunnan， China； 2. State-owned Weidu Forest Farm of Guangxi， Laibin 546100， Guangxi， China）

Abstract：【Objective】DOPA dioxygenase extradiol is one of the key enzymes in the beet pigment biosynthesis pathway， which can catalyze the decomposition of dopa to form beet aldehydanine. And it is also the most likely enzyme protein related to the final flower color formation of Bougainvillea peruviana. The open reading frame （ORF） of B. peruviana dioxygenase gene was cloned， and the amino acid sequence encoded by it was analyzed by bioinformatics to explore the mechanism of flower color change and the metabolic pathway of beet pigment.【Method】Taking the bracts of B. peruviana as materials， RNA was extracted， reverse transcription was carried out，and then gene cloning and gene PCR amplification were completed by rapid transformation. Finally， conserved region prediction， signal peptide analysis， phosphorylation site prediction， transmembrane signal prediction， homology comparison， phylogenetic tree construction and secondary and tertiary structure prediction were performed for the encoded amino acid sequence， the structure and function of amino acid sequence were studied.【Result】The 4，5-DOPA dioxygenase gene ORF sequence of B. peruviana was 801 bp in length， encoding 266 amino acids. The amino acid sequence encoded by the ORF sequence had a conserved domain of cd07363. The encoded protein was a stable acidic hydrophilic protein with a molecular weight of 29734.76 kD and an isoelectric point of 6.26. The secondary structure contained 11 α-helixes， 7 β-turns， and 20 β-sheets. It had 4 phosphorylation sites and no transmembrane structure. The sequence was also highly homologous to 66 sequences， with B. peruviana had the same evolutionary branch as B. peruviana Thimma， B. stipitata Griseb and Pisonia umbellifera， which was consistent with the law of natural evolution.【Conclusion】The amino acid sequence of the dopa dioxygenase open reading frame ORF of B. peruviana belongs to the third type of estradiol dioxygenase gene family， which has the conserved amino acid sequence of the gene family， indicating that the dopa dioxygenase gene has a unique conservatism in the production of beet pigment plants， and belongs to a stable， acidic hydrophilic protein. There is no transmembrane structure， and it may only play a role in the cytoplasm. Beet pigment is the main factor controlling the change of flower color in B. peruviana. Studying the key enzymes in the synthesis pathway of beet pigment in B. peruviana and analyzing the synthesis and metabolism mechanism of beet pigment can provide theoretical reference for the formation mechanism of flower color in B. peruviana. It is expected to enrich the flower color of B. peruviana by transgenic means in the future work.

Keywords： Bougainvillea peruviana； 4，5-DOPA dioxygenase； open reading frame； amino acid sequence； cloning

三角梅Bougainvillea peruviana為紫茉莉科Nyctaginaceae葉子花屬Bougainvillea植物，多藤本或灌木，少喬木[1]。原產(chǎn)于巴西，主要分布于中國、巴西、阿根廷、日本等國家[2]，目前已成為中國華南地區(qū)生產(chǎn)栽培和景觀應(yīng)用規(guī)模最大的園藝植物之一[3]。三角梅不僅觀賞性強(qiáng)，還可入藥[4]、開發(fā)天然食用色素[5]、用于生物防治及環(huán)境保護(hù)等[6]。已有研究表明，影響花色的因素有很多，如花瓣細(xì)胞內(nèi)的理化環(huán)境[7]、花青素[8]、甜菜色素[9]和類胡蘿卜素[10]等，而對(duì)三角梅花色起主要作用的是甜菜色素[11-12]。甜菜色素合成代謝的研究始于20世紀(jì)90年代，其合成途徑主要包括酶促反應(yīng)和自發(fā)反應(yīng)，且反應(yīng)起始于酪氨酸[13]。在甜菜色素的合成途徑中，多巴雙加氧酶（4，5-DOPA dioxygenase extradiol）是甜菜色素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，它催化多巴4號(hào)、5號(hào)位碳鍵斷裂生成4，5-開環(huán)多巴，4，5-開環(huán)多巴自發(fā)轉(zhuǎn)化為甜菜色素的發(fā)色集團(tuán)-甜菜醛氨酸[9]。而高等植物太陽花中的多巴雙加氧酶基因最早被克隆，且屬4，5-多巴雌二醇雙加氧酶類[14-15]。隨著基因克隆技術(shù)的發(fā)展，Harris等[16]將來自真菌毒蠅傘的多巴雙加氧酶基因轉(zhuǎn)化至擬南芥，再施加多巴培育，得到了變黃或變橘紅色的擬南芥幼苗，并且也還檢測到了甜菜黃素的產(chǎn)生。Nakatsuka等[17]將來自紫茉莉的多巴雙加氧酶基因表達(dá)于煙草和擬南芥，成功重建甜菜素的生物合成途徑。阮園[18]使用TAIL-PCR法首次成功地從鹽地堿蓬基因組中克隆了4，5-多巴雙加氧酶II基因SsDODA的啟動(dòng)子片段，并證明了鹽地堿蓬SsDODA啟動(dòng)子片段能夠驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS在煙草葉片中表達(dá)。這些研究為4，5-多巴雙加氧酶在植物色彩變化中起著一定的作用提供了理論依據(jù)。

