摘 要：【目的】分析比較橙黃乳菇-馬尾松菌根合成前后根系代謝物差異，為探究調控橙黃乳菇-馬尾松共生的潛在根系代謝物提供參考。【方法】在純培養(yǎng)條件下進行橙黃乳菇-馬尾松菌根合成，基于液質聯(lián)用技術測定馬尾松及橙黃乳菇-馬尾松菌根根系代謝物成分，利用KEGG和HMDB數(shù)據(jù)庫進行代謝物的定量與注釋，采用主成分分析、正交偏最小二乘-判別分析等多元統(tǒng)計方法進行代謝組數(shù)據(jù)的比較，并篩選差異代謝物。【結果】共檢測出代謝物627種，其中差異代謝物95種，上調39種，下調56種，主要集中在黃酮類化合物、萜類化合物、氨基酸及其衍生物、酚類化合物、生物堿類化合物、有機酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、香豆素和木脂素、植物激素等。KEGG代謝通路分析顯示次生代謝產物的生物合成、苯丙烷類化合物的生物合成、類黃酮生物合成、神經活性配體-受體相互作用、鐵載體基非核糖體肽的生物合成、苯甲酸鹽降解途徑、植物激素的生物合成、莽草酸途徑生物堿的生物合成和氨基苯甲酸降解等9條差異代謝途徑在橙黃乳菇-馬尾松菌根形成后差異代謝物顯著富集，可能對橙黃乳菇-馬尾松菌根形成具有重要調節(jié)作用?！窘Y論】利用廣泛靶向代謝組學技術可在整體水平上揭示橙黃乳菇-馬尾松菌根形成前后的代謝組學差異，研究結果可為明晰橙黃乳菇-馬尾松共生機制及橙黃乳菇-馬尾松菌根合成提供科學依據(jù)。

關鍵詞：橙黃乳菇；菌根；代謝組；共生；馬尾松

中圖分類號：S791.248 文獻標志碼：A 文章編號：1673-923X（2024）11-0011-11

基金項目：貴州省林業(yè)科研項目（黔林科合J字〔2022〕06號）；貴州省科技重大專項（黔科合重大專項字〔2019〕3006號）。

Comparison and analysis of widely targeted metabolomics of mycorrhizal of Lactarius akahatsu and Pinus massoniana

ZHANG Shixin1，2，3， GENG Yangyang1，2，3， LIU Yana1，2，3， WANG Jihui1，2，3， HU Bokai1，2，3

（1. Guizhou Institute of Walnut， Guiyang 550005， Guizhou， China； 2. Guizhou Academy of Forestry， Guiyang 550005， Guizhou， China； 3. Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration on Biodiversity Conservation in Karst Mountainous Areas of Southwestern China， Guiyang 550005， Guizhou， China）

Abstract：【Objective】This study aims to analyze and compare the differences in root metabolites before and after mycorrhizal synthesis between Lactarius akahatsu and Pinus massoniana， in order to provide reference for exploring the potential substances regulating the symbiosis between L. akahatsu and P. massoniana.【Method】The mycorrhizal of L. akahatsu and P. massoniana were synthesized on pure media. Liquid chromatography-mass spectrometry were used to determine the metabolic components of root system of P. massoniana and mycorrhizal of symbiotic system between L. akahatsu and P. massoniana. The metabolites were quantified and annotated using KEGG and HMDB databases. Principal component analysis， orthogonal partial least-squares discriminant analysis and other multivariate statistical methods were used to compare the metabolome data and screen the different metabolic components.【Result】627 metabolites were detected from mycorrhizal between L. akahatsu and P. massoniana， of them 95 ones were differential metabolites， 39 ones were up-regulated and 56 were down-regulated. The main metabolites were flavonoids， terpenoids， amino acid and derivatives， phenols， alkaloids， organic acids and derivatives， nucleotide and its derivates， phenylpropanoids and lignan， phytohormone， etc. KEEG metabolic pathway analyses showed that different metabolites were significantly enriched in 9 metabolic pathways. They were biosynthesis of secondary metabolites， biosynthesis of phenylpropanoids， flavonoid biosynthesis， neuroactive ligandreceptor interaction， biosynthesis of siderophore group nonribosomal peptides， benzoate degradation， biosynthesis of plant hormones， biosynthesis of alkaloids derived from shikimate pathway and aminobenzoate degradation， which might be an important regulatory role in the formation of mycorrhizal synthesis between L. akahatsu and P. massoniana.【Conclusion】Using UPLC-MS/MS metabolomics technique， the metabolomics differences of mycorrhizal synthesis between L. akahatsu and P. massoniana can be revealed on an overall level. The results can provide a scientific basis for clarifying the symbiotic mechanism and the mycorrhizal synthesis of L. akahatsu and P. massoniana.

