〔摘要〕 目的 觀察劉氏小兒推拿配合康復(fù)訓練對孤獨癥譜系障礙兒童的核心癥狀及腸道菌群、代謝產(chǎn)物的影響。方法 將60例3～8歲孤獨癥譜系障礙兒童隨機分為觀察組和對照組，每組30例。兩組均進行康復(fù)訓練，觀察組給予劉氏小兒推拿干預(yù)，對照組給予常規(guī)推拿干預(yù)，每天1次，每周5次，連續(xù)干預(yù)12周。兩組分別在入組時、治療12周后接受兒童孤獨癥評定量表（CARS）、第三版孤獨癥心理教育評定量表（PEP-3）、中醫(yī)脾胃疾病癥狀量表評定，統(tǒng)計兩組之間的療效差異。治療結(jié)束當天行腸道菌群檢測、血漿代謝組學檢測，并采用Spearman相關(guān)分析方法，探討腸道菌群與代謝組學之間的關(guān)聯(lián)。基于KEGG分析差異代謝物，篩選潛在的關(guān)鍵代謝通路。結(jié)果 治療后，觀察組有效率（96.67%）高于對照組（73.33%）（Plt;0.05）。治療后，兩組PEP-3評分均上升（Plt;0.05），且觀察組高于對照組（Plt;0.05）;觀察組中醫(yī)脾胃疾病癥狀量表評分降低（Plt;0.05），且低于對照組（Plt;0.05）。與對照組比較，觀察組的腸道菌群在門水平上，放射菌門（Actinobacteriota）水平上調(diào)、厚壁菌門（Firmicutes）水平下調(diào);在屬水平上，雙歧桿菌（Bifdobactenum）相對豐度上調(diào)、埃氏菌屬-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）相對豐度下調(diào)。觀察組與對照組共篩選出雙歧桿菌等9個關(guān)鍵菌，代謝組學分析共篩選出6個顯著差異代謝物。KEGG通路分析結(jié)果顯示，差異代謝物主要與氨基酸代謝、蛋白質(zhì)消化與吸收、氨酰tRNA生物合成等通路相關(guān)。結(jié)論 劉氏小兒推拿能明顯改善孤獨癥譜系障礙兒童的核心癥狀，調(diào)控腸道菌群如雙歧桿菌等菌屬豐度，同時可以影響代謝物水平，且部分代謝物的改變與腸道菌群存在復(fù)雜的相關(guān)性，可能與氨酰tRNA生物合成、氨基酸代謝、蛋白質(zhì)消化與吸收等途徑相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 劉氏小兒推拿;孤獨癥譜系障礙;腸道菌群;代謝組學;社交能力

〔中圖分類號〕R242" " " " "〔文獻標志碼〕B" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.01.012

Mechanism of action of Liu's pediatric tuina intervention in children with autism spectrum disorders based on intestinal flora and metabolomics

XIE Ying1，2， LIU Huihui2， LI Xuhua1， CAO Zhengliang1， XIA Yun1， ZHU Qinquan1， HU Guoheng1，2*