對(duì)于觀賞植物來說，花色是評(píng)價(jià)其觀賞價(jià)值和進(jìn)行品種分類的重要指標(biāo)[19]。三角梅品種繁多，且花色豐富，在城市園林景觀配置中占有十分重要的地位[20]。目前，對(duì)三角梅花色方面的研究相對(duì)較多，如Florian等[21]應(yīng)用液相色譜—質(zhì)譜等方法對(duì)三角梅花色進(jìn)行研究，獲得了三角梅中甜菜色素的分子結(jié)構(gòu)；Zhang等[22]利用轉(zhuǎn)錄組分析揭示了三角梅花苞片顏色形成的規(guī)律，鑒定了三角梅甜菜色素生物合成相關(guān)基因，并確定了花瓣、雄蕊和心皮的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)；徐夙俠等[23]對(duì)三角梅甜菜色素代謝酶多巴雙加氧酶基因進(jìn)行分離和表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)與花的顏色鮮艷程度直接相關(guān)。這些研究多集中于三角梅部分色素合成關(guān)鍵酶基因的分離表達(dá)和轉(zhuǎn)錄組分析，對(duì)花色性狀相關(guān)的分子機(jī)制研究仍缺乏必要的理論支撐。如前所述，對(duì)三角梅花色起主要作用是甜菜色素，而多巴雙加氧酶是該途徑中的關(guān)鍵酶之一。開放閱讀框是基因序列的一部分，是預(yù)測基因編碼區(qū)域的重要標(biāo)志，它提供了一種可能的蛋白質(zhì)翻譯模板，在基因組分析和基因克隆的研究中，識(shí)別開放閱讀框是尋找新基因和理解其功能的關(guān)鍵步驟之一[24]。目前，有關(guān)三角梅多巴雙加氧酶開放閱讀框（ORF）克隆與分析方面的研究還未見相關(guān)報(bào)道，對(duì)三角梅品種‘綠葉櫻花’Bougainvillea peruviana多巴雙加氧酶開放閱讀框進(jìn)行克隆，分析其編碼的氨基酸序列，進(jìn)而探究三角梅多巴雙加氧酶基因在甜菜色素合成過程中的功能和作用，可為三角梅花色形成機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

來源于云南省彌勒市吉成園林科技股份有限公司三角梅基地，取三角梅品種‘綠葉櫻花’的苞片為多巴雙加氧酶（ORF）克隆的材料（圖1），材料放于液氮速凍后存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取、檢測與逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成

以美吉RNA試劑盒提取三角梅品種‘綠葉櫻花’苞片的RNA，以1%瓊脂糖凝膠檢測RNA完整性，核酸蛋白測定儀ND2000檢測RNA濃度及質(zhì)量。以天根逆轉(zhuǎn)錄試劑盒完成逆轉(zhuǎn)錄，RNA均稀釋至50 ng/μL。反應(yīng)體系：5×FastKing-RT Super Mix 4 μL，50 ng/μL RNA 2 μL，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足到20 μL，于冰上進(jìn)行加樣。反應(yīng)程序：42 ℃15 min（去除基因組及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），95 ℃3 min（酶滅活）。

