關(guān)鍵詞棕矢車菊素；AMPK/NLRP3信號通路；骨關(guān)節(jié)炎；炎癥；細胞外基質(zhì)

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種與年齡相關(guān)的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，可引起嚴(yán)重和反復(fù)的炎癥和疼痛癥狀，最終導(dǎo)致受影響關(guān)節(jié)的功能降低或完全喪失[1]。近年來，隨著人口老齡化和肥胖的加劇，OA的發(fā)病率和致殘率逐年上升，已成為世界的重大公共衛(wèi)生問題之一[2]。目前OA的治療策略包括早期使用非甾體抗炎藥緩解疼痛，末期進行關(guān)節(jié)置換。然而，長期使用非甾體抗炎藥可致多種副作用發(fā)生，如胃腸道副作用、肝腎功能損傷等，關(guān)節(jié)假體的壽命短也是一個嚴(yán)重問題[3]。因此，亟須開發(fā)可有效逆轉(zhuǎn)OA發(fā)展的新藥。研究表明，炎癥反應(yīng)是OA發(fā)病機制的重要相關(guān)因素，可引發(fā)和加速疾病進展[4]。這提示開發(fā)抑制OA炎性損傷的藥物具有重要意義。

棕矢車菊素是一種從菊科、茜草科等植物中提取的天然類黃酮，具有抗炎、抗氧化等活性[5]。已有研究報道，棕矢車菊素可減輕OA小鼠軟骨損傷[6]，但具體機制尚不完全明確。相關(guān)研究顯示，調(diào)節(jié)腺苷一磷酸活化的蛋白激酶（adenosinemonophosphate-activatedproteinkinase，AMPK）/NOD樣受體蛋白3（NOD-likereceptorprotein3，NLRP3）通路可緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜炎癥[7]，但棕矢車菊素是否可通過調(diào)節(jié)AMPK/NLRP3信號通路來影響OA大鼠炎性損傷尚不可知?；诖?，本研究基于該通路探究了棕矢車菊素對OA大鼠炎性損傷的影響及機制，以期為OA的治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有500-714-10型游標(biāo)卡尺（日本Mitutoyo公司）、CX53型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）、ST-360型酶標(biāo)儀（上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司）、DYCZ-24DN型蛋白電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑有棕矢車菊素（純度≥98%，批號18085-97-7，四川精萃天成藥物科技有限公司），AMPK抑制劑CompoundC（批號HY-13418A，美國MCE公司），番紅O-固綠染色試劑盒（批號BES21441BO，上海博爾森生物科技有限公司），大鼠腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白細胞介素18（interleukin，IL-18）、IL-6酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號分別為20221105、20221129、20221227，上海廣銳生物科技有限公司），兔源膠原蛋白Ⅱ（collagenⅡ）、聚集蛋白聚糖（aggrecan，ACAN）、血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶5（adisintegrinandmetalloproteinasewiththrombospondin5，ADAMTS5）、AMPK、磷酸化AMPK（phosphorylatedAMPK，p-AMPK）、NLRP3、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗及過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（批號分別為ab307674、ab313636、ab32047、ab41037、ab133448、ab263899、ab8245、ab6721，英國Abcam公司），兔源裂解的胱天蛋白酶1（cleavedcaspase-1）、裂解的IL-1β（cleaved-IL-1β）一抗（批號分別為4199、12242，美國CST公司）。

1.3 實驗動物

本研究所用動物為SPF級雄性SD大鼠，共60只，8周齡，體重為310～320g，購自武漢有度生物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（鄂）2021-0025。所有動物均飼養(yǎng)于溫度為21～24℃、相對濕度為50%～60%、12h晝夜交替的環(huán)境中。所有操作均遵循動物護理和使用委員會的指導(dǎo)，并由武漢有度生物科技有限公司動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號202401016）。

2 方法

2.1 OA模型建立

采用改良Hulth法[8]建立OA模型，具體操作方法如下：將大鼠仰臥位固定，麻醉，剃除右側(cè)膝關(guān)節(jié)毛發(fā)、清洗、消毒后，沿右后膝關(guān)節(jié)前側(cè)縱向切開皮膚，暴露關(guān)節(jié)腔，依次切斷前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶，摘取半月板，縫合傷口。術(shù)后連續(xù)3d肌內(nèi)注射青霉素以防感染。

