[摘要]目的：探討不同能量下超脈沖點(diǎn)陣CO2激光對(duì)兔耳增生性瘢痕膠原代謝的效果。方法：新西蘭健康大白兔5只，于雙側(cè)兔耳腹側(cè)設(shè)計(jì)4個(gè)增生性瘢痕模型，共40個(gè)模型。采用隨機(jī)抽樣分為四組：低能量激光組（30 mJ）、中能量激光組（50 mJ）、高能量激光組（70 mJ）、瘢痕對(duì)照組。每組10個(gè)瘢痕模型。予以不同能量激光治療增生性瘢痕后，觀察記錄四組增生性瘢痕的大體變化，并于治療后1周及8周切取瘢痕組織，Masson染色觀察膠原沉積情況，測(cè)量膠原容積分?jǐn)?shù)；采用免疫組化檢測(cè)TGF-β1的表達(dá)。結(jié)果：大體觀察，低、中、高能量激光組治療下瘢痕組織均有不同程度的顏色變淺，質(zhì)地變軟，高度變平，其中以高能量激光組表現(xiàn)最為明顯。Masson染色顯示，不同能量激光治療組均可以明顯減少瘢痕中的膠原含量，而瘢痕對(duì)照組由于瘢痕逐漸成熟，膠原含量會(huì)逐漸下降并趨于穩(wěn)定。免疫組化顯示，不同能量激光組對(duì)TGF-β1的表達(dá)均有抑制作用（P＜0.05）；其中以高能量激光組作用最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：超脈沖點(diǎn)陣CO2激光對(duì)瘢痕膠原代謝干預(yù)有效，相同點(diǎn)陣密度下，高能量激光干預(yù)效果優(yōu)于低能量激光，推測(cè)高能量激光能更好下調(diào)TGF-β1的表達(dá)，從而改善瘢痕癥狀。

[關(guān)鍵詞]點(diǎn)陣激光；增生性瘢痕；膠原代謝；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；能量

[中圖分類號(hào)]R619+.6" " [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A" " [文章編號(hào)]1008-6455（2024）12-0011-04

Effects of Ultra-Pulse CO2 Fractional Laser at Different Energy Levels on Collagen Metabolism in Rabbit Ear Hypertrophic Scars

LI Xiuquan1， ZHANG Chi1， LIU Hao2， SUN Guangfeng1

（ 1.Department of Burn and Plastic Surgery， the Second Affiliated Hospital of Zunyi Medical University， Zunyi 563000， Guizhou， China; 2.The Central Laboratory of Guizhou Aerospace Hospital， Zunyi 563000， Guizhou， China ）

Abstract： Objective" Investigation of the effects of Ultra-Pulse CO2 fractional laser at different energy levels on collagen metabolism in rabbit ear hypertrophic scars. Methods" Four New Zealand healthy white rabbits were used in this study， and a total of 40 hypertrophic scar models were created on the ventral side of their bilateral rabbit ears. The models were randomly divided into four groups： low-energy laser group （30 mJ）， medium-energy laser group （50 mJ）， high-energy laser group （70 mJ）， and scar control group. Each group consisted of 10 scar models. After treating the hypertrophic scars with lasers at different energy levels， the macroscopic changes of the scars in the four groups were observed and recorded. Scar tissues were collected at 1 week and 8 weeks post-treatment for Masson staining to observe collagen deposition and measure the collagen volume fraction. Immunohistochemistry was performed to detect the expression of TGF-β1. Results" Based on overall observations， scar tissues treated with low， medium， and high-energy laser groups exhibit varying degrees of color lightening， texture softening， and height reduction. Among them， the high-energy laser group shows the most pronounced effects. Masson's staining reveals that laser treatment with different energy levels significantly reduces collagen content within the scars， whereas the collagen content gradually decreases and stabilizes in the scar control group as the scars mature. Immunohistochemical analysis demonstrates that laser groups with different energy levels exhibit inhibitory effects on the expression of TGF-β1， with statistical Significance （P＜0.05）. Among them， the high-energy laser group exhibits the most significant impact， with statistically significant differences （P＜0.05）. Conclusion" Ultra-pulse CO2 fractional laser intervention effectively modulates scar collagen metabolism. Under the same fractional density， high-energy laser intervention yields better results than low-energy laser intervention. It is speculated that high-energy laser can more effectively downregulate the expression of TGF-β1， thereby improving scar symptoms.