Keywords： Lactarius akahatsu； mycorrhizal； metabolomics； symbiosis； Pinus massoniana

橙黃乳菇Lactarius akahatsu隸屬于傘菌目Agaricales紅菇科Russulaceae乳菇屬Lactarius，其口感脆嫩、味道鮮美，是餐桌上備受青睞的野生食用菌。橙黃乳菇子實體中多糖、粗蛋白、維生素、氨基酸種類含量豐富[1]，具有清除自由基、提高免疫力、抗氧化等作用，是重要的藥食兩用食用菌[2]，市場價值高昂，具有廣闊的開發(fā)前景。橙黃乳菇常發(fā)生于馬尾松Pinus massoniana林下，與植物根系共生，是馬尾松林中典型的外生菌根真菌[3]。有研究表明，外生菌根真菌通過菌套和哈蒂氏網為植物根部提供物理保護外，還促進宿主植物的礦質營養(yǎng)、水分吸收和整體生長[4-6]，通過各種機制增強宿主植物對土傳病原體的防御作用[7]，提高植物抗性和適應性[8-9]。乳菇類食用菌中，已有學者對松乳菇Lactarius deliciosus[10]、紅汁乳菇Lactarius hatsudake[11]、靛藍乳菇Lactarius subindigo[12]等開展菌根合成獲取菌根苗。然而，由于外生菌根真菌與寄主植物相互作用及共生機制不明確，仍存在菌根合成率低，子實體形成困難等問題，其人工馴化栽培仍面臨巨大挑戰(zhàn)。

植物根系是菌根真菌與寄主植物相互作用的主要器官，菌根共生體中的營養(yǎng)物質交換主要通過碳氮交換形成[13]。外生菌根真菌菌絲在土壤中生長，并產生專門用于有機物分解的酶和代謝產物，以獲取植物通常無法獲得的氮和其他營養(yǎng)物質[14]。菌根真菌也能通過分泌生長素、倍半萜等次級代謝產物激活宿主植物共生信號通路，實現(xiàn)信號傳遞[15]。Lidoy等[16]證實白楊素、槲皮素和蘆丁在叢枝菌根真菌-植物共生中作為共生前信號分子在低劑量下能夠促進叢枝菌根真菌孢子萌發(fā)和侵染。植物代謝物類胡蘿卜素三羥內酯也被證實作為特異性根系分泌物促進共生關系的建立[17]。植物可通過根系代謝物或分泌物吸引菌根真菌定殖，實現(xiàn)二者之間的相互交流并影響根系功能、土壤環(huán)境及微生物多樣性[18-20]。因此，研究根系代謝物有利于了解外生菌根真菌與寄主植物物質交換機制，可以更好地預測生態(tài)系統(tǒng)功能，提高菌根真菌的利用率。目前，關于橙黃乳菇的研究主要集中于子實體營養(yǎng)價值評價[1]和菌種分離[21]等，橙黃乳菇與寄主植物的相互作用研究未見報道。代謝組學技術近年來被廣泛應用于動植物研究中[22-23]，可全面、快速、準確地檢測和整合多源數(shù)據(jù)并進行代謝物的定性定量分析。在菌物研究中，楊曉敏等[24]利用代謝組學技術分析揭示了調控亞洲蘭茂牛肝菌純培養(yǎng)條件下原基發(fā)育的潛在物質。也有研究通過代謝組分析植物與菌根真菌共生后根系分泌物差異，探究了菌根真菌對植物生長發(fā)育的調控作用[25]?；诖耍狙芯恳约兣囵B(yǎng)條件下馬尾松根系和橙黃乳菇-馬尾松菌根根系為材料，應用廣泛靶向代謝組學技術對橙黃乳菇-馬尾松菌根形成前后主要根系代謝物進行測定，并對差異代謝物及調控通路進行分析，旨在探究調控橙黃乳菇-馬尾松菌根形成的主要根系代謝標志物和重要代謝途徑，為明晰橙黃乳菇-馬尾松共生機制及橙黃乳菇人工馴化栽培奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