1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Liu's pediatric tuina combined with rehabilitation training on the core symptoms， intestinal flora， and metabolites in children with autism spectrum disorders （ASD）. Methods Sixty children aged three to eight years with ASD were randomized into observation group and control group， with 30 children in each group. Both groups underwent rehabilitation training， with the observation group receiving Liu's pediatric tuina intervention and the control group receiving conventional tuina intervention， once a day， five times a week， for 12 consecutive weeks. Both groups were assessed using the Childhood Autism Rating Scale （CARS）， Psycho-educational Profile-3rd Edition （PEP-3）， and the Chinese Medicine Spleen and Stomach Disease Symptom Scale at baseline and after 12 weeks of treatment. The efficacy differences between the two groups were statistically analyzed. On the last day of treatment， intestinal flora testing and plasma metabolomics analysis were performed， and the Spearman correlation analysis was used to explore the correlation between intestinal flora and metabolomics. Based on the KEGG analysis， differential metabolites were analyzed to screen for potential key metabolic pathways. Results After treatment， the effective rate in the observation group （96.67%） was higher than that in the control group （73.33%） （Plt;0.05）. After treatment， the PEP-3 scores of both groups increased （Plt;0.05）， with the observation group showing higher scores than the control group （Plt;0.05）. The Chinese Medicine Spleen and Stomach Disease Symptom Scale scores in the observation group decreased （Plt;0.05）， and were lower than those in the control group （Plt;0.05）. Compared with the control group， at the phylum level， the Actinobacteriota level was upregulated， while the Firmicutes level was downregulated in the intestinal flora in the obsevation group. At the genus level， the relative abundance of Bifidobacterium was upregulated， while that of Escherichia-Shigella was downregulated. Nine key bacteria， including Bifidobacterium， were identified in both the observation group and the control group， and six significantly different metabolites were screened through metabolomics analysis. The KEGG pathway analysis showed that the differential metabolites were mainly related to amino acid metabolism， protein digestion and absorption， aminoacyl-tRNA biosynthesis， and other pathways. Conclusion Liu's pediatric tuina can significantly alleviate the core symptoms of children with ASD， regulate the abundance of intestinal flora such as Bifidobacterium， and affect metabolite levels at the same time. Moreover， some changes in metabolites have complex correlations with intestinal flora， which may be related to aminoacyl-tRNA biosynthesis， amino acid metabolism， protein digestion and absorption， and other pathways.

〔Keywords〕 Liu's pediatric tuina; autism spectrum disorders; intestinal flora; metabolomics; social skills

孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorders，ASD）是一種神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，其核心癥狀分為狹隘興趣與刻板行為、社會和（或）溝通障礙兩大類[1]。ASD起病于兒童發(fā)育早期，大多數(shù)ASD患兒常伴有身心發(fā)育不全、智力發(fā)育低下等問題，是導致我國兒童精神殘疾的首要因素[2]。據(jù)流行病學調(diào)查顯示，美國8歲年齡段兒童中ASD的總體患病率已達13.1‰～31.4‰[3]，在我國ASD患病率約為1%[4]。ASD患病率呈上升趨勢，給家庭、社會帶來沉重的負擔[5]。目前，ASD臨床無特效治療藥物，在諸多治療手段中，以教育康復(fù)方法應(yīng)用最為廣泛。但大部分患兒效果仍不滿意，因此，探索有益的治療方法對ASD患兒預(yù)后具有重要意義。

中醫(yī)學認為，脾為后天之本，ASD兒童先天稟賦不足，而飲食偏嗜，則加劇脾胃虛弱，不能化氣血上奉于心，致心血不足，心神失養(yǎng)，出現(xiàn)行為異常[6]。劉氏小兒推拿是由我國知名中醫(yī)推拿專家劉開運所創(chuàng)立的推拿體系，用于治療小兒腦病，目前廣泛運用于臨床，現(xiàn)已在湖南省20多個地市級基地進行全面推廣應(yīng)用。劉氏小兒推拿學術(shù)流派具有自身創(chuàng)立的一套疾病分類與治療原則，首創(chuàng)“五經(jīng)”治法，包括“小五經(jīng)”和“大五經(jīng)”[7]?！靶∥褰?jīng)”是指5個施術(shù)部位，為兒童手部十指螺紋面上的相應(yīng)穴位區(qū)域——脾、肝、心、肺、腎;“大五經(jīng)”是按照五臟命名的疾病分類，即“脾經(jīng)”病、“肝經(jīng)”病、“心經(jīng)”病、“肺經(jīng)”病和“腎經(jīng)”病。本研究主要通過觀察ASD核心癥狀的改善情況來評價劉氏小兒推拿“運脾調(diào)神”配合康復(fù)訓練的臨床干預(yù)療效，比較其與常規(guī)推拿配合康復(fù)訓練之間的療效差異，明確其干預(yù)ASD的優(yōu)效性。