1.2.2 多巴雙加氧酶ORF的PCR擴(kuò)增與克隆

使用TBtools[25]軟件搜索多巴雙加氧酶（TRINITY-DN4651-c0-g1）ORF區(qū)域，再通過Primer5[26]軟件在序列兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，參數(shù)設(shè)置為預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物100～500 bp，引物長度18～24 bp，退火溫度50～60 ℃，從5對(duì)引物中挑選出2對(duì)，得到的預(yù)期產(chǎn)物為852 bp（表1）。對(duì)ORF的PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測，模板為上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。PCR 反應(yīng)體系25 μL：1-5TM 2X High-Fidelity Master Mix 12.5 μL，上/下引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 9.5 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性2 min；擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為98 ℃變性10 s，59 ℃退火15 s，72 ℃延伸（30、60、90 s）；72 ℃延伸5 min后，25℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于凝膠成像儀上拍照記錄。使用擎科PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒回收目的片段。回收并純化后使用pClone007 Versatile Simple Vector Kit連接目的片段，連接反應(yīng)體系為：5×pClone007 VS mix 2 μL，PCR物8 μL，ddH2O補(bǔ)至10 μL。室溫（22～30℃）反應(yīng)1～5 min。最后使用TreliefTM 5α Chemically Competent Cell進(jìn)行快速轉(zhuǎn)化，挑選陽性克隆進(jìn)行驗(yàn)證、測序。

1.2.3 多巴雙加氧酶ORF序列分析

目的片段經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化及測序以后，使用ContigExpress軟件拼接序列，再通過Expasy在線翻譯工具（https：//web.expasy.org/translate/）將核苷酸序列翻譯成蛋白序列，最后通過NCBIBLAST在線分析工具對(duì)開放閱讀框序列進(jìn)行分析，分析NCBI數(shù)據(jù)庫中的高度同源序列。

1.2.4 多巴雙加氧酶ORF編碼氨基酸序列分析

使用ProtParam[27]在線分析工具（https：//web. expasy.org/protparam/）對(duì)‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶ORF編碼的氨基酸序列（TRINITY-DN4651-c0-g1）進(jìn)行分析，解析‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶ORF編碼氨基酸組成。

1.2.5 多巴雙加氧酶ORF編碼蛋白保守區(qū)預(yù)測和分析

通過NCBI-Conserved Domain Seae在線分析工具分析‘綠葉櫻花’巴雙加氧酶ORF編碼氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域，分析其屬于的基因家族，并比對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫中與‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶編碼氨基酸序列相似性較高的物種序列。

1.2.6 多巴雙加氧酶ORF編碼蛋白信號(hào)肽及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

使用SignalP 4.1 Server[28]在線分析工具預(yù)測‘綠葉櫻花’ORF編碼蛋白信號(hào)肽，可視化‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶ORF區(qū)蛋白信號(hào)。使用在線氨基酸分析工具NetPhos 2.0對(duì)‘綠葉櫻花’DOPA蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測，可視化‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶ORF區(qū)磷酸化位點(diǎn)。

1.2.7 多巴雙加氧酶ORF編碼蛋白跨膜信號(hào)預(yù)測

通過在線氨基酸序列分析工具TMpred Server[29]對(duì)‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶ORF蛋白進(jìn)行跨膜信號(hào)預(yù)測，根據(jù)‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶ORF蛋白進(jìn)行跨膜信號(hào)值，解析其跨膜結(jié)構(gòu)。

1.2.8 多巴雙加氧酶ORF編碼氨基酸同源性比對(duì)

與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

以‘綠葉櫻花’的多巴雙加氧酶編碼氨基酸為參考序列，使用DNAMAN軟件比對(duì)6種植物的多巴雙加氧酶編碼氨基酸。從NCBI（https：// www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索不同物種的多巴雙加氧酶基因序列，基于Neighbor-Joining法，使用MEGA-X[30]軟件構(gòu)建與同源性較高的物種的多巴雙加氧酶基因進(jìn)化樹，分析的結(jié)果用FigTree（version 1.4.4）進(jìn)行可視化和美化調(diào)整。

1.2.9 多巴雙加氧酶ORF編碼蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用DNAstar-Protean[31]軟件預(yù)測‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶ORF編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，再通過SWISS-MODEL在線分析工具對(duì)‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶ORF編碼蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，可視化‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶ORF編碼蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多巴雙加氧酶基因ORF的PCR擴(kuò)增分析

提取‘綠葉櫻花’苞片的cDNA，并擴(kuò)增多巴雙加氧酶的開放閱讀框。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，72 ℃延伸60 s時(shí)得到位于750～1 000 bp之間的特異性條帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小852 bp相近，且條帶清晰、明亮（圖2），可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 多巴雙加氧酶ORF序列分析