馬尾松Pinus massoniana種子來源于貴州省扎佐林場。橙黃乳菇購于貴州省龍里縣觀音鎮(zhèn)。采用法組織分離法分離菌株并進行ITS鑒定，經https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/中Nucleotide BLAST對核酸序列結果鑒定為橙黃乳菇Lactarius akahatsu，序列號為：ON248533。菌種現(xiàn)存于中國微生物菌種保藏中心，保藏編號為CGMCC NO.401971。采用純水瓊脂培養(yǎng)基進行無菌苗培育。

1.2 接種處理

取生長一致的馬尾松無菌苗，在無菌條件下將根部接觸接種于培養(yǎng)30 d的橙黃乳菇菌絲體上并進行培養(yǎng)（PMLA）。以無菌塊接種的馬尾松無菌苗為對照（PM），每個處理20個重復。接種后在23 ℃條件下16 h光照/18 h黑暗交替培養(yǎng)6個月。隨機取3株幼苗從基徑部分收集根部進行代謝物測定。

擴培培養(yǎng)基：50 g鮮馬鈴薯、1%NaCl、1%CaCl2、0.015%MgSO4·7H2O、0.2%酵母粉、0.1%麥芽浸粉、0.2%蛋白胨、0.05%K2HPO4配置成1 L培養(yǎng)基，混勻后121℃，0.1 MPa滅菌20 min。所用試劑均為分析純。

1.3 菌根形態(tài)觀察

每個處理隨機取5株幼苗，在Ecoline體式顯微鏡下觀察菌根形態(tài)。

1.4 代謝物分析

1.4.1 主要試劑和儀器

試劑：甲醇（LC-MS級，CNW Technologies）、乙腈（LC-MS級，CNW Technologies）、甲酸（LC-MS級，SIGMA）。儀器：超高效液相（Exion LC AD，Sciex）；高分辨質譜（QTrap 6500，Sciex）；色譜柱（Acquity UPLC HSS T3 1.8 μm，2.1 mm×100 mm，Waters）。

1.4.2 樣品制備

樣品經真空冷凍干燥研磨成粉末后取50 mg溶解于700 μL已在-40 ℃預冷后的甲醇：水[1∶1（體積比），內標濃度20 mg/L]提取液中重復勻漿超聲3次；4 ℃過夜后于4 ℃，12 000 r/min離心15 min；取上清液過0.22 μm微孔濾膜后稀釋10倍后制作混合QC（Quality control，QC）樣本。

1.4.3 液相條件

色譜柱：Acquity UPLC HSS T3 （1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；流動相A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：乙腈。B相在0～10 min由2%增加到50%，11 min增加到95%并保持2 min，后降至2%保持至15 min；流速400 μL/min，進樣量2 μL。