2.2 大鼠分組與處理

將大鼠隨機分為OA組、棕矢車菊素組、CompoundC組、棕矢車菊素+CompoundC組、假手術(shù)組，每組12只。假手術(shù)組大鼠除不做“切斷前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶，摘取半月板”處理外，其余操作同“2.1”項；其余各組大鼠均按“2.1”項下方法建立OA模型，以大鼠出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)腫脹、僵硬、活動受限等癥狀作為造模成功[9]。建模成功后，棕矢車菊素組大鼠灌胃33.33mg/kg棕矢車菊素[6]，且腹腔注射與CompoundC等體積的生理鹽水；CompoundC組大鼠腹腔注射20mg/kgCompoundC[10]，且灌胃與棕矢車菊素等體積的生理鹽水；棕矢車菊素+CompoundC組大鼠灌胃33.33mg/kg棕矢車菊素+腹腔注射20mg/kgCompoundC；OA組和假手術(shù)組大鼠灌胃與棕矢車菊素等體積的生理鹽水+腹腔注射與CompoundC等體積的生理鹽水。各組大鼠每天給藥1次，持續(xù)8周。

2.3 膝關(guān)節(jié)腫脹度檢測

末次給藥24h后，利用游標(biāo)卡尺測量所有大鼠的右膝關(guān)節(jié)直徑，以右膝關(guān)節(jié)直徑變化作為評估膝關(guān)節(jié)腫脹度的指標(biāo)。

2.4 膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理觀察

每組隨機選取6只大鼠，麻醉后處死，收集膝關(guān)節(jié)軟骨組織，用4%多聚甲醛溶液固定7d后，將樣品置于20%乙二胺四乙酸（pH7.4）中脫鈣，每3d更換一次脫鈣溶液，直到組織軟化；然后將樣品脫水，石蠟包埋后切片（5μm）。取部分切片分別進行蘇木精-伊紅（HE）、番紅O-固綠染色，通過光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，再根據(jù)Mankin評分標(biāo)準(zhǔn)[11]對大鼠OA嚴(yán)重程度進行評價。

2.5 膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-18、IL-6水平檢測

每組取剩余的6只大鼠，麻醉后處死，收集膝關(guān)節(jié)軟骨組織。取部分組織，根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作，檢測膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-18、IL-6水平。

2.6 膝關(guān)節(jié)軟骨組織中collagenⅡ、ACAN、ADAMTS5蛋白表達檢測

采用免疫組化法檢測。取“2.4”項下各組大鼠剩余膝關(guān)節(jié)軟骨組織切片進行抗原修復(fù)，然后于100℃保存1h，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，再用10%牛血清白蛋白阻斷后，加入collagenⅡ、ACAN、ADAMTS5一抗（稀釋比例分別為1∶300、1∶500、1∶900），于4℃孵育過夜；次日用磷酸鹽緩沖液洗滌切片，加入二抗（稀釋比例1∶1000），于37℃孵育1h；最后用二氨基聯(lián)苯胺處理并切片。通過ImageJ軟件分析collagenⅡ、ACAN、ADAMTS5蛋白表達（染色呈棕黃色）的吸光度值。

2.7 膝關(guān)節(jié)軟骨組織中AMPK/NLRP3信號通路相關(guān)蛋白表達檢測

取“2.5”項下各組大鼠剩余膝關(guān)節(jié)軟骨組織，先用RIPA緩沖液裂解并提取總蛋白，再用BCA法測量蛋白質(zhì)濃度后，加熱變性。取30μg蛋白質(zhì)進行電泳分離，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂牛奶封閉1h后，將膜與p-AMPK、AMPK、NLRP3、cleavedcaspase-1、cleaved-IL-1β、GAPDH（稀釋比例分別為1∶3000、1∶6000、1∶4000、1∶4000、1∶4000、1∶2000）一抗于4°C孵育過夜；次日用TBST緩沖液洗滌膜3次后，將膜與二抗（稀釋比例1∶4000）于室溫孵育2h。使用ECL試劑檢測條帶，ImageJ軟件分析灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值作為目的蛋白的表達水平，再以p-AMPK與AMPK的灰度值比值作為AMPK蛋白的磷酸化水平。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS25.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用事后SNK-q檢驗。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 棕矢車菊素對大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度的影響

與假手術(shù)組比較，OA組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度顯著升高（P＜0.05）；與OA組比較，棕矢車菊素組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度顯著降低（P＜0.05），CompoundC組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度顯著升高（P＜0.05）；與棕矢車菊素組比較，棕矢車菊素+CompoundC組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