目的片段經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化及測序之后，得到兩段序列，上游引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小為852 bp，下游引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小為827 bp。‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶開放閱讀框全長序列大小為852 bp，該序列的開放閱讀框位于28～829 bp之間，總長801 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。該序列共編碼266個(gè)氨基酸。序列如下（黃色區(qū)域?yàn)橐镄蛄校仙珔^(qū)域?yàn)槠鹗济艽a子和終止密碼子，奇數(shù)行代表的多巴雙加氧酶開放閱讀框全長，序列大小為852 bp，61表示該行從第61個(gè)堿基開始，偶數(shù)行代表的是該序列所編碼的氨基酸，共266個(gè)，12表示該行從第12個(gè)氨基酸開始）。

‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶ORF區(qū)（TRINITY-DN4651-c0-g1）與NCBI數(shù)據(jù)庫中66個(gè)序列具有高度同源性，且同源性均大于70%。其中，與同屬植物‘金心雙色’和梭房葉子花的同源性最高，分別為95.18%和94.81%；與同科異屬植物避霜花Pisonia aculeata膠果木、Acleisanthes obtusa、Acleisanthes lanceolata和紫茉莉Mirabilis jalapa的同源性分別為86.34%、87.83%、82.6%、82.45%和82.44%；與其他科植物如七索藤Ercilla volubilis、冰葉日中花Mesembryanthemum crystallinum、鳳卵Pleiospilos compactus subsp. canus、土人參Talinum spp.和蒜香草Petiveria alliacea的同源性分別為80.39%、81.08%、80.82%、80.23%和80.74%（圖3）。

2.3 多巴雙加氧酶ORF編碼氨基酸序列分析

‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶ORF編碼的氨基酸序列分析結(jié)果表明，多巴雙加氧酶ORF序列分子量為29 734.76 kD，等電點(diǎn)為6.26，表明其偏弱酸性。GRAVY值為-0.31，是親水性蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)為33.61，表明其可穩(wěn)定存在，推測其分子式為C1348H2035N359O384S10。

‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶ORF編碼的蛋白由20種氨基酸組成，其中非極性氨基酸數(shù)量占總氨基酸數(shù)量的44.36%，極性不帶電氨基酸占 30.45%，帶正電荷氨基酸占15.04%，帶負(fù)電氨基酸占10.15%（圖4）。

2.4 多巴雙加氧酶ORF編碼蛋白保守區(qū)預(yù)測和分析

通過NCBI-Conserved Domain Seae在線分析工具搜索‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶ORF編碼氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域。由圖5可知，‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶ORF序列具有一個(gè)cd07363保守結(jié)構(gòu)域，屬雌二醇雙加氧酶-3B類基因家族。該序列與‘金心雙色’、膠果木、避霜花、紫茉莉和冰葉日中花多巴雙加氧酶編碼氨基酸序列的相似性分別為95.18%、87.83%、86.34%、82.44%和81.08%。

2.5 多巴雙加氧酶ORF編碼蛋白信號(hào)肽和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

通過SignalP 4.1 Server在線分析工具預(yù)測‘綠葉櫻花’ORF編碼蛋白信號(hào)肽，結(jié)果如圖6。由圖可知該蛋白不具有信號(hào)肽，不屬于分泌蛋白。通過在線氨基酸分析工具NetPhos 2.0對(duì)‘綠葉櫻花’DOPA蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)大于等于0.5的位點(diǎn)有4個(gè)，因此可以預(yù)測該蛋白的肽鏈中含有4個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為Serine、Threonine、Tyrosine和Threshold（圖7）。

2.6 多巴雙加氧酶ORF編碼蛋白跨膜信號(hào)預(yù)測

生物膜含的蛋白質(zhì)叫膜蛋白，細(xì)胞中普遍存在，是生物膜功能的主要承擔(dān)者。對(duì)‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶ORF蛋白進(jìn)行跨膜信號(hào)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，其跨膜信號(hào)沒有達(dá)到500，因此其沒有跨膜結(jié)構(gòu)，說明該蛋白可能僅在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用，不存在運(yùn)輸，也不是生物膜的膜蛋白（圖8）。

2.7 多巴雙加氧酶ORF編碼氨基酸同源性比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

使用DNAMAN軟件比對(duì)6種植物的多巴雙加氧酶編碼氨基酸，墨藍(lán)色表示氨基酸序列完全相同，紫紅色表示氨基酸序列相似性較高，淺藍(lán)色表示氨基酸序列相似性較低，無色表示氨基酸序列相似度極低。不同植物多巴雙加氧酶基因的編碼氨基酸同源性比對(duì)結(jié)果如圖9所示。由圖9可知，克隆所得的‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶ORF與其他植物多巴雙加氧酶編碼的氨基酸序列差異較大，保守性不高。