1.4.4 質譜條件

使用IonDrive Turbo V ESI離子源的SCIEX 6500 QTRAP+三重四極桿質譜儀對UHPLC分離后的樣品進行分析，以多反應檢測（MRM）模式進行質譜分析，具體參數(shù)：離子噴霧電壓：+5 500 V（正離子模式）或-4 500 V（負離子模式）；離子源溫度400 ℃；離子源氣體Ⅰ（GSⅠ），氣體Ⅱ（GS Ⅱ）設置為60 psi；DP為±100 V。

1.4.5 代謝物定性和定量

用軟件SCIEX Analyst Work Station Software（Version 1.6.3）處理質譜數(shù)據(jù)?；贖MDB數(shù)據(jù)庫（V4.0）和KEGG COMPOUND數(shù)據(jù)庫（https：// www.kegg.jp/kegg/compound）對預處理后的數(shù)據(jù)進行注釋，使用T檢驗計算每個代謝產物的差異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）。使用SIMCA （V14.1）進行正交偏最小二乘-判別分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLA-DA），并進行200次置換測試驗證模型的可靠性，計算變量重要性投影（Variable importance in projection，VIP）。依據(jù)P<0.05且VIP>1篩選顯著差異代謝物。上調代謝物：log2（FC）>1、下調代謝物：log2（FC）<1。使用KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫（https：// www.kegg.jp/kegg/pathway.html）對差異物質進行通路功能分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2022軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行Duncan多重比較，P<0.05為組間差異具有統(tǒng)計學意義；采用SIMCA （V14.1）進行主成分分析和正交偏最小二乘-判別分析。

2 結果與分析

2.1 橙黃乳菇-馬尾松菌根形態(tài)

利用體式顯微鏡觀察橙黃乳菇-馬尾松菌根形態(tài)，結果如圖1顯示，接種橙黃乳菇后馬尾松根系與橙黃乳菇形成二叉分支狀菌根結構，根尖部分膨大粗壯呈棒槌形囊狀體，進一步發(fā)育形成二叉結構并分布有外延菌絲，根尖幼嫩部分菌根顏色呈黃褐色；而非菌根化根系根尖呈淡黃色，表面有大量根毛，無明顯分支和增粗，表明菌根的形成會改變馬尾松根系形態(tài)結構。

2.2 橙黃乳菇-馬尾松菌根合成代謝產物分析

使用廣泛靶向代謝組學技術對PM和PMLA樣本包括QC樣本進行無監(jiān)督主成分分析（PCA），以了解本研究中樣本間總體代謝差異及組內變異情況。從PCA得分圖中看出，PM和PMLA樣本與QC樣本組間分離度大，表明樣品具有可重復性，QC樣本與其他兩組有顯著區(qū)別，表明不同處理組間代謝差異顯著（圖2A）。主成分1和2分別解釋了26.00%和14.71%的變化（圖2B），PC1-PC4的累積比例達到66.70%，PC1、PC2、PC3、PC4、PC5、PC6、PC7的方差比例分別為26.00%、14.71%、13.20%、12.79%、11.83%、11.23%和10.24%。在兩組樣品中共鑒定和注釋了627種代謝物，主要分為15類（圖2C），包括135種黃酮類化合物（占總代謝產物的21.53%）、103種生物堿（16.43%）、92種萜類化合物（14.67%）、59種酚類（9.41%）、35種木脂素和香豆素（5.58%）、30種脂質（4.78%）、28種有機酸及其衍生物（4.47%）、26種氨基酸及其衍生物（4.15%）、21種核苷酸和衍生物（3.35%）、13種甾類化合物（2.07%）、11種植物激素（1.75%）、11種醌類（1.75%）、8種糖類化合物（1.28%）、4種維生素（0.64%）和51種其他化合物（8.13%）。

