[摘要]目的：研究CXXC5對高糖環(huán)境下人臍靜脈內皮細胞功能的影響及其機制。方法：采用慢病毒轉染技術敲低人臍靜脈內皮細胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）中CXXC5的表達，通過劃痕實驗和Western blot分析CXXC5對HUVEC遷移和分化能力的影響，以及Wnt/β-catenin信號通路在其中的作用。結果：慢病毒轉染敲低CXXC5延緩高糖誘導下HUVEC的遷移并阻礙血管內皮分化，Wnt/β-catenin信號通路抑制劑可以增強這一阻斷作用。結論：敲低CXXC5在高糖環(huán)境下可顯著降低HUVEC的遷移、分化功能，Wnt/β-catenin信號通路在這一過程中發(fā)揮著重要作用。

[關鍵詞]高糖；CXXC5；人臍靜脈內皮細胞；CD31；Wnt/β-catenin信號通路

[中圖分類號]R541.4" " [文獻標志碼]A" " [文章編號]1008-6455（2025）01-0006-04

Effects of CXXC5 on Human Umbilical Vein Endothelial Cells Function in High Glucose Environment

CHEN Yutong1， MA Zhouji2， HUANG Heyan3， WU Xiangyi1， SHAO Shuai1， TAN Qian1

（ 1.Department of Burn and Plastic Surgery， Nanjing Durm Tower Hospital， the Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School， Nanjing 210000， Jiangsu， China; 2.Department of Burn and Plastic Surgery， Gulou Clinical Medical College of Nanjing Medical University， Nanjing 210000， Jiangsu， China; 3.Department of Burn and Plastic Surgery， Gulou Clinical Medical College of Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210000， Jiangsu， China ）

Abstract： Objective" To study the effects of CXXC5 on human umbilical vein endothelial cell function in high glucose environment and its mechanism. Methods" Scratch test and Western blot were used to detect the effect of CXXC5 on the migration and differentiation ability of human umbilical vein endothelial cells （HUVEC）， as well as the role of Wnt/β-catenin signaling pathway in it. Results" Knockdown of CXXC5 by lentiviral transfection delays the migration of HUVEC induced by high glucose and impedes vascular endothelial differentiation. Wnt/β-catenin signaling pathway inhibitors could enhance this blocking effect. Conclusion" Knockdown of CXXC5 can significantly reduce the migration and differentiation of HUVEC in high glucose environment. Wnt/β-catenin signaling pathway plays an important role in this process.

Key words： high glucose; CXXC5 Human umbilical vein endothelial cells; CD31; Wnt/β-catenin signaling pathway

糖尿?。―iabetes mellitus，DM）最嚴重的并發(fā)癥之一是傷口愈合受損[1-2]，慢性傷口影響著糖尿病患者的行動能力、社會功能和健康，是住院和截肢的主要原因。血管生成是影響創(chuàng)面愈合的關鍵因素[3-4]。由于長期高血糖環(huán)境，糖尿病患者血管內皮細胞的遷移、增殖分化能力減弱，這導致傷口的新生血管減少，并嚴重影響傷口愈合[5]。CXXC5是CXXC型鋅指家族蛋白的成員之一，參與細胞分化、內皮細胞侵襲等多種生物學過程[6-7]。研究發(fā)現CXXC5作為轉錄因子，可與Flk-1啟動子結合并在HUVEC中刺激內皮細胞中的細胞遷移和促進新生血管形成[8]。傷口修復是一個高度復雜的形成過程，它招募多種細胞和信號通路來實現血管重建和上皮化，Wnt/β-catenin通路的異常破壞與許多類型的疾病密切相關，包括傷口愈合，癌癥，脫發(fā)和骨質疏松癥等[9]。Wnt/β-catenin細胞內通路的激活通過改善傷口新生血管生成、細胞增殖、分化等來調節(jié)傷口愈合[10]。近來研究發(fā)現，CXXC5是Wnt/β-catenin通路的負調節(jié)因子，通過與Dvl蛋白的相互作用阻礙皮膚傷口愈合[11]。糖尿病創(chuàng)面中內皮細胞的增殖、遷移和分化是傷口愈合的關鍵因素，然而CXXC5對高糖下HUVEC的影響及其機制研究目前報道較少。本研究通過體外培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞（HUVEC），探討高糖誘導下改變CXXC5表達對HUVEC遷移、分化的影響，及Wnt/β-catenin通路發(fā)揮的作用。為糖尿病創(chuàng)面血管內皮細胞功能紊亂的調節(jié)提供一定的實驗依據。