3.2 棕矢車菊素對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理的影響

HE染色結(jié)果（圖1）顯示，假手術(shù)組大鼠軟骨組織形態(tài)正常；OA組大鼠軟骨組織有缺損，軟骨細胞分布不均且數(shù)量減少；與OA組比較，棕矢車菊素組大鼠軟骨組織缺損、軟骨細胞分布不均且數(shù)量減少的現(xiàn)象有所緩解，CompoundC組大鼠軟骨組織缺損、軟骨細胞分布不均且數(shù)量減少的現(xiàn)象較嚴(yán)重；與棕矢車菊素組比較，棕矢車菊素+CompoundC組大鼠軟骨組織缺損、軟骨細胞分布不均且數(shù)量減少的現(xiàn)象更嚴(yán)重。

番紅O-固綠染色結(jié)果（圖2）顯示，假手術(shù)組大鼠軟骨基質(zhì)染色呈紅色，且染色均勻；OA組大鼠部分軟骨基質(zhì)染色較淺且軟骨細胞數(shù)量減少；與OA組比較，棕矢車菊素組大鼠軟骨基質(zhì)染色加深且軟骨細胞數(shù)量增加，CompoundC組大鼠軟骨基質(zhì)染色較淺且軟骨細胞數(shù)量較少；與棕矢車菊素組比較，棕矢車菊素+CompoundC組大鼠軟骨基質(zhì)染色更淺且軟骨細胞數(shù)量更少。

與假手術(shù)組比較，OA組大鼠Mankin評分顯著升高（P＜0.05）；與OA組比較，棕矢車菊素組大鼠Mankin評分顯著降低（P＜0.05），CompoundC組大鼠Mankin評分顯著升高（P＜0.05）；與棕矢車菊素組比較，棕矢車菊素+CompoundC組大鼠Mankin評分顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

3.3 棕矢車菊素對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-18、IL-6水平的影響

與假手術(shù)組比較，OA組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-18、IL-6水平均顯著升高（P＜0.05）；與OA組比較，棕矢車菊素組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-18、IL-6水平均顯著降低（P＜0.05），CompoundC組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-18、IL-6水平均顯著升高（P＜0.05）；與棕矢車菊素組比較，棕矢車菊素+CompoundC組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-18、IL-6水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

3.4 棕矢車菊素對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中collagenⅡ、ACAN、ADAMTS5蛋白表達的影響

與假手術(shù)組比較，OA組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中collagenⅡ、ACAN蛋白表達均顯著下調(diào)，ADAMTS5蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.05）；與OA組比較，棕矢車菊素組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中collagenⅡ、ACAN蛋白表達均顯著上調(diào)，ADAMTS5蛋白表達顯著下調(diào)（P＜0.05），而CompoundC組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中collagenⅡ、ACAN蛋白表達均顯著下調(diào)，ADAMTS5蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.05）；與棕矢車菊素組比較，棕矢車菊素+CompoundC組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中collagenⅡ、ACAN蛋白表達均顯著下調(diào)，ADAMTS5蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.05）。結(jié)果見圖3、表3。

3.5 棕矢車菊素對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中AMPK/NLRP3信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

與假手術(shù)組比較，OA組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中AMPK蛋白磷酸化水平顯著降低，NLRP3、cleavedcaspase-1、cleaved-IL-1β蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與OA組比較，棕矢車菊素組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中AMPK蛋白磷酸化水平顯著升高，NLRP3、cleaved-caspase-1、cleaved-IL-1β蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），而CompoundC組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中AMPK蛋白磷酸化水平顯著降低，NLRP3、cleaved-caspase-1、cleaved-IL-1β蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與棕矢車菊素組比較，棕矢車菊素+CompoundC組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中AMPK蛋白磷酸化水平顯著降低，NLRP3、cleaved-caspase-1、cleaved-IL-1β蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖4和表4。

4 討論

OA是最常見的關(guān)節(jié)疾病，由于人口老齡化，OA的負擔(dān)成為了全球主要的社會經(jīng)濟問題[12]。隨著OA病情的進展，會出現(xiàn)嚴(yán)重的軟骨退化、關(guān)節(jié)腫脹和疼痛等癥狀[13]。本研究通過改良Hulth法建立了OA大鼠模型，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，OA組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度顯著升高，軟骨組織有缺損，部分軟骨基質(zhì)染色較淺，軟骨細胞數(shù)量減少，膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin評分顯著升高，表明OA大鼠存在關(guān)節(jié)腫脹及膝關(guān)節(jié)軟骨損傷，符合OA的特征。