1 資料與方法

1.1" 一般資料

2024年1月至2024年6月，在征得患兒監(jiān)護人同意并簽署知情同意書的基礎(chǔ)上，募集來源于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院兒童康復(fù)專科及長沙市民生項目（0～6歲孤獨癥減免篩查）的ASD患兒。文獻研究表明[8-10]，本病的發(fā)病率約為1%，推拿干預(yù)平均有效率為93.33%，常規(guī)治療組平均有效率為73.33%。取α=0.05，β=0.10，（μ1-α）/2=1.96，檢驗效能為90%。由等效或優(yōu)效性試驗樣本量計算公式進行計算，估算出每組例數(shù)應(yīng)為26例。按照最大脫落率為20%估算，再增加20%樣本量，即每組入組32人，最終應(yīng)納入64例。本研究共納入患者64例，試驗過程中脫落4例，最終入組60例（觀察組30例，對照組30例）。觀察組男22例、女8例，年齡（3.41±0.62）歲，病程（1.26±0.34）年;對照組男23例、女7例，年齡（3.27±0.48）歲，病程（1.14±0.88）年。兩組性別、年齡、病程比較，差異均無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05），具有可比性。本研究通過湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理審查委員會批準（倫理審查編號：HN-LL-KY-2024-003-01）。

1.2" 診斷標準

1.2.1" 西醫(yī)診斷標準" 采用第5版《美國精神病診斷統(tǒng)計手冊》[11]中制定的ASD診斷標準：（1）不同環(huán)境下表現(xiàn)出社交與溝通障礙;（2）重復(fù)且局限的活動、興趣或行為;（3）在發(fā)育早期出現(xiàn)癥狀;（4）社交、溝通缺陷以及刻板重復(fù)的行為導致社交、職業(yè)等方面的障礙;（5）智力發(fā)育障礙或整體發(fā)育遲緩不能較好解釋這些癥狀。若滿足上述標準可確診ASD，其中，（1）（2）為ASD的核心癥狀。

1.2.2" 中醫(yī)診斷標準" 中醫(yī)診斷標準參照《兒童孤獨癥譜系障礙中西醫(yī)結(jié)合干預(yù)專家共識》[12]的臨床表現(xiàn)：少語或不語，刻板動作，行為孤僻，舉止失常，對指令充耳不聞，不易管教。

1.3" 納入標準

（1）符合ASD西醫(yī)、中醫(yī)診斷標準;（2）性別不限，年齡3～8周歲;（3）患兒的監(jiān)護人配合度較高且對臨床干預(yù)方法知情，能配合患兒完成全部治療周期;（4）患兒在近30 d內(nèi)沒有采用其他干預(yù)方式和參加過其他臨床觀察;（5）患兒監(jiān)護人同意自愿加入本研究，并在知情同意書上簽字。

1.4" 排除標準

（1）合并其他兒童精神類疾病;（2）重度聽力障礙及視力障礙;（3）合并嚴重心、肺、腎等重要臟器器質(zhì)性疾病。

1.5" 剔除、脫落及終止試驗標準

（1）依從性差、未按規(guī)定治療或資料不全者;（2）治療過程中產(chǎn)生嚴重的不良事件，不能或不宜繼續(xù)堅持治療的患兒;（3）療程中自行退出者;（4）在治療過程中使用其他治療方法，或自行中途更換治療方法者。

