摘 要：為提高微擬球藻戶外大規(guī)模高密度培養(yǎng)效率，分析比較了在管道式光生物反應(yīng)器、開放式白桶培養(yǎng)條件下，微擬球藻細(xì)胞密度、葉綠素質(zhì)量濃度等變化情況。結(jié)果顯示：在管道式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件下，藻細(xì)胞密度最高為5.67×106 cells/mL，總?cè)~綠素、葉綠素a質(zhì)量濃度分別為3.74 μg/mL和1.34 μg/mL，可溶性糖、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度分別為95.51±0.66 μg/mL和1.02±0.03 mg/mL，顯著高于開放式白桶培養(yǎng)。研究結(jié)果表明，管道式光生物反應(yīng)器更適合微擬球藻大規(guī)模高密度培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：微擬球藻；培養(yǎng)方式；管道式光生物反應(yīng)器；生長

中圖分類號：S969.24 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號：1674-7909（2024）14-91-3

DOI：10.19345/j.cnki.1674-7909.2024.14.020

0 引言

微擬球藻（Nannochloropsis oculata）屬于真眼點(diǎn)藻綱（Eustigmatophyceae）擬單胞藻科 （Monodopsidaceae），細(xì)胞近似球形的真核生物，在海水和淡水中均有分布［1］。其個(gè)體微小，生長迅速，并富含長鏈多不飽和脂肪酸、多糖、蛋白質(zhì)、三酰甘油等活性物質(zhì)［2］，營養(yǎng)價(jià)值極高，常被用作水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的開口餌料，有巨大的市場需求。因此，微擬球藻的大規(guī)模高密度室外培養(yǎng)受到廣泛關(guān)注。

微藻的大規(guī)模培養(yǎng)方式可分為封閉式培養(yǎng)和開放式培養(yǎng)2大類。傳統(tǒng)養(yǎng)殖戶多利用自然池塘或養(yǎng)殖池塘進(jìn)行開放式培養(yǎng)。這種培養(yǎng)方式的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)施建造簡單、操作方便，但微藻的繁殖會(huì)受到外界環(huán)境條件影響。循環(huán)管道式光生物反應(yīng)器作為典型的封閉式藻類培養(yǎng)裝置，具有光照表面積大、藻液流動(dòng)、有較高的CO2利用率等特點(diǎn)［3］，可提高微藻產(chǎn)量。

但目前，養(yǎng)殖戶對利用光生物反應(yīng)器培養(yǎng)微藻的技術(shù)仍然不是很了解，大多還是用大型水泥池或白桶進(jìn)行藻類培養(yǎng)，使得大規(guī)模高密度微藻培養(yǎng)工作受限?；诖?，采用循環(huán)管道式光生物反應(yīng)器和開放式白桶2種裝置培養(yǎng)微擬球藻，比較分析2種培養(yǎng)方式下藻細(xì)胞密度等變化情況，并從生理和營養(yǎng)積累角度綜合評價(jià)2種培養(yǎng)方式對微擬球藻的擴(kuò)培效果，為微藻大規(guī)模高密度培養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 培養(yǎng)裝置

250 L循環(huán)管道式光生物反應(yīng)器（上海光語生物科技有限公司生產(chǎn)）主要由80 mm×280 mm玻璃管道、60 L緩沖柱、驅(qū)動(dòng)裝置（包括變頻器和低剪切力循環(huán)水泵）、電控系統(tǒng)、LED光源、pH儀、溫度計(jì)、氣泵等組成。開放式白桶培養(yǎng)系統(tǒng)由50 L白桶、LED光源和氣泵等構(gòu)件組成。

1.1.2 藻種來源

微擬球藻由寧波大學(xué)海洋生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室微藻種質(zhì)庫提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)包括管道式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)和開放式白桶培養(yǎng)2種方式。試驗(yàn)所用海水為用海水晶（海佳，江西）配制的人工海水（鹽度為25 psu），鹽度測定儀器為鹽度計(jì)（YDJ-100，河北歐素），海水經(jīng)脫脂棉過濾、沉淀和氯片消毒后用于微藻培養(yǎng)。試驗(yàn)充氣量統(tǒng)一控制為（5±1） L/min，接種細(xì)胞密度為3×105 cells/mL，光暗周期比為L∶D=12∶12，光強(qiáng)設(shè)置為（3 000±50）Lux，溫度控制在（24±1） ℃。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，持續(xù)12 d。

試驗(yàn)組接入藻種混勻后，每隔24 h取樣觀察藻細(xì)胞生長情況。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 藻細(xì)胞數(shù)目的測定

取藻液2 mL，用魯氏碘液固定，采用血球板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.2 葉綠素質(zhì)量濃度的測定

采用丙酮萃取法測定藻細(xì)胞葉綠素質(zhì)量濃度［4］。

1.3.3 營養(yǎng)組成的測定

采用蒽酮-硫酸法測定可溶性糖質(zhì)量濃度［5］，用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度［6］。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用IBM SPSS 27.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和顯著性差異分析，Plt;0.05表示差異顯著。圖表使用Graphpad Prism 9.0和Excel 2018制作。

2 結(jié)果分析

2.1 2種培養(yǎng)方式對微擬球藻生長的影響

藻細(xì)胞密度是反映微擬球藻生長情況的核心指標(biāo)之一。2種培養(yǎng)方式對微擬球藻細(xì)胞密度的影響如圖1所示。試驗(yàn)結(jié)果表明：在管道式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)和開放式白桶培養(yǎng)條件下，微擬球藻細(xì)胞密度均隨時(shí)間的增加呈先增長后降低的趨勢，但管道式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)下的最大藻細(xì)胞密度顯著高于開放式培養(yǎng)方式（Plt;0.05）。在管道式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件下，微擬球藻在第10天達(dá)到最大細(xì)胞密度，為5.67×106 cells/mL，比開放式培養(yǎng)條件下同期數(shù)值高出22%。相比之下，開放式培養(yǎng)條件下藻細(xì)胞生長速度相對緩慢，其最大細(xì)胞密度為4.65×106 cells/mL。

