摘" 要： 本研究旨在制備并鑒定針對貓杯狀病毒（feline calicivirus，F(xiàn)CV）VP1蛋白的單克隆抗體（monoclonal antibodies，mAbs）。本研究使用SH14株FCV全病毒作為免疫原，通過腹腔注射法免疫BALB/c小鼠，制備了針對VP1蛋白的mAb。通過ELISA篩選，成功獲得特異性單克隆抗體3A3C1株。對3A3C1株mAb進(jìn)行了全面的生物學(xué)特性鑒定，3A3C1株mAb確認(rèn)為IgG1型，輕鏈為κ鏈。Western blot和間接免疫熒光檢測的結(jié)果顯示，3A3C1株mAb能特異性地識別并結(jié)合FCV SH14株、F9株和GZ22。此外，本研究還深入探究了3A3C1株mAb的線性抗原表位。通過分段表達(dá)VP1蛋白并進(jìn)行詳細(xì)的Western blot分析，最終確定3A3C1株mAb的線性抗原表位位于VP1蛋白的426PSRLTPAGDYAITSG440區(qū)域。本研究制備的3A3C1株mAb不僅是理解FCV免疫學(xué)特性的重要工具，也對發(fā)展FCV診斷方法和疫苗策略具有潛在應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞： 貓杯狀病毒；單克隆抗體；抗原表位；衣殼蛋白

中圖分類號： S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）12-5784-08

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.040

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

收稿日期：2024-01-23

基金項目：上海市自然科學(xué)基金（23ZR1477100）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項資金項目（2023JB05）

作者簡介：張澤宇（1998-），男，山東德州人，碩士生，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail： zhangzeyu0421@163.com

*通信作者：孟春春，主要從事貓科動物病毒發(fā)病機(jī)制研究，E-mail：mengcc@shvri.ac.cn；張" 偉，主要從事動物寄生蟲病及防治，E-mail：zw2017xjau@163.com

Preparation of Monoclonal Antibodies against Feline Calicivirus VP1 Protein and Identification of Antigenic Epitopes

ZHANG" Zeyu1， DONG" Ningning1， TAN" Xiaomei2， LI" Chuanfeng2， ZHU" Jie2， LIU" Guangqing2，

ZHANG" Wei1*， MENG" Chunchun1，2*

（1.College of Veterinary Medicine， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830000， China;

2.Team for Companion Animal Biosafety and Prevention Technology， Shanghai Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Shanghai 200241，" China）

Abstract：" The purpose of this study was to prepare and identify monoclonal antibodies （mAbs） against the VP1 protein of feline calicivirus （FCV） strain SH14. In this study， the whole virus of the SH14 strain of FCV was used as an immunogen to immunize BALB/c mice through intraperitoneal injection， and mAbs against the VP1 protein were prepared. Through ELISA screening， a specific monoclonal antibody clone， 3A3C1， was successfully obtained. A comprehensive biological characterization of the 3A3C1 clone mAb was conducted， confirming it as an IgG1 type with a κ light chain. The results of Western blot and immunofluorescence assay （IFA） showed that the 3A3C1 clone mAb could specifically recognize and bind to FCV strains SH14， F9， and GZ22. In addition， this study further explored the linear antigenic epitope of the 3A3C1 clone mAb. By segmentally expressing the VP1 protein and conducting detailed Western blot analysis， the linear antigenic epitope of the 3A3C1 clone mAb was finally determined to be located in the426PSRLTPAGDYAITSG440 region of the VP1 protein. The 3A3C1 clone mAb prepared in this study is not only an important tool for understanding the immunological characteristics of FCV but also has potential applications in developing FCV diagnostic methods and vaccine strategies.

Key words： feline calicivirus; monoclonal antibody; antigenic epitope; capsid protein

*Corresponding authors：" MENG Chunchun， E-mail：mengcc@shvri.ac.cn;ZHANG" Wei，E-mail：zw2017xjau@163.com

貓杯狀病毒（feline calicivirus，F(xiàn)CV）是一種引起貓科動物傳染性疾病的重要病原體，其感染可導(dǎo)致口腔潰瘍、上呼吸道疾病和慢性胃腸炎等臨床癥狀［1］。FCV屬于嵌杯病毒科（Calicivirdae）的水皰性病毒屬（Vesivirus），無囊膜，基因組為單股正鏈RNA。該病毒在全球范圍內(nèi)廣泛流行，對家貓及其他貓科動物的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅［2］。尤其是在一歲以內(nèi)的幼貓中，F(xiàn)CV感染的發(fā)病率和死亡率較高，死亡率高達(dá)67%［3］。