1.6" 干預(yù)方法

1.6.1" 觀察組" 采取劉氏小兒推拿結(jié)合康復(fù)訓練。

劉氏小兒推拿：（1）開竅手法。開天門（雙手拇指交替直推天門）24次，推坎宮（雙手拇指同時由內(nèi)向外分推坎宮）24次，推太陽（雙手拇指同時由太陽推至耳門穴）24次，手按總筋（右手拇指快速點按總筋）24次，分陰陽（雙手拇指同時分推總筋兩旁）24次。（2）推五經(jīng)。補脾經(jīng)300次，補心經(jīng)200次，補心經(jīng)后加清心經(jīng)100次，補肺經(jīng)150次，清肝經(jīng)100次，補腎經(jīng)200次。推五經(jīng)穴按照左手拇、食指和余指夾持患兒左手，右手食指、中指和環(huán)指固定穴位，以拇指向指根推為清，以旋推為補。（3）頭部腧穴。揉百會穴、四神聰、神庭各100次，揉風池穴、天柱穴各50次。（4）脾胃配穴。運水入土（沿小天心、掌小橫紋推運至小指指根止，呈單方向反復(fù)推運）80次，揉板門30次，掐四橫紋10次，中脘逆時針按揉50次，按揉脾俞、胃俞各50次，捏脊3遍。（5）關(guān)竅：拿肩井5次。連續(xù)治療5 d，休息2 d，共治療12周。

康復(fù)訓練：以第3版孤獨癥心理教育評定量表（psychological educational profile-3， PEP-3）[13]評估患兒的心理狀況后，依據(jù)患兒的具體情況進行康復(fù)干預(yù)，并在早期對其進行語言認知訓練、行為分析療法訓練及社交游戲訓練，其中合并有感覺統(tǒng)合失調(diào)的患兒，實施感覺統(tǒng)合治療。一對一執(zhí)行康復(fù)訓練，綜合評估患兒的能力，若能力提高可以為患兒安排集體的文化課程和結(jié)構(gòu)化的教育課程?？祻?fù)訓練治療頻次為每周6 d，每天至少4 h（包括康復(fù)治療師一對一的訓練，以及在康復(fù)治療師培訓指導下由家長實施的訓練的兩者總時長）。共治療12周。

1.6.2" 對照組" 采取常規(guī)推拿結(jié)合康復(fù)訓練。開天門50次，推坎宮50次，揉太陽50次，揉耳后高骨50次，揉百會穴、四神聰、神庭各100次，揉風池穴、天柱穴各50次。連續(xù)治療5 d，休息2 d，共治療12周?？祻?fù)訓練方法及療程同觀察組。

1.7" 觀察指標

1.7.1" 兒童孤獨癥評定量表（childhood autism rating scale， CARS）[14]" 該量表從15個主要方面對孤獨癥兒童進行評估。量表滿分為60分，總得分gt;36分為重度孤獨癥;得分30～36分為輕至中度孤獨癥;得分lt;30分為非孤獨癥。

1.7.2" PEP-3評分[15]" 包含語言表達、語言理解、認知、模仿等10個方面，測評分數(shù)越高提示其能力發(fā)展越好。

1.7.3" 中醫(yī)脾胃疾病癥狀評估表" 參考《脾胃病癥狀量化標準專家共識意見（2017）》和丑易倩[16-17]的評分表，共有14個條目，包含反酸、嘔吐、納差、善食易饑、呃逆、腹痛、腹脹、腹瀉、大便失禁、便密、口臭、失眠、四肢無力、消瘦，每個條目計0～3分。0分為無該癥狀;3分為程度最高。評分越高代表其癥狀程度越重。

1.7.4" 代謝組學檢測" 兩組患者于治療完成當天采血。標本保持4 ℃存放，在15～30 min內(nèi)離心15 min（2 000×g），取血漿置于-80 ℃冰箱中保存，用于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜非靶標代謝組學檢測。使用乙腈和甲醇的混合溶劑對血漿樣本中的代謝物進行提取。將提取后的樣品經(jīng)過濃縮和重溶、去雜質(zhì)等處理后，注入超高效液相色譜系統(tǒng)，使用C18色譜柱進行分離。以0.1%甲酸水溶液和乙腈作為流動相，按梯度洗脫條件分離代謝物。隨后連接質(zhì)譜儀，進行一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。通過ProteoWizard3.0軟件將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為mzXML格式，再使用R程序包進行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理。通過與BiotreeDB 2.1自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配進行物質(zhì)注釋，Cutoff值設(shè)為0.3。鑒定出的兩組顯著差異代謝物映射到KEGG數(shù)據(jù)庫，獲取其對應(yīng)富集的生物通路。