Key words： fractional laser; hypertrophic scars; collagen metabolism; transforming growth factor-β1; energy

增生性瘢痕（Hypertrophic scar）為臨床常見的皮膚病損，多發(fā)生于累及真皮層的損傷，如Ⅱ度以上燒燙傷、手術(shù)傷口、感染，甚至切取皮片后的供皮區(qū)[1-2]，其臨床表現(xiàn)為瘢痕局部有增厚變硬，高于周圍正常皮膚組織，而在關(guān)節(jié)部位的瘢痕攣縮可引起關(guān)節(jié)活動(dòng)功能障礙，發(fā)生在面部時(shí)，可導(dǎo)致面部器官的移位，可有明顯瘙癢和疼痛，甚至可因搔抓出現(xiàn)破潰、感染等，影響外觀及功能。

本研究以兔耳增生性瘢痕模型為研究對(duì)象，采用超脈沖點(diǎn)陣CO2激光治療兔耳瘢痕，評(píng)估瘢痕創(chuàng)面膠原代謝情況，測(cè)定細(xì)胞因子TGF-β1表達(dá)水平，旨在探究超脈沖點(diǎn)陣CO2激光治療增生性瘢痕的療效及其對(duì)膠原代謝的作用機(jī)制，以及在何種能量模式下能取得最優(yōu)的治療效果。

1" 資料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：成年新西蘭大白兔5只，體重3～3.5 kg，由遵義醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)入并飼養(yǎng)。

1.2 兔耳瘢痕模型的建立：取成年健康新西蘭大白兔5只，耳緣靜脈注射氯胺酮15 mg/kg，待麻醉生效后，于雙側(cè)兔耳腹側(cè)各設(shè)計(jì)4個(gè)邊長(zhǎng)為1 cm正方形，間隔1 cm以標(biāo)記，碘伏消毒后在完整切除皮膚全層及耳軟骨膜，制作皮膚缺損創(chuàng)面，保留軟骨。術(shù)后創(chuàng)面暴露，每日碘伏消毒換藥至創(chuàng)面愈合。待創(chuàng)面上皮化后，約1個(gè)月，共獲得40個(gè)色紅、質(zhì)硬的兔耳增生性瘢痕模型。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組：共分為四組，其中激光實(shí)驗(yàn)組三組，各10個(gè)兔耳瘢痕模型，共30個(gè)，予以酷逸超脈沖點(diǎn)陣CO2激光治療，使用Deep模式，Core能量區(qū)間30～70 mJ，點(diǎn)陣密度1%～4%，選擇30 mJ設(shè)置為低能量激光組，50 mJ設(shè)置為中能量激光組，70 mJ設(shè)置為高能量激光組，點(diǎn)陣密度4%，確保激光穿透瘢痕組織，治療結(jié)束后外涂金霉素藥膏，激光治療干預(yù)1次；另設(shè)為瘢痕對(duì)照組，不予干預(yù)治療，共10個(gè)兔耳瘢痕模型。40處瘢痕于每個(gè)兔耳上四個(gè)創(chuàng)面模型分別為四組。

1.4 標(biāo)本取材及處理：對(duì)照組及激光組于治療后1周、8周切取部分瘢痕，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別于5個(gè)模型上取材，切取范圍包括皮膚全層及周圍部分正常組織，切取后予以10%多聚甲醛固定。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 大體觀察：于治療后第1周及第8周觀察點(diǎn)陣激光治療組瘢痕恢復(fù)情況，以及增生性瘢痕變軟、變平的時(shí)間。

1.5.2 瘢痕組織病理學(xué)檢查：于治療后第1周及第8周Masson染色觀察膠原沉積情況，測(cè)定膠原容積分?jǐn)?shù)；顯微鏡下每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)400×視野，膠原顯微藍(lán)色染色即為陽性表達(dá)，勾選藍(lán)色范圍，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0計(jì)算陽性表達(dá)的百分比。