FCV的衣殼蛋白VP1是研究其病原性和開發(fā)診斷工具的關(guān)鍵分子［4］。VP1蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，也是病毒與宿主細(xì)胞相互作用的主要場所。研究表明，F(xiàn)CV的VP1蛋白對病毒的生物學(xué)特性具有重要影響［5］。VP1蛋白由A～F 6個區(qū)域組成，每個區(qū)域都具有其獨(dú)特的功能和特性［6］。A區(qū)位于蛋白的氨基末端，是高度保守的區(qū)域，在衣殼蛋白成熟過程中，A區(qū)通常被裂解。B區(qū)含有肉豆蔻化甘氨酸和ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn)，是病毒核心結(jié)構(gòu)的一部分［7］。C區(qū)為一短的高變序列，與病毒的變異性有關(guān)。D區(qū)是另一個高度保守的區(qū)域。E區(qū)是中和性單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）的結(jié)合位點(diǎn)［8］，是另一個高變區(qū)。而F區(qū)位于衣殼蛋白的高度保守羧基端，是非中和mAb的結(jié)合位點(diǎn)［9］。因此，制備針對VP1蛋白的單克隆抗體（mAbs）不僅對研究FCV的生物學(xué)特性至關(guān)重要，也對診斷工具和疫苗策略的發(fā)展具有直接應(yīng)用價值［10］。

本研究旨在制備針對FCV VP1蛋白的單克隆抗體，并對其抗原表位進(jìn)行鑒定。本研究使用實驗室保存的SH14株FCV作為免疫原，通過全病毒免疫BALB/c小鼠，再通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）篩選法成功制備特異性抗VP1蛋白的單克隆抗體。本研究的工作為深入理解FCV的免疫學(xué)特性和發(fā)展新的診療方法奠定了基礎(chǔ)。此外，本研究獲得的單克隆抗體為進(jìn)一步FCV研究提供了重要工具，特別是在檢測方法和疫苗開發(fā)方面。

1" 材料與方法

1.1" 材料及實驗動物

本研究所使用的細(xì)胞系和病毒株包括貓腎細(xì)胞系（CRFK）、人胚胎腎細(xì)胞系（293T），以及FCV毒株SJ14、XA20、SH14、F9和GZ22，質(zhì)粒pCMV-3*Flag-14、pCold-SUMO，截短VP1蛋白（330-668 aa）及其表達(dá)質(zhì)粒，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所伴侶動物生物安全風(fēng)險預(yù)警及防控技術(shù)團(tuán)隊保存。試劑和材料包括完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、PEG SOLUTION 50%、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（IgG-HRP）、山羊抗小鼠IgG-FITC、anti-His tag mAb、紅外熒光標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（IgG-RBITC）、山羊抗貓IgG（H+L）-HRP、蛋白Marker、IgG抗體亞類鑒定試劑盒等，分別購自Sigma公司、QIAGEN公司、Beyotime公司、Jackson Immuno Research公司和Southern Biotech公司。實驗動物為6～8周齡的雌性SPF BALB/c小鼠，購自上海杰思捷實驗動物有限公司。

1.2" 雜交瘤細(xì)胞的制備

1.2.1" 病毒純化

將FCV毒株SH14使用蔗糖梯度離心純化方法進(jìn)行純化，純化后添加β-丙內(nèi)酯至終濃度為0.025%，使病毒滅活作為免疫原。

1.2.2" 小鼠免疫

首次免疫時，將純化的SH14與等量完全弗氏佐劑混合，每只小鼠腹腔注射含100 μg病毒的共200 μL混合物。首免2及4周后，分別采用等量FCV全病毒與不完全弗氏佐劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫后1周，眼球采血，采用間接ELISA法測定血清中針對FCV VP1（330-668 aa）蛋白的抗體效價［11］。

1.2.3" 細(xì)胞融合

選擇針對截短VP1（330-668 aa）蛋白血清抗體效價最高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合試驗。增強(qiáng)免疫后，收集小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按比例混合，以PEG1000為融合促進(jìn)劑進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.2.4" 陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆純化

培養(yǎng)14 d后，采用ELISA技術(shù)篩選能持續(xù)產(chǎn)生針對FCV VP1（330-668 aa）蛋白特異性抗體的陽性雜交瘤克隆。對陽性克隆進(jìn)行有限稀釋培養(yǎng)，直至獲得一株穩(wěn)定分泌針對VP1蛋白（330-668 aa）特異性單克隆抗體的細(xì)胞株。

1.2.5" 腹水制備及純化

BALB/c雌鼠腹腔注射0.5 mL液體石蠟，1周后注入約2×106對數(shù)生長期單克隆細(xì)胞株。待小鼠腹部明顯膨大，抽取腹水，10 000 r·min-1離心10 min收集上清，采用硫酸銨沉淀法純化抗體。