2.3 差異代謝物多元統(tǒng)計分析

通過主成分分析兩組樣本的差異代謝物變化。由圖3A可知，第一主成分（69.80%）和第二個主成分（16.50%）共解釋了原始數(shù)據(jù)86.30%變異程度，可描述兩組處理差異代謝物整體分布情況，PM和PMLA樣本在第一主成分上明顯分離，組內樣本成分接近，表明橙黃乳菇菌根形成顯著影響了馬尾松根系代謝譜。為降低相關性較小變量帶來的誤差，最大限度地區(qū)分組別，建立OPLS-DA模型分析PM和PMLA樣品之間的差異（圖3B），OPLS-DA評分圖顯示兩組樣本之間明顯分離，這與主成分分析結果一致。根據(jù)200次置換模型驗證中R2=（0.0，1），Q2=（0.0，0.909），表明該模型有意義，可通過VIP值篩選差異代謝物（圖3C）。

在PM和PMLA樣品中，結合P值<0.05，VIP>1原則篩選差異代謝物，PM vs. PMLA比較組中共篩選出95種顯著差異代謝物。將差異代謝物分為12類，包括30種黃酮類化合物（占總差異代謝物的31.58%）、13種萜類化合物（13.68%）、10種氨基酸及其衍生物（10.53%）、8種酚類（8.42%）、7種生物堿（7.37%）、6種有機酸及其衍生物（6.32%）、5種核苷酸及其衍生物（5.26%）、4種香豆素和木脂素（4.21%）、4種植物激素（4.21%）、1種醌類（1.05%）、1種維生素（1.05%）和6種其他化合物（6.32%）（圖4A）?；鹕綀D顯示了在PM和PMLA的95種差異代謝物中，有39種上調，56種下調（圖4B）。黃酮類、氨基酸及其衍生物、酚類、有機酸及其衍生物下調數(shù)量增加，黃酮是在菌根形成后發(fā)生變化的主要代謝物類別（表1），有9種上調，21種下調；10種氨基酸及其衍生物有2種上調，8種下調；8種酚類化合物有1種上調，7種下調。萜類和生物堿類上調數(shù)量較多，萜類有10種上調，3種下調；糖類、脂質和甾體及其衍生物在菌根形成后沒有顯示出顯著的變化，表明黃酮、酚類化合物和氨基酸及其衍生物下調有利于菌根形成，萜類和生物堿類化合物上調有利于促進菌根形成。為更直觀觀察每個生物重復中差異代謝物的積累模式差異，利用差異代謝物相對含量繪制聚類熱圖進行分析（圖4C）。聚類熱圖結果表明差異代謝在PM和PMLA中被明顯分為兩個簇，生物學重復之間也同樣聚成一簇，表明兩組處理和生物學重復之間具有同質性。聚類熱圖分析和主成分分析都表明菌根形成對馬尾松根系代謝物變化明顯。

2.4 差異代謝物相對含量分析

植物的初生代謝和次生代謝對植物生長和維持生命活動具有重要作用。圖5展示了12類差異代謝物的相對含量變化。以FC大小進行物質相對含量變化描述（FC值大，上調越顯著；FC值小，下調越顯著）。PM和PMLA中，差異初生代謝物包括氨基酸及其衍生物、有機酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、維生素。氨基酸及其衍生物作為主要初生代謝物，在菌根形成后半胱氨酰甘氨酸、酪胺、羥基色胺、5-氨基戊酸、L-纈氨酸、5-氧化脯氨酸極顯著下調，色胺、N-乙酰-L-亮氨酸、氧化谷胱甘肽、N’-甲酰基犬尿氨酸顯著上調（圖5B）。有機酸及其衍生物和核苷酸及其衍生物變化趨勢與氨基酸及其衍生物一致，3-羥基-2-氨基苯甲酸顯著上調（FC=3.99），其余4種顯著下調（圖5B）。核苷酸及其衍生物中7-甲基黃嘌呤和2’-脫氧鳥苷含量顯著上調，其余3種含量顯著下調，其中胸苷含量極顯著下調（FC=0.31）（圖5D）。PM和PMLA初生差異代謝物中僅有核黃素1種維生素，與其他3種初生代謝物不同，核黃素在菌根形成后顯著上調（FC=6.76）（圖5D）。