從NCBI中搜索不同物種的多巴雙加氧酶基因序列，繪制不同物種的多巴雙加氧酶基因進(jìn)化樹，結(jié)果如圖10所示。由圖10可知，‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶ORF與同科植物‘金心雙色’（>LC542878.1）、膠果木（>KR376166.1）、梭房葉子花（>KR376165.1）的多巴雙加氧酶基因處于同一進(jìn)化分支，其中又與同屬的‘金心雙色’進(jìn)化最相近。在不同物種間的比較中，毒蠅傘Amanita muscaria多巴雙加氧酶在進(jìn)化樹上形成一個(gè)獨(dú)立的分支，表明其與植物多巴雙加氧酶不具有同源性，是獨(dú)立進(jìn)化的。

2.8 多巴雙加氧酶ORF編碼蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

在蛋白質(zhì)的局部片段上，常常會(huì)觀察到主鏈上的周期性規(guī)則構(gòu)象，比如α螺旋和β轉(zhuǎn)角等，這種周期性的規(guī)則主鏈構(gòu)象被稱為二級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶ORF編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白含11個(gè)α螺旋、7個(gè)β轉(zhuǎn)角、20個(gè)β折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)，其組成氨基酸多具有親水性，從抗原指數(shù)來看，其位于抗原性較好的區(qū)段（圖11）。

蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是指由多個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)單元拼裝而成的具有緊密形態(tài)的三維空間結(jié)構(gòu)，對(duì)‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶ORF編碼蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果如圖12所示。由圖12可知，組成該蛋白三級(jí)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為β折疊、α螺旋及β轉(zhuǎn)角，這與上述二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

3.1 討 論

Nobuhiro等[9]通過大腸桿菌表達(dá)該基因重組蛋白，探測了紫茉莉中多巴雙加氧酶基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在花期的5個(gè)階段，盛花期的表達(dá)最強(qiáng)，即花苞的顏色越鮮艷該基因的表達(dá)越高，證明不同時(shí)期的實(shí)驗(yàn)材料會(huì)導(dǎo)致其結(jié)果不同。試驗(yàn)基于三角梅品種‘綠葉櫻花’苞片的轉(zhuǎn)錄組注釋信息，克隆了其多巴雙加氧酶ORF（TRINITY-DN4651-c0-g1）全長序列，該序列共852 bp，ORF全長801 bp，編碼266個(gè)氨基酸，徐夙俠等[32]對(duì)同科紫茉莉的4，5-多巴雙加氧酶基因進(jìn)行克隆，得到ORF序列長度801 bp，編碼267個(gè)氨基酸，這與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。本研究對(duì)ORF區(qū)進(jìn)行生物信息學(xué)分析：預(yù)測該ORF編碼的多肽鏈分子量為29 734.76 kD，等電點(diǎn)為6.26，是一種穩(wěn)定、酸性的親水蛋白；對(duì)三角梅的3個(gè)品種：斯普倫頓斯Bougainvillea spectabilis、斑葉重紅Bougainvillea buttiana和‘金心雙色’的多巴雙加氧酶基因進(jìn)行分析認(rèn)為該基因編碼氨基酸翻譯蛋白分子量分別為33 758、33 076和33 233 kD，等電點(diǎn)分別是5.62、5.54和5.94，與本研究結(jié)果數(shù)據(jù)上存在較大差異，但仍屬于穩(wěn)定、酸性的親水蛋白的范疇。這可能是由于采樣時(shí)期不同所導(dǎo)致的[24]，未來研究中應(yīng)嚴(yán)格把控實(shí)驗(yàn)材料時(shí)期的一致性，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠與準(zhǔn)確，也應(yīng)該利用材料不同時(shí)期積極挖掘其內(nèi)部因素，以更準(zhǔn)確地了解三角梅花色的形成機(jī)理。