1" 材料和方法

1.1 實驗主要試劑：HUVEC（中國科學院上海生命科學研究院）；DMEM培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司）；胎牛血清（依科賽生物科技有限公司）；全蛋白提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；BCA蛋白含量檢測試劑盒（碧云天生物技術）；CXXC5敲低慢病毒（中國吉凱基因公司）；PAGE凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物技術有限公司）；預染蛋白Marker（Thermo Fisher Scientific 26616，美國）超敏ECL化學發(fā)光試劑盒（諾唯贊生物科技有限公司）；CXXC5抗體（成都正能生物技術有限公司）；CD31、β-catenin抗體（abcam，美國）；β-actin（Proteintech，美國）；山羊抗兔二抗（北京中山金橋生物技術有限公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)：將HUVEC置于含10%胎牛血清的（高糖濃度為30 mM）DMEM中培養(yǎng)，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)，在細胞呈對數生長期時進行傳代、凍存等。

1.3 慢病毒轉染HUVEC：慢病毒載體帶有綠色熒光蛋白基因和嘌呤霉素抗性等特征，即轉染成功后的細胞可以正常表達綠色熒光并對嘌呤霉素耐藥。根據慢病毒轉染手冊，轉染前24 h，選取生長狀態(tài)良好的目標細胞，常規(guī)培養(yǎng)條件下，6孔板每孔加入10×104個細胞進行培養(yǎng)。吸取原培養(yǎng)基，加入每孔含有4l病毒液的新鮮DMEM培養(yǎng)基，同時以陰性對照慢病毒轉染細胞，作為對照組，細胞置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。轉染后8～12 h觀察細胞狀態(tài)，若細胞生長狀態(tài)不佳及時更換培養(yǎng)液。轉染后96 h于倒置熒光顯微鏡中觀察細胞綠色熒光蛋白表達情況，表達量＞70%則可加入嘌呤霉素（1 mg/L篩選未轉染細胞）。Western blot檢測各組蛋白表達情況，并行后續(xù)實驗。

1.4 Western blot檢測：收集處理后且生長狀態(tài)良好的HUVEC，按照試劑盒要求加入配置好的適量裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、PMSF，冰上裂解細胞30 min后離心機分離上清和沉淀，取上清加入Loading buffer（與裂解液1∶4），100℃煮沸5 min使蛋白變性進行下一步實驗。將提取的總蛋白將進行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳后，取下膠塊并轉移至PVDF膜上進行轉膜。轉膜結束后用脫脂牛奶配備的封閉液中搖床慢搖封閉1 h，加入一抗CXXC5（1∶2 500），β-catenin（1∶5 000），CD31（1∶1 000），β-actin（1∶4 000）4℃搖床孵育過夜。TBST洗3次，每次10 min，二抗（1∶300 000）室溫孵育1 h，再次TBST洗膜3次，每次10 min，加入ECL化學發(fā)光劑并曝光顯影。以β-actin為內參，圖像處理軟件Image J對蛋白條帶進行半定量分析。

1.5 細胞劃痕實驗：細胞消化離心后計數，將HUVEC種于6孔板中，待完全長滿后進行劃痕實驗。先用marker筆在6孔板背后，均勻地劃橫線每隔0.5～1 cm一道，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線；取已消毒的200 μl槍頭，垂直于孔板進行細胞劃痕。PBS沖洗細胞3次，除去劃下的細胞，然后加入無血清培養(yǎng)基；按照0 h、24 h顯微鏡下于相同位置拍照，使用Image J軟件計算劃痕面積均值。

1.6 統計學分析：每組實驗至少重復3次。采用SPSS 18.0統計軟件進行統計分析，計量資料以（xˉ±s）的形式表示，組間采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2" 結果

2.1 HUVEC穩(wěn)定轉染細胞株的建立與鑒定：選取HUVEC作為下調CXXC5目標細胞株，熒光顯微鏡下觀察細胞轉染率達90%以上，繼續(xù)添加嘌呤霉素至完全培養(yǎng)基（1 mg/L）篩選，細胞在傳代后能持續(xù)表達綠色熒光蛋白同時生長速度及狀態(tài)佳，形成穩(wěn)轉株（見圖1）。Western blot檢測證實shCXXC5組較shControl組顯著下調（見圖2）。

2.2 CXXC5表達影響HUVEC的遷移能力：采用劃痕實驗研究CXXC5對HUVEC遷移的影響，與shCXXC5組相比，對照組的HUVEC的劃痕閉合面積下降了62%。各組間差異明顯，結果有統計學意義（P＜0.05）。這提示shCXXC5組在高糖環(huán)境下抑制HUVEC遷移，延緩其遷移速度。見圖3。

2.3 CXXC5負調控高糖環(huán)境下誘導的HUVEC中Wnt/β-catenin信號的表達：采取shCXXC5和MSAB分組給藥后WB鑒定的方法驗證表征（見圖4），實驗結果發(fā)現shCXXC5組中β-catenin的表達較shControl組明顯增高，而這一能力在使用Wnt/β-catenin信號通路抑制劑MSAB后被明顯抑制了。同樣的，shCXXC5組中CD31的表達較shControl組明顯降低，并且在使用Wnt/β-catenin信號通路抑制劑MSAB表達更低。