橙黃乳菇-馬尾松菌根形成后PM和PMLA中差異代謝物主要為次生代謝物，包含黃酮、酚類、萜類、植物激素、生物堿類、香豆素和木脂素等。菌根形成后共有30種黃酮類化合物受到顯著影響（圖5A），菌根形成后21種黃酮類化合物水平顯著下調，槲皮素、2’，4’，5，7-四羥基異黃烷酮、柚皮苷查爾酮、紫鉚素、異鼠李素、三粒小麥黃酮、喬松素、香葉木素、異櫻花亭、高圣草素含量極顯著下調，其中柚皮苷查爾酮FC=0.08，喬松素FC=0.09；有9種黃酮顯著上調，其中茶黃素極顯著上調（FC=3.23），6，8-二異戊二烯基柚皮素顯著上調（FC=3.60）。酚類化合物中，除紅景天苷（FC=1.94）顯著上調外，其他7種化合物均下調，其中羥苯乙醇胺極顯著下調（FC=0.000 15），是菌根形成中關鍵化合物（圖5C）。與黃酮和酚類變化不同，萜類和生物堿差異代謝物數(shù)量在菌根形成后增加。萜類中馬錢苷酸、丁位壬內酯、苯坐卡因極顯著下調，其他10種萜類化合物顯著上調，α-常春藤皂苷（FC=4.01），靈芝酸F（FC=5.40），雷公藤乙素（FC=3.89）顯著上調（圖5C）。生物堿中除3-甲基吲哚（FC=0.05）和蠟梅堿（FC=0.19）極顯著下調，毛果蕓香堿、苯并咪唑氨甲酸乙酯、苦豆堿、犬尿喹啉酸、菘藍千里光堿均顯著上調，苯并咪唑氨甲酸乙酯極顯著上調（FC=4.48）（圖5B）。其他幾類差異代謝物中異戊烯基腺苷顯著上調（FC=3.16），（2S，5S）-trans-Carboxymethylproline和Glucoiberin分別極顯著上調（FC=5.35，2.20）（圖5D）。

2.5 差異代謝物KEGG注釋和富集分析

對95種差異代謝物進行了KEGG注釋（圖6A），共涉及26條代謝途徑，屬于6個模塊，包括生物體系統(tǒng)（8條途徑）、環(huán)境信息處理（3條途徑）、細胞過程（1條途徑）、人類疾?。?條途徑）、遺傳信息處理（1條途徑）和代謝（11條途徑）。其中代謝差異最大的分布在全局和總覽圖、化學結構轉化圖、其他次生代謝產物的生物合成和氨基酸代謝途徑上，分別為41個（85.42%）、18個（37.50%）、17個（35.42%）和13個（27.08%）。采用代謝物拓撲分析計算得到的影響因子可以衡量代謝物在代謝通路中的作用大小。圖6B的結果顯示，次生代謝產物的生物合成、苯丙烷類化合物的生物合成、類黃酮生物合成、神經活性配體-受體相互作用、鐵載體基非核糖體肽的生物合成、苯甲酸鹽降解途徑、植物激素的生物合成、莽草酸途徑生物堿的生物合成和氨基苯甲酸降解等途徑是橙黃乳菇形成中顯著富集通路，次生代謝產物的生物合成、苯丙烷類化合物的生物合成、類黃酮生物合成途徑中差異代謝物富集數(shù)量最多。此外，為對橙黃乳菇-馬尾松菌根形成富集通路中差異代謝物的轉化進行可視化，通過KEGG富集途徑和注釋差異代謝物的網絡圖（圖7）可以看出，原兒茶酸、2-吡啶甲酸、順式烏頭酸、莽草酸、延胡索酸是差異代謝途徑中關鍵差異代謝物。次生代謝產物的生物合成和氨基苯甲酸降解途徑還富集了7-甲基黃嘌呤、飛燕草素、毛果蕓香堿、核黃素和3-羥基鄰氨基苯甲酸，這些差異代謝物在菌根形成后顯著上調。