1.5.3 免疫組化染色：于治療后第1周及第8周測(cè)定TGF-β1表達(dá)，封片后，顯微鏡下每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)400×視野，胞漿深棕色染色即為陽性表達(dá)，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0計(jì)算陽性表達(dá)率，測(cè)定TGF-β1表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：對(duì)于所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示。對(duì)所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若結(jié)果符合正態(tài)分布且方差齊，采用單因素方差分析，不符合則采用多樣本多重比較的非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2" 結(jié)果

2.1 大體觀察：造模術(shù)后4周，創(chuàng)面可見明顯增生瘢痕組織，色鮮紅，質(zhì)韌，表現(xiàn)為中央呈乳頭狀突起，創(chuàng)面愈合區(qū)皮膚組織明顯高于周圍正常皮膚，增生范圍不超過創(chuàng)緣。激光治療后第1周采集標(biāo)本時(shí)，高、中、低能量激光組瘢痕組織均有不同程度的顏色變淺，質(zhì)地變軟，高度變平，其中以高能量激光組表現(xiàn)最為明顯。

2.2 Masson染色：在光鏡下，經(jīng)過染色后膠原纖維呈淡藍(lán)色，治療后第1周時(shí)，瘢痕對(duì)照組看到大量的成纖維細(xì)胞散在分布，膠原纖維粗大并且以漩渦狀方式排列，排列致密、卷曲，無規(guī)則，皮膚附屬器消失，而激光組與瘢痕對(duì)照組相比，成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，膠原纖維結(jié)構(gòu)疏松，膠原排列逐漸呈現(xiàn)水平狀有序，低中高能量組差異性不大。治療后第8周時(shí)，瘢痕對(duì)照組成纖維細(xì)胞數(shù)量無明顯變化，淺層膠原排列仍雜亂無規(guī)則，深層膠原排列開始出現(xiàn)水平狀變化；激光組成纖維細(xì)胞數(shù)量降低，膠原纖維排列較整齊，與表皮方向大致相同，組織緊密度較瘢痕對(duì)照組疏松；其中高能量激光組形態(tài)一致，交聯(lián)密切。見圖2。

瘢痕對(duì)照組在治療后第1周及第8周時(shí)的膠原容積分?jǐn)?shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。高、中、低各個(gè)能量激光治療組治療后第8周的膠原容積分?jǐn)?shù)顯著低于治療后第1周（P＜0.05），說明不同激光能量治療均能減少瘢痕中的膠原含量。在治療后第1周及第8周時(shí)，高、中、低各個(gè)能量激光治療后，與瘢痕對(duì)照組相比，膠原含量均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中高能量激光組治療效果優(yōu)于低能量激光組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高能量激光組治療效果優(yōu)于中能量激光組，中能量激光組治療效果優(yōu)于低能量激光組，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，不同能量激光治療組均可以明顯減少瘢痕中的膠原含量，以高能量激光組效果最明顯；而瘢痕對(duì)照組由于瘢痕逐漸成熟，膠原含量會(huì)逐漸緩慢下降并趨于穩(wěn)定。見表1。

2.3 免疫組化染色TGF-β1表達(dá)結(jié)果的測(cè)定：結(jié)果顯示，瘢痕對(duì)照組可見成纖維細(xì)胞有TGF-β1陽性表達(dá)，表皮層和真皮層陽性表達(dá)明顯，胞漿為棕黃色；在第1周及第8周時(shí)，前后時(shí)間點(diǎn)TGF-β1陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。高、中、低各個(gè)能量激光治療組，在治療后第8周TGF-β1陽性率低于第1周（P＜0.05）。在治療后同一時(shí)間內(nèi)，高、中、低各個(gè)能量激光治療后，與瘢痕對(duì)照組相比，陽性表達(dá)主要集中于表皮層，TGF-β1陽性率下降（P＜0.05），表明不同能量激光組對(duì)TGF-β1的表達(dá)均有抑制作用；高能量激光組TGF-β1陽性率低于低能量激光組及中能量激光組（P＜0.05）；中能量激光組TGF-β1陽性率低于低能量激光組，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明不同能量激光治療組均可以抑制瘢痕中的TGF-β1的表達(dá)，高能量激光組對(duì)TGF-β1表達(dá)的抑制效果優(yōu)于低中能量組。見圖3、表2。