1.7.5" 腸道微生物檢測" 用專用無菌糞便采集盒搜集糞便，采集約5 g糞便。樣本采集后，按照50 μL/g樣本的比例添加濃度為100 mg/mL的疊氮化鈉，混勻后分裝樣本至200 mg/管。然后立即用液氮速凍處理30 s以上，保存至-80 ℃冰箱，足量干冰低溫運送。使用CTAB從不同的樣本中提取16S rDNA，采用Illumina Miseq測序平臺對V3～V4可變區(qū)進行擴增和測序，并利用線性判別分析效應(yīng)大?。╨inear discriminant analysis effect size，LEfSe）和R軟件進行表達和分析。

1.7.6" 腸道菌群與代謝組學檢測nbsp; 采用Spearman進行血漿代謝產(chǎn)物相關(guān)性分析，選取差異腸道菌群與差異代謝物聯(lián)合分析，整合腸道微生物群和代謝組學數(shù)據(jù)，分析其相關(guān)性。

1.8" 療效評價標準

參考相關(guān)文獻制定評價標準[18]，CARS評分越低說明社交障礙改善越明顯。顯效：CARS評分總分較治療前降低至少5分;有效：總分較治療前降低1～5分;無效：總分較治療前降低lt;1分?？傆行蕿橛行c顯效之和。

1.9" 統(tǒng)計學方法

釆用統(tǒng)計學軟件SPSS 22.0分析實驗數(shù)據(jù)。計量資料以“x±s”表示，兩組比較，若資料滿足正態(tài)性和方差齊性采用t檢驗，否則采用Wilcoxon秩和檢驗;計數(shù)資料以“例（%）”表示，采用卡方檢驗;等級資料采用Wilcoxon Mann-Whitney U檢驗。以Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1" "兩組患兒臨床療效比較

觀察組總有效率（96.67%）高于對照組（73.33%）（Plt;0.05）。詳見表1。

2.2" 兩組患兒PEP-3評分比較

治療前，兩組PEP-3評分比較，差異均無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。與治療前比較，兩組治療后PEP-3評分均升高（Plt;0.01），且觀察組評分高于對照組（Plt;0.01）。詳見表2。

2.3" 兩組患兒中醫(yī)脾胃疾病癥狀量表評分比較

治療前，兩組中醫(yī)脾胃疾病癥狀量表評分比較，差異均無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。與治療前比較，治療后，觀察組中醫(yī)脾胃疾病癥狀量表評分降低（Plt;0.01），且低于對照組（Plt;0.01）;對照組中醫(yī)脾胃疾病癥狀量表評分差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。詳見表3。

2.4" 兩組患兒腸道菌群比較

2.4.1" 測序結(jié)果的豐富度與α多樣性分析" 本研究基于擴增子序列變體（amplicon sequence variant， ASV）聚類分析結(jié)果，共獲得7 618個ASV，Chao1指數(shù)曲線趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大。實驗曲線的趨勢較為平緩，提示測序數(shù)據(jù)量接近合理，樣品具有較好的豐富度。詳見圖1。

2.4.2" β多樣性分析" 非度量多維尺度分析（non-metric multidimensional scaling， NMDS）結(jié)果提示，兩組有顯著差異（stress=0.15）。詳見圖2。

2.4.3" 兩組腸道菌群在門、屬水平上的差異" 與對照組比較，觀察組的腸道菌群在門水平上，放線菌門（Actinobacteriota）水平上調(diào)，厚壁菌門（Firmicutes）水平下調(diào);在屬水平上，雙歧桿菌（Bifdobactenum）相對豐度上調(diào)，埃氏菌屬-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）相對豐度下調(diào)。詳見圖3—4。