3 討 論

外生菌根真菌與土壤、植物、微生物等生境因子之間存在復雜的相互作用關系。菌根形成過程中產生的代謝產物組成和含量對植物-土壤反饋調節(jié)[26]，植物多樣性-生產力關系[27-28]以及礦物-有機質相互作用[29]等具有深遠影響，但目前關于共生調控研究仍較薄弱，特別是對于橙黃乳菇的代謝調控研究。在本研究中，通過純培養(yǎng)條件下分析橙黃乳菇-馬尾松菌根和馬尾松根系代謝物差異，在二者中共檢測到627種代謝產物，菌根形成前后根系代謝物在成分上相同，但含量差異較大。這一結果表明橙黃乳菇-馬尾松菌根形成對馬尾松根系代謝物含量具有顯著影響，未來可通過研究適當添加或減少代謝物調節(jié)菌根形成。此外，兩組結果中根系代謝物種類相同可能與純培養(yǎng)條件合成菌根有關，純培養(yǎng)雖可控制菌根形成不受雜菌干擾或減少環(huán)境條件的影響，但菌根真菌和植物生長也缺少了外界環(huán)境的反饋和調節(jié)作用，同時營養(yǎng)限制可能也導致一些代謝物無法合成或未被檢測出。因此在后續(xù)對橙黃乳菇-馬尾松菌根的研究還應結合不同接種方式、土壤環(huán)境、根際微生物相互作用及生長調節(jié)等因素影響下多種信號分子交流導致的代謝物差異變化進行探討。

菌根真菌與宿主植物共生關系的建立和維持需存在緊密且精確的分子交流，在共生關系建立前，一些寄主植物除分泌獨腳金內酯等植物激素發(fā)出信號吸引菌根真菌定殖外[17]，黃酮類化合物也被證實可作為共生信號分子，在低劑量下能夠促進菌根真菌孢子萌發(fā)和菌根真菌侵染[16，30]。本研究在對橙黃乳菇-馬尾松菌根形成前后的差異代謝物分析中，共篩選出95種化合物，其中超過30%化合物屬于黃酮類化合物，且有70%黃酮化合物顯著下調，而20種萜類和生物堿類化合物中有75%化合物顯著上調，表明黃酮類化合物下調、萜類和生物堿類化合物上調可能在菌根形成中具有重要信號調節(jié)作用，有利于橙黃乳菇-馬尾松菌根形成。然而，黃酮類化合物在菌根-宿主植物共生中的作用仍然存在爭議，一些研究也描述了其對菌根共生的正向、反向或中性結果[31-32]。這可能受菌根類型、實驗差異等影響，如外生菌根真菌共生可顯著增加約30%的植物總生物量[33-34]，而叢枝菌根真菌對無機營養(yǎng)的獲取能力較強，可有效緩解植物的磷營養(yǎng)限制[4]。此外，在課題組前期研究中也發(fā)現(xiàn)，植物共生體類型差異會影響橙黃乳菇菌根根系代謝物中黃酮和萜類及生物堿含量，且表現(xiàn)出相反的變化趨勢。這項研究進一步促進了對橙黃乳菇和馬尾松相互作用中代謝物變化的理解。