3" 討論

增生性瘢痕是創(chuàng)傷后過度反應(yīng)的產(chǎn)物，創(chuàng)傷后可產(chǎn)生部分生長(zhǎng)因子[3]，如VEGF、TGF-β1、bFGF等，刺激成纖維細(xì)胞過度增殖，膠原蛋白過度沉積并降解受阻，排列順序紊亂，導(dǎo)致增生性瘢痕形成。在創(chuàng)面愈合的細(xì)胞增殖期，TGF-β1直接或者間接、單獨(dú)或者協(xié)同作用于成纖維細(xì)胞，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖分化，其水平升高可以降低基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1的含量，增加了膠原沉積減少了膠原降解，造成瘢痕增生。通過下調(diào)體內(nèi)TGF-β1含量，可抑制炎性反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，改善愈合質(zhì)量。

超脈沖點(diǎn)陣CO2激光，波長(zhǎng)10 600 nm，具有穿透深、效能高的特點(diǎn)[4]，當(dāng)激光束照射到生物組織時(shí)，可出現(xiàn)熱剝脫、熱凝固、熱效應(yīng)三個(gè)區(qū)域。點(diǎn)陣激光治療后，可使瘢痕表面凸凹不平的地方瞬間凝固、汽化，形成熱剝脫區(qū)域，為微熱治療區(qū)（MTZs），故能量和密度是決定治療效果的重要參數(shù)，不同組織受熱程度不同，靠近激光孔的組織出現(xiàn)變性壞死，通過瘢痕消融方式，直接去除部分瘢痕組織，而熱效應(yīng)也能間接導(dǎo)致瘢痕中的成纖維細(xì)胞凋亡[5-7]。同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞炎性因子的分泌，可抑制瘢痕組織中VEGF、TGF-β的表達(dá)[8-9]，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的凋亡，熱效應(yīng)能使膠原的二硫鍵斷裂，破壞膠原蛋白的穩(wěn)定性，間接促進(jìn)膠原再生和重塑，調(diào)節(jié)瘢痕內(nèi)部細(xì)胞外基質(zhì)的成分及膠原排列，瘢痕治療后TGF-β、bFGF的表達(dá)水平均下降，并造成組織缺氧，細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白比例下降，能夠有效促進(jìn)膠原蛋白降解，從而松解、軟化瘢痕[10-13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，各激光組處理后，膠原纖維明顯變薄，膠原纖維排列較整齊，與表皮方向大致相同，組織緊密度較瘢痕對(duì)照組疏松；而真皮膠原纖維厚度、膠原纖維排列在不同能量激光組間未見明顯差異。超脈沖點(diǎn)陣CO2激光的特點(diǎn)就是微熱治療區(qū)，能量的大小決定同一波長(zhǎng)下治療的深度，能量越大，達(dá)到的深度越深。在相同的激光點(diǎn)陣密度下，給予較高能量（70 mJ）相比于低能量（30 mJ）治療，膠原含量減少更明顯，而70 mJ與50 mJ、50 mJ與30 mJ相比，膠原含量減少無明顯差異。70 mJ與50 mJ和30 mJ相比，TGF-β1表達(dá)下降更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而50 mJ與30 mJ相比，TGF-β1表達(dá)下降無明顯差異?？烧J(rèn)為在相同點(diǎn)陣密度時(shí)，提高激光能量，能夠下調(diào)TGF-β1表達(dá)，可能促進(jìn)膠原的降解，抑制瘢痕形成。此為本實(shí)驗(yàn)中超脈沖點(diǎn)陣CO2激光治療能量區(qū)間（30～70 mJ）下，在相同激光點(diǎn)陣密度（4%）時(shí)，較高激光能量能夠增加療效。

超脈沖點(diǎn)陣CO2激光對(duì)瘢痕膠原代謝干預(yù)有效，相同點(diǎn)陣密度下，高能量激光干預(yù)效果優(yōu)于低能量激光，推測(cè)高能量激光能更好下調(diào)TGF-β1的表達(dá)，從而改善瘢痕癥狀。

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[收稿日期]2023-08-18

本文引用格式：李修權(quán)，張馳，劉浩，等.不同能量下超脈沖點(diǎn)陣CO2激光對(duì)兔耳增生性瘢痕膠原代謝的影響及作用機(jī)制[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2024，33（12）：11-14.