2.2 2種培養(yǎng)方式對微擬球藻葉綠素質(zhì)量濃度的影響

在2種培養(yǎng)方式下，微擬球藻葉綠素質(zhì)量濃度的變化如圖2所示。在2種培養(yǎng)方式下，微擬球藻總?cè)~綠素質(zhì)量濃度（圖2A）和葉綠素a質(zhì)量濃度（圖2B）都隨時(shí)間的增加呈先上升后下降的趨勢，且在整個(gè)培養(yǎng)期間管道式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件下的葉綠素質(zhì)量濃度顯著高于開放式培養(yǎng)（Plt;0.05）。在培養(yǎng)第10天，循環(huán)管道式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件下的總?cè)~綠素質(zhì)量濃度和葉綠素a質(zhì)量濃度分別為3.74 μg/mL和1.34 μg/mL，開放式白桶培養(yǎng)條件下的相應(yīng)指標(biāo)值分別為3.20 μg/mL和1.14 μg/mL。

2.3 2種培養(yǎng)方式對微擬球藻營養(yǎng)積累的影響

在2種培養(yǎng)方式下，微擬球藻可溶性糖和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度變化如表1所示。在循環(huán)管道式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件下，微擬球藻的可溶性糖和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度分別為（95.51±0.66） μg/mL和（1.02±0.03 ）mg/mL，均顯著高于開放式白桶培養(yǎng)下的微擬球藻可溶性糖質(zhì)量濃度［（92.40±0.80 μg/mL）］和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度［（0.95±0.02 mg/mL）］（Plt;0.05）。

表1 不同培養(yǎng)方式對微擬球藻營養(yǎng)成分的影響

[培養(yǎng)方式 可溶性糖質(zhì)量濃度/

（μg·mL-1） 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/

（mg·mL-1） 循環(huán)管道式

光生物反應(yīng)器 95.51±0.66 1.02±0.03 開放式白桶 92.40±0.80 0.95±0.02 ]

3 討論

隨著微藻規(guī)?；囵B(yǎng)研究的逐漸深入，開發(fā)高效、經(jīng)濟(jì)的微藻培養(yǎng)系統(tǒng)成為熱點(diǎn)［7］。光生物反應(yīng)器作為典型的封閉式藻類培養(yǎng)系統(tǒng)，可以用于戶外規(guī)模培養(yǎng)，可強(qiáng)化微藻固碳作用且單位體積產(chǎn)率高，其應(yīng)用前景較好［8］。在培養(yǎng)過程中，微藻受到光照、溫度、pH值、營養(yǎng)鹽等多種因素的影響，但光照是最主要的影響因素［9］。王付冬等［10］研究了不同光照強(qiáng)度對眼點(diǎn)擬微綠球藻生長的影響，發(fā)現(xiàn)眼點(diǎn)擬微綠球藻生物量隨著光照強(qiáng)度的增加而升高。此試驗(yàn)同樣以微擬球藻作為藻種，在管道式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件下，藻細(xì)胞密度最高為5.67×106 cells/mL（培養(yǎng)至第10天），優(yōu)于開放式培養(yǎng)。其原因可能是管道式光生物反應(yīng)器采用雙側(cè)光照，增強(qiáng)了閃光效應(yīng)，從而提高了光能利用率和光合作用效率，促使微藻生長速率和產(chǎn)率提升［11］。

葉綠素在藻類光合作用中具有關(guān)鍵作用，其質(zhì)量濃度的變化與藻類生命活動(dòng)息息相關(guān)。劉青等［12］發(fā)現(xiàn)，葉綠素質(zhì)量濃度與單胞藻的生長速率成正比，生長速率越快，葉綠素質(zhì)量濃度越高。在此試驗(yàn)中，2種培養(yǎng)方式下的微擬球藻葉綠素質(zhì)量濃度都隨時(shí)間的增加呈先上升后下降的趨勢，與藻細(xì)胞密度變化趨勢相同。此外，管道式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式下的葉綠素質(zhì)量濃度高于同期開放式白桶培養(yǎng)方式，進(jìn)一步表明管道式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式可增強(qiáng)藻類植物光合作用，并提升光合效率。

微藻的營養(yǎng)組成對水產(chǎn)動(dòng)物的生長性能極為重要。呂布等［13］利用管道式光生物反應(yīng)器、聚乙烯桶、水泥池培養(yǎng)湛江等鞭金藻，發(fā)現(xiàn)管道式光生物反應(yīng)器有利于總蛋白和可溶性糖的積累。這與此試驗(yàn)結(jié)果一致，表明利用管道式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)的微擬球藻的營養(yǎng)價(jià)值高于開放式白桶培養(yǎng)方式。其原因可能是管道式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式會(huì)增加藻細(xì)胞受光面積，使藻細(xì)胞密度相對較高，從而影響蛋白質(zhì)和糖類營養(yǎng)物質(zhì)的積累。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明：相比開放式白桶培養(yǎng)，管道式光生物反應(yīng)器顯著提高了藻細(xì)胞密度，并增加了營養(yǎng)物質(zhì)的積累，有利于微擬球藻戶外大規(guī)模高密度培養(yǎng)，有助于解決餌料微藻室外擴(kuò)培的難題。

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