越來越多的證據(jù)表明了炎癥在OA中的核心作用[14]。TNF-α、IL-18、IL-6是常見的促炎細胞因子，在加重炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮著重要的作用[15]。本研究結(jié)果顯示，OA組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-18、IL-6水平均顯著高于假手術(shù)組，表明OA大鼠存在炎癥反應(yīng)。棕矢車菊素已被證明具有抗氧化、抗炎和免疫抑制特性[16]。已有研究報道，棕矢車菊素可抑制脂多糖所致急性肺損傷小鼠的炎癥反應(yīng)[17]。本研究結(jié)果顯示，棕矢車菊素組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α、IL-18、IL-6水平均顯著低于OA組，表明棕矢車菊素可抑制OA大鼠炎癥反應(yīng)。

有研究顯示，OA的發(fā)生與細胞外基質(zhì)降解增強有關(guān)，細胞外基質(zhì)蛋白賦予細胞生物力學(xué)特性，維持細胞表型并介導(dǎo)組織修復(fù)[18]。collagenⅡ和ACAN是細胞外基質(zhì)的主要成分，是維持軟骨細胞表型所必需的成分，可被ADAMTS5降解，進而誘導(dǎo)軟骨細胞失去正常表型，導(dǎo)致軟骨損傷[19]。本研究結(jié)果顯示，棕矢車菊素組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中collagenⅡ、ACAN蛋白表達顯著高于OA組，ADAMTS5蛋白表達顯著低于OA組，表明棕矢車菊素可抑制OA大鼠細胞外基質(zhì)降解。

AMPK幾乎存在于哺乳動物的所有組織和細胞中，其在調(diào)節(jié)能量和物質(zhì)代謝方面起著至關(guān)重要的作用，可參與各種生物學(xué)功能，如炎癥反應(yīng)。NLRP3炎癥小體活化后促使caspase-1活化，隨后切割lL-1β及IL-18前體，產(chǎn)生具有生物活性的IL-1β及IL-18，并釋放到細胞外；激活的AMPK可抑制NLRP3炎癥小體激活，進而下調(diào)下游IL-18等炎癥因子的分泌，抑制機體炎癥反應(yīng)[20]。據(jù)報道，通過激活A(yù)MPK信號通路抑制NLRP3炎癥小體的激活，可緩解脊髓損傷大鼠的炎癥反應(yīng)[21]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，OA組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中AMPK蛋白磷酸化水平顯著降低，NLRP3、cleavedcaspase-1、cleaved-IL-1β蛋白表達水平均顯著升高；與OA組比較，CompoundC組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中AMPK蛋白磷酸化水平顯著降低，NLRP3、cleavedcaspase-1、cleaved-IL-1β蛋白表達水平均顯著升高，表明AMPK/NLRP3信號通路參與了大鼠OA過程。此外，與OA組比較，棕矢車菊素組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中AMPK蛋白磷酸化水平顯著升高，NLRP3、cleavedcaspase-1、cleaved-IL-1β蛋白表達水平均顯著降低，表明棕矢車菊素可上調(diào)OA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中AMPK蛋白磷酸化水平且下調(diào)NLRP3、cleaved-caspase-1、cleaved-IL-1β蛋白表達，提示棕矢車菊素可能通過調(diào)控AMPK/NLRP3信號通路來抑制OA大鼠炎癥反應(yīng)及細胞外基質(zhì)降解。為了驗證上述結(jié)果的合理性，本研究考察了AMPK抑制劑CompoundC對棕矢車菊素上述抑制作用的影響，結(jié)果顯示，CompoundC逆轉(zhuǎn)了棕矢車菊素對OA大鼠炎癥反應(yīng)及細胞外基質(zhì)降解的抑制作用，進一步表明棕矢車菊素可能通過激活A(yù)MPK抑制NLRP3信號通路來抑制OA大鼠炎癥反應(yīng)及細胞外基質(zhì)降解。

綜上所述，棕矢車菊素可能通過調(diào)控AMPK/NLRP3信號通路來抑制OA大鼠炎癥反應(yīng)及細胞外基質(zhì)降解。