2.4.4" LEfSe差異分析" 通過LEfse分析發(fā)現(xiàn)，兩組在門、綱、目、科、屬水平上共篩選出9種具有差異的物種（Plt;0.05且LAD分數(shù)gt;4）。結(jié)果顯示，對照組中假單胞菌目（o__Pseudomonadales）、假單胞菌科（f_Pseudomonadaceae）、假單胞菌屬（g_Pseudomonas）、普通擬桿菌（s_bacteroidesplebeius）富集;觀察組中放線菌門（p__Actinobacteriota）、放線菌綱（c__Actinobacteria）、雙歧桿菌目（o__Bifidobacteriales）、雙歧桿菌科（f__Bifidobacteriaceae）、雙歧桿菌屬（g__Bifidobacterium）富集。詳見圖5。

2.5" 兩組代謝組學分析

2.5.1" 兩組樣本間的OPLS-DA分析" 將質(zhì)譜采集的數(shù)據(jù)信息導入R軟件，進行多元數(shù)據(jù)處理，包括主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）。兩組的代謝組學數(shù)據(jù)具有高維（檢測出代謝物種類多）、小樣本（檢測樣本量偏少）的特性。為了可視化組分離和發(fā)現(xiàn)顯著變化的代謝物，采用OPLS-DA的統(tǒng)計方法對結(jié)果進行分析。經(jīng)置換檢驗，回歸線呈向上趨勢，說明不存在過擬合趨勢，證實模型穩(wěn)定可靠。詳見圖6。

2.5.2" 兩組血漿差異性代謝物分析" 基于OPLS-DA對在正、負離子模式下檢測到的所有代謝物進行差異分析，篩選差異代謝物需要同時滿足VIPgt;2.5、Plt;0.05兩個條件。通過KEGG、HMDB等數(shù)據(jù)庫，最后篩選出6個差異代謝物，包含正離子模式下4個和負離子模式下2個。在正離子模式下，與對照組比較，觀察組的甘氨酸、前列腺素E2、甲狀腺素上調(diào)，L-組氨酸下調(diào)（Plt;0.05）;在負離子模式下，與對照組比較，觀察組的環(huán)甘氨酰脯氨酸上調(diào)，L-絲氨酸下調(diào)（Plt;0.05）。詳見表4。

2.5.3" 兩組差異代謝物的相關(guān)通路分析" KEGG通路分析結(jié)果表明，差異代謝物主要與氨酰tRNA生物合成、氨基酸代謝、蛋白質(zhì)消化與吸收等通路相關(guān)。詳見圖7。

2.6" 腸道菌群與代謝組學關(guān)聯(lián)分析

兩組腸道菌群與代謝組學關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，甘氨酸水平與雙歧桿菌、糞桿菌呈正相關(guān)，與埃氏菌屬-志賀菌屬呈負相關(guān);組氨酸水平與埃氏菌屬-志賀菌屬呈正相關(guān)，與雙歧桿菌呈負相關(guān);環(huán)甘氨酰脯氨酸水平與埃氏菌屬-志賀菌屬呈負相關(guān)。詳見圖8。

3 討論

目前，西醫(yī)認為“菌-腸-腦軸”可能在ASD的發(fā)病過程中起重要作用。因此，本研究主要目標為探討劉氏小兒推拿治療ASD兒童的療效及對腸道菌群、代謝組學的影響。劉氏小兒推拿運用大五經(jīng)與小五經(jīng)的理論，針對心脾兩虛證制定推五經(jīng)方案，包括補脾經(jīng)、補心經(jīng)、補肺經(jīng)、補腎經(jīng)、清肝經(jīng)和清心經(jīng)。補脾經(jīng)和心經(jīng)旨在健脾益氣、養(yǎng)心安神，結(jié)合小兒“肺常不足”“腎常虛”的生理特性，兼補肺、腎以益脾氣、溫脾陽、健脾運;針對小兒“心常有余”，在補心經(jīng)后加用清法，以防引動心火，并清肝經(jīng)以防肝風內(nèi)動。本研究中，兩組均進行康復(fù)訓練，觀察組采用劉氏小兒推拿進行干預(yù)，對照組采用常規(guī)推拿，治療12周后，觀察組的總有效率顯著高于對照組，提示劉氏小兒推拿配合康復(fù)訓練對ASD具有明顯的臨床療效，能有效改善孤獨癥的核心癥狀。