1.3" 單克隆抗體的鑒定

1.3.1" 亞型鑒定

用商業(yè)免疫球蛋白亞型鑒定試劑盒，通過ELISA法對從腹水中提取的單克隆抗體進(jìn)行亞型分類，確定其免疫球蛋白的亞型［12］。

1.3.2" 間接免疫熒光（IFA）鑒定

以FCV SH14、GZ22、F9株感染的貓腎細(xì)胞系（CRFK）為靶細(xì)胞，用腹水作為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為二抗，用熒光顯微鏡觀察特異性結(jié)合情況。

1.3.3" Western blot分析

將FCV SH14、F9、GZ22、SJ14、XA14株分別感染CRFK細(xì)胞，16、24 h收集細(xì)胞，用Ripa裂解液裂解，進(jìn)行SDS-PAGE及轉(zhuǎn)膜。采用腹水為一抗，山羊抗小鼠IgG-RBITC為二抗，通過Western blot分析檢測抗體與不同F(xiàn)CV株VP1蛋白的反應(yīng)性。

1.3.4" 中和活性測定

將200 TCID50病毒與等體積不同稀釋度（1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64）腹水混合，37 ℃孵育1 h促進(jìn)病毒-抗體結(jié)合。每種混合物接種CRFK細(xì)胞96孔板（200 μL·孔-1，8次重復(fù)），設(shè)未感染對照組。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h，觀察細(xì)胞病變（CPE），據(jù)此計算單克隆抗體（mAb）中和效價。

1.4 "抗原表位的鑒定

1.4.1" VP1蛋白區(qū)域劃分與真核表達(dá)

FCV VP1蛋白A區(qū)于感染過程中被切除，故研究重點(diǎn)為其他區(qū)域：126-426 aa（B、C、D區(qū)）和426-668 aa（E、F區(qū)）。構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-3Flag-14-VP1（126-426 aa）、pCMV-3Flag-14-VP1（426-668 aa）和pCMV-3*Flag-14-VP1全長，分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。采用Ripa裂解細(xì)胞，提取蛋白樣品，Western blot初步確定陽性區(qū)域［13］。

1.4.2" 抗原區(qū)域的細(xì)化與原核表達(dá)

依據(jù)Western blot初步結(jié)果，采用3對引物（表1）將陽性區(qū)域分為4個片段，克隆入pCold-SUMO原核表達(dá)載體表達(dá)蛋白。收集蛋白樣品，Western blot分析進(jìn)一步確定抗體抗原表位。

1.4.3" 抗原表位的精確鑒定

基于 “1.4.2” 中Western blot結(jié)果，設(shè)計3對引物（表1）將陽性區(qū)域分為4段，克隆入pCold-SUMO載體進(jìn)行原核表達(dá)。收集蛋白樣本，Western blot分析，最終將抗體抗原表位限定于15個氨基酸內(nèi)。

2" 結(jié)" 果

2.1" mAb亞類鑒定

通過3次克隆純化，本研究獲得了一株能夠穩(wěn)定分泌針對VP1截短蛋白的mAb的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3A3C1。經(jīng)過亞型鑒定，該mAb屬于IgG1型，輕鏈為κ鏈。

2.2" mAb Western blot、IFA及中和活性鑒定

Western blot結(jié)果顯示，mAb 3A3C1能夠與SJ14、XA20、SH14、F9、GZ22 5株FCV的VP1蛋白發(fā)生特異性結(jié)合（圖1A），選取具有代表性的F9（經(jīng)典疫苗株）、SH14（Ⅰ型流行毒株）、GZ22（Ⅱ型流行毒株）進(jìn)行二次Western blot驗證，其結(jié)合強(qiáng)度隨著病毒感染時間的延長而增強(qiáng)（圖1B～D）。IFA結(jié)果顯示，3A3C1株mAb作為一抗分別與F9、SH14、GZ22感染的CRFK細(xì)胞反應(yīng)后出現(xiàn)了特異性的綠色熒光信號，陰性對照組無任何熒光（圖2）。中和試驗結(jié)果顯示，mAb 3A3C1原液亦不能夠中和SH14株的感染，表明該mAb沒有中和活性。綜上所述，本研究制備的mAb 3A3C1可以特異性地識別多種基因型的FCV毒株感染后的細(xì)胞樣品，適用于FCV的檢測。