從主要差異代謝物來看，橙黃乳菇-馬尾松菌根形成后差異代謝物主要為次級代謝物，差異代謝物前20的代謝物包括黃酮、萜類、生物堿和核黃素，與差異代謝物分類結果一致。值得注意的是，在差異代謝物中，有機酸及其衍生物在菌根形成后上下調程度較小，但在次生代謝產物的生物合成、苯丙烷類化合物的生物合成、類黃酮生物合成等KEGG差異代謝物富集途徑中2-吡啶甲酸、順式烏頭酸、莽草酸、延胡索酸是差異代謝途徑中關鍵化合物。橙黃乳菇-馬尾松菌根形成后根系次級代謝調節(jié)方面影響較大，主要涉及次生代謝產物的生物合成、苯丙烷類化合物的生物合成、類黃酮生物合成、神經活性配體-受體相互作用、鐵載體基非核糖體肽的生物合成、苯甲酸鹽降解途徑、植物激素的生物合成、莽草酸途徑生物堿的生物合成和氨基苯甲酸降解途徑，其中以次生代謝物的生物合成較為集中，有18個差異代謝物與次級代謝物合成有關，是植物重要生命過程（檸檬酸循環(huán)，三羧酸循環(huán)等）的中間體或前體。一些次生代謝物如黃酮、酚類物質通常在菌根共生中對于促進植物抗旱性、氧化應激等具有重要作用[9，33]，而菌根形成后菌根真菌分泌的萜類、生物堿類等次生代謝物則可促進植物側根形成和發(fā)育[36-37]。因此，橙黃乳菇-馬尾松共生可能也具有相同反應機制，在菌根形成后次生代謝產物的生物合成途徑成為主要差異代謝物富集途徑。此外，苯甲酸鹽降解途徑和氨基苯甲酸降解途徑在差異代謝物富集中極顯著，且3-羥基鄰氨基苯甲酸顯著上調，說明橙黃乳菇-馬尾松共生可能具有較強的降解苯甲酸鹽等外源性化學物質的能力。

外生菌根真菌的子實體具有很高的食用價值和經濟價值，不僅在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著土壤有機質“分解者”的角色，其與植物的共生互作作用也促進了植物養(yǎng)分吸收和生長調控。外生菌根真菌-植物相互作用在維持森林生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關鍵作用，但其中的多重互作機制仍有待深入探究，如外生菌根真菌與植物間信號交流機制、微生物富集的分子調控機制、互作微生物和環(huán)境因素的代謝響應及該過程所產生的碳循環(huán)功能機制等是未來的重要研究方向。本研究通過純培養(yǎng)條件下對橙黃乳菇-馬尾松菌根形成前后的差異代謝物和關鍵代謝通路進行了剖析，但受限于純培養(yǎng)條件下營養(yǎng)和環(huán)境單一性，研究仍有不足之處，不同環(huán)境條件下橙黃乳菇-馬尾松菌根形成代謝物是否一致仍需確證。同時，針對本研究結果，本研究擬在橙黃乳菇-馬尾松菌合成或培育過程中通過添加差異代謝進一步探究菌根合成成功率，為外生菌根真菌人工馴化栽培提供參考。

4 結 論

本研究結果表明橙黃乳菇-馬尾松菌根形成前后根系代謝物具有顯著差異，差異代謝物成分相同，主要集中于黃酮類、酚類、萜類和生物堿類等化合物。橙黃乳菇-馬尾松菌根形成后根系黃酮和酚類差異代謝物顯著下調，包括柚皮苷查爾酮、喬松素、羥苯乙醇胺等相對含量顯著降低；萜類和生物堿類顯著上調，包括α-常春藤皂苷、靈芝酸、雷公藤乙素、毛果蕓香堿、苯并咪唑氨甲酸乙酯等相對含量顯著增加。差異代謝物主要富集于次生代謝產物的生物合成、苯丙烷類化合物的生物合成、類黃酮生物合成、神經活性配體-受體相互作用、鐵載體基非核糖體肽的生物合成、苯甲酸鹽降解途徑等9條代謝途徑。這些差異代謝物和差異代謝途徑可能是促進橙黃乳菇-馬尾松菌根形成和相互作用的重要原因，這為橙黃乳菇-馬尾松共生機制研究奠定了基礎。

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[本文編校：吳 毅]