為探討劉氏小兒推拿對腸道菌群的影響，本研究采用16S rDNA測序方法進行分析。結(jié)果顯示，觀察組在門水平上，放線菌門豐度上調(diào)，厚壁菌門豐度下調(diào);在屬水平上，雙歧桿菌相對豐度上調(diào)，埃氏菌屬-志賀菌屬相對豐度下調(diào)。利用LEfSe進一步分析，發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌等益生菌相對豐度上調(diào)，假單胞菌等有害細菌相對豐度下調(diào)，從而改善腸道菌群。既往研究表明，厚壁菌門的豐度與ASD的嚴重程度相關(guān)[19];ASD患者的雙歧桿菌水平顯著減少[20]。在ASD模型小鼠中，補充雙歧桿菌可改善社交行為、增強腸道屏障功能、降低血清中的炎癥因子和內(nèi)毒素水平[21]。埃氏菌屬-志賀菌屬近年來在ASD研究中備受關(guān)注，研究表明ASD患者中其豐度增加[22]。本研究結(jié)果表明，劉氏小兒推拿能夠調(diào)節(jié)腸道微生物群，增加有益細菌雙歧桿菌等的相對豐度，降低埃氏菌屬-志賀菌屬等有害細菌的相對豐度。

代謝組學結(jié)果顯示，觀察組相比對照組篩選出6個差異代謝物：環(huán)甘氨酰脯氨酸、甘氨酸、前列腺素E2、甲狀腺素水平上調(diào)，L-組氨酸、L-絲氨酸水平下調(diào)。研究表明，環(huán)甘氨酰脯氨酸可提高血清中新生兒胰島素樣生長因子-1水平，從而改善ASD癥狀[23];甘氨酸可能通過影響谷氨酸水平而改善ASD癥狀[24];妊娠期低甲狀腺素水平在兩性小鼠后代中誘導ASD樣表型，包括行為異常、促炎標志物和谷氨酸能蛋白表達改變[25];前列腺素E2水平與ASD嚴重程度呈負相關(guān)[26];組氨酸水平差異與ASD發(fā)病相關(guān)，可能與線粒體功能障礙和脂肪酸代謝變化有關(guān)[25]。結(jié)合本研究篩選的差異代謝物，提示劉氏小兒推拿治療ASD可能通過調(diào)控多個代謝物共同發(fā)揮作用。

結(jié)合腸道菌群與代謝組學Spearman相關(guān)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)甘氨酸水平與雙歧桿菌、糞桿菌呈正相關(guān)，與埃氏菌屬-志賀菌屬呈負相關(guān);組氨酸水平與埃氏菌屬-志賀菌屬呈正相關(guān)，與雙歧桿菌呈負相關(guān);環(huán)甘氨酰脯氨酸水平與埃氏菌屬-志賀菌屬呈負相關(guān)。將腸道菌群和代謝組學數(shù)據(jù)進行綜合，結(jié)果表明劉氏小兒推拿可以明顯改變ASD血漿代謝產(chǎn)物和腸道菌群組成結(jié)構(gòu)，同時腸道菌群的改變與部分血漿代謝物的變化明顯相關(guān)，提示劉氏小兒推拿既能改變腸道菌群組成結(jié)構(gòu)，又對代謝表型產(chǎn)生影響，這些代謝產(chǎn)物可能是腸道菌群作用于ASD的重要物質(zhì)。最后基于KEGG分析差異代謝物，篩選潛在的關(guān)鍵代謝通路，表明差異代謝物與氨基酸代謝、蛋白質(zhì)消化與吸收、氨酰tRNA生物合成等通路相關(guān)。

綜上所述，ASD是當前兒童精神疾病中的高發(fā)疾病，尚無特效的西醫(yī)治療方法。近年來研究發(fā)現(xiàn)，ASD的