2.3" 3A3C1株mAb線性抗原表位的精確鑒定

將VP1蛋白全長序列劃分為VP1-126-426 aa和VP1-426-668 aa兩個主要區(qū)域（圖3A）。這兩個片段在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)后，經(jīng)Western blot鑒定，發(fā)現(xiàn)3A3C1株mAb僅與426-668 aa片段特異性結(jié)合（圖3B）。根據(jù)VP1-426-668 aa序列將其分為P1、P2和P3 3個小片段（圖3C）。P1、P2和P3片段經(jīng)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)后，通過Western blot方法鑒定，顯示3A3C1株mAb特異性地與P1片段反應(yīng)，故而將潛在抗原表位縮減至426-486 aa區(qū)間（圖3D）。為進(jìn)一步精確定位，根據(jù)VP1-426-486 aa序列，將其劃分為P4、P5和P6 3個部分（圖3E）。P4、P5和P6經(jīng)原核表達(dá)并進(jìn)行Western blot分析后，結(jié)果表明3A3C1 mAb僅與P4片段反應(yīng)（圖3F），表明3A3C1 mAb識別VP1蛋白序列426PSRLTPAGDYAITSG440。使用ChimeraX軟件對該表位在VP1蛋白三聚體上的位置進(jìn)行定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該抗原表位位于VP1三聚體結(jié)構(gòu)的頂端，即病毒粒子的表面（圖4）。選取國內(nèi)外共計185株FCV的 VP1對應(yīng)位置氨基酸序列進(jìn)行比對，通過Weblogo3網(wǎng)站制作426-440 aa的Weblogo，圖示內(nèi)容表明該表位保守性較高，且431-435 aa極其保守（圖5）。

3" 討" 論

貓杯狀病毒（FCV）的VP1衣殼蛋白是該病毒的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白，其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)對病毒的生物學(xué)特性和免疫反應(yīng)起決定性作用。VP1蛋白主要由兩個主要結(jié)構(gòu)域組成：殼（S）結(jié)構(gòu)域和突出（P）結(jié)構(gòu)域［14-15］。S結(jié)構(gòu)域提供了病毒顆粒的基本框架，是組成病毒衣殼的主要部分，而P結(jié)構(gòu)域則位于病毒顆粒的外部，直接暴露于宿主免疫系統(tǒng)前［16］。

P結(jié)構(gòu)域細(xì)分為P1和P2兩個亞結(jié)構(gòu)域，其中P2亞結(jié)構(gòu)域尤為重要。它位于病毒顆粒的最外層，是病毒與宿主細(xì)胞受體相互作用的主要界面，同時也是免疫系統(tǒng)識別的關(guān)鍵區(qū)域［17］。P2亞結(jié)構(gòu)域的高變異性是FCV逃避宿主免疫系統(tǒng)的主要機(jī)制之一，盡管FCV只有1個血清型，但VP1的高變異性使FCV的毒株之間的交叉反應(yīng)性不高這都極大加劇了使用疫苗后免疫失敗的概率［16，18］。VP1蛋白的抗原區(qū)域分為A～F 6個區(qū)域，其中E區(qū)域位于P2亞結(jié)構(gòu)域，是誘發(fā)免疫反應(yīng)的關(guān)鍵區(qū)域，包含了多個免疫原表位［19-20］。這些表位是病毒與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的關(guān)鍵區(qū)域，對于病毒的識別和中和至關(guān)重要。因此，對E區(qū)域的深入研究，特別是對其中免疫原表位的精確識別和定位，對于理解FCV的免疫學(xué)特性、發(fā)展有效的診斷工具和疫苗具有重大意義。

主要抗原蛋白VP1的保守性表位在不同的FCV毒株中保持相對穩(wěn)定，因此能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生廣泛的免疫反應(yīng)。而FCV疫苗的有效性主要依賴于激發(fā)高保守性中和表位的免疫應(yīng)答，因此使用單抗篩選FCV的保守且具有中和作用表位對于開發(fā)可有效防止病毒感染和傳播的疫苗至關(guān)重要［20］。

此外VP1蛋白的多樣性也是FCV抗原檢測產(chǎn)品效果不佳的主要原因。本研究的3A3C1株mAb所針對的表位相對保守但無中和活性，然而這為克服VP1抗原多樣性導(dǎo)致的FCV抗原有效試劑不足的現(xiàn)狀提供了潛在的新解決方案。

4" 結(jié)" 論

本研究成功制備了針對FCV VP1蛋白的單克隆抗體（mAb）3A3C1株，3A3C1株mAb為IgG1型，輕鏈為κ鏈，能特異性地識別并結(jié)合多個FCV毒株，但沒有中和活性。3A3C1株mAb針對的線性抗原表位位于VP1蛋白的426PSRLTPAGDYAITSG440區(qū)域，使用國內(nèi)外共計185株FCV的 VP1對應(yīng)位置氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明該表位保守性較高，可作為FCV通用抗原檢測的候選抗體。

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（編輯" 白永平）