3" 討論

難以愈合的糖尿病傷口是糖尿病患者的常見并發(fā)癥，血管生成的損害在糖尿病足（DFU）的發(fā)展中起著關鍵作用[12]。糖尿病傷口的血管生成對于真皮的再生至關重要[13]，減少糖尿病引起的血管生成有助于糖尿病皮膚潰瘍的發(fā)展，尤其是DFU[14]。糖尿病患者血糖水平升高是導致血管生成受損和傷口愈合延遲的主要原因。體內研究表明，暴露于高葡萄糖濃度的內皮細胞會導致完整性喪失，增加對細胞凋亡、脫離和循環(huán)進入血液的易感性，導致血管生成紊亂[15]。因此維持血管生成的穩(wěn)態(tài)和正常生理功能對促進難愈性糖尿病創(chuàng)面的愈合十分重要。

CXXC5，也稱為類視黃醇誘導核因子，是CXXC型鋅指蛋白家族的成員[6]。該家族的成員具有專門的CXXC域，包括CXXC1/CFP1，CXXC2/KDM2B，TET1/3和DNMT1等，它們參與表觀遺傳調控，在胚胎發(fā)育，組織穩(wěn)態(tài)和病理改變中起著關鍵作用[16]。CXXC5蛋白雖然鮮為人知，但已被證明通過直接與DNA結合來充當轉錄調節(jié)因子。有趣的是，越來越多的證據表明，CXXC5基因表達受各種分泌細胞因子和細胞內轉錄因子的調節(jié)[17-18]。本研究發(fā)現在高糖環(huán)境中，使用慢病毒轉染的方式敲低HUVEC中的CXXC5表達，導致HUVEC的遷移速度減慢以及CD31表達降低。CD31是血管內皮分化的標志，陽性提示細胞具有血管內皮分化[19]。這些結果表明，敲低CXXC5抑制高糖環(huán)境下HUVEC遷移和分化。同樣的，有研究發(fā)現CXXC5作為轉錄因子，可與Flk-1啟動子結合并在HUVEC中誘導Flk-1表達，刺激體內外內皮細胞遷移和分化以及血管生成，加速斑馬魚血管發(fā)育[8]。此外，CXXC5還調節(jié)和協調多種信號通路，包括由Wnt/β-catenin，骨和形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）等啟動的信號通路。有研究表明CXXC5能夠通過其C端CXXC結構域與Dvl蛋白的PDZ結構域相互作用來抑制β-catenin信號傳導，從而抑制Wnt3a誘導的皮膚傷口愈合[11，20]。為此本研究檢測了Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵因子β-catenin的表達，證實高糖環(huán)境下敲低CXXC5后β-catenin表達增高，而這一能力在使用通路抑制劑MSAB后被抑制。

Lee SH等[11]發(fā)現敲低CXXC5可以通過激活Wnt/β-catenin途徑來活化成纖維細胞，從而促進皮膚傷口愈合和膠原蛋白產生。因此值得思考的是，既往研究中CXXC5的表達降低為何激活Wnt/β-catenin信號通路和成纖維細胞，促進創(chuàng)面愈合，卻抑制血管內皮細胞的遷移和分化。實際上，創(chuàng)面愈合的各個階段中并非單一細胞作用并調控，成纖維細胞和內皮細胞的相互作用在血管生成中非常重要。一般來說，成纖維細胞被認為在調節(jié)內皮細胞介導的血管生成中起關鍵作用。成纖維細胞產生不同種類的調節(jié)因子，如血管內皮生長因子（VEGF）和血小板衍生生長因子（PDGF）[21]，通常VEGF即VEGFA，VEGFA通過激活促進內皮細胞生長、遷移、分化、新生血管形成和增加血管通透性的各種信號通路來誘導生理和病理血管生成[20]，而成纖維細胞的活化可以加速VEGF的分泌，以刺激內皮細胞的增殖、遷移和最終的管形成。由此可見，皮膚傷口愈合是一個動態(tài)和互動的過程，是多種細胞間交互的結果，因此本研究將以此入手，進一步探索CXXC5對兩種高糖誘導下細胞的影響。

綜上所述，CXXC5的敲低在高糖環(huán)境下可顯著抑制HUVEC的遷移、分化功能，Wnt/β-catenin信號通路在這一過程中發(fā)揮著重要作用，具體機制有待進一步研究。

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[收稿日期]2023-06-28

本文引用格式：陳雨彤，馬周吉，黃何艷，等.CXXC5對高糖環(huán)境下人臍靜脈內皮細胞功能的影響研究[J].中國美容醫(yī)學，2025，34（1）：6-9.