將‘綠葉櫻花’ORF核苷酸序列進(jìn)行NCBIBLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與66個(gè)序列高度同源，且同源性均在70%以上，其中與同屬植物‘金心雙色’和梭房葉子花的同源性最高，分別為95.18%和94.81%；并且其多巴雙加氧酶ORF序列具有一個(gè)cd07363保守結(jié)構(gòu)域，由此結(jié)果可知‘綠葉櫻花’的多巴雙加氧酶基因?qū)儆诘谌惔贫茧p加氧基因家族（class Ⅲ extradiol dioxygenase family），具有該基因家族具有的保守氨基酸序列。李霆格等[33]在對(duì)同為被子植物門的三色堇中4，5-多巴二醇雙加氧酶基因研究中發(fā)現(xiàn)，三色堇的DODA基因也屬于雌二醇雙加氧酶-3B類基因家族，與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。將其氨基酸序列與其他植物多巴雙加氧酶氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)其與同科的‘金心雙色’、膠果木和梭房葉子花有著相同的進(jìn)化分支，而曹燕亭等[34]以桃、粉、紅和橙色的重瓣三角梅苞片為材料，克隆的多巴雙加氧酶基因與葉子花Bougainvillea spectabilis和紫茉莉Mirabilis jalapa的多巴雙加氧酶基因親緣關(guān)系較近，研究結(jié)果存在較大差異，這可能與試驗(yàn)材料不同有關(guān)[33]。導(dǎo)致親緣識(shí)別的研究結(jié)果存在差異的主要原因主要與實(shí)驗(yàn)材料的選擇、親緣關(guān)系的界定標(biāo)準(zhǔn)、環(huán)境條件及測定的指標(biāo)不統(tǒng)一有關(guān)[35]。將來的研究應(yīng)重點(diǎn)從生理生化、分子和代謝水平上等多方面深入研究，以便更準(zhǔn)確地鑒別植物之間的親緣關(guān)系。

對(duì)‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶ORF編碼蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致，包含了11個(gè)α螺旋、7個(gè)β轉(zhuǎn)角、20個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)；對(duì)其進(jìn)行跨膜和信號(hào)肽預(yù)測，沒有發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)，具有4個(gè)磷酸化位點(diǎn)，表明其可能只在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用，柏忠良等[36]以小花深紅的葉子花作為實(shí)驗(yàn)材料，預(yù)測該氨基酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)是由8個(gè)α螺旋、8個(gè)β轉(zhuǎn)角、20個(gè)β折疊和一些松散結(jié)構(gòu)組成，對(duì)其DOD蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測可得出該蛋白的肽鏈中含有12個(gè)磷酸化位點(diǎn)，α螺旋和磷酸位點(diǎn)數(shù)量存在較大差異，這也可能是所使用的材料不同所導(dǎo)致的。多巴雙加氧酶能夠在大腸桿菌中產(chǎn)生甜菜色素的基本結(jié)構(gòu)甜菜醛氨酸，這是甜菜色素中的發(fā)色和活性結(jié)構(gòu)單元[37]。通過對(duì)雙加氧酶進(jìn)行酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)雙加氧酶是一種非血紅素類含鐵蛋白，但是目前還未能直接從植物體中提取出多巴雙加氧酶蛋白[38]。因此，應(yīng)該進(jìn)一步挖掘甜菜色素生物合成途徑中其他的基因和酶類，如與糖基化和?；磻?yīng)有關(guān)的基因和酶類，來進(jìn)一步解釋甜菜色素結(jié)構(gòu)多樣性的形成機(jī)制。

目前雖已獲得許多不同花色的三角梅，但仍然缺乏新異花色，利用基因工程技術(shù)創(chuàng)造三角梅新花色是育種的有效手段之一[39]。本研究僅克隆了多巴雙加氧酶基因并進(jìn)行了序列分析，且樣本數(shù)量較少，存在一定的局限性，因此想要更為準(zhǔn)確地了解三角梅花色的成色與調(diào)控機(jī)制，在未來的研究中，需要更多的樣本測序和基因分析來進(jìn)一步探索這些問題。

3.2 結(jié) 論

三角梅品種‘綠葉櫻花’多巴雙加氧酶開放閱讀框ORF（TRINITY-DN4651-c0-g1）克隆與分析結(jié)果表明，多巴雙加氧酶基因在生成甜菜色素植物中具有獨(dú)特的保守性，且屬于穩(wěn)定、酸性的親水蛋白，沒有跨膜結(jié)構(gòu)，可能只在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用。三角梅中控制花色變化的主要是甜菜色素而非黃酮類的花青素，結(jié)合花青素與甜菜色素代謝途徑在自然界中不能共存的現(xiàn)象，研究三角梅甜菜色素合成途徑中的關(guān)鍵酶，解析其甜菜色素的合成代謝機(jī)制，是使用轉(zhuǎn)基因方法改變?nèi)敲坊ㄉ匾碚摶A(chǔ)，本研究結(jié)果可為從分子生物學(xué)研究三角梅的花色變化機(jī)理提供理論依據(jù)。

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[本文編校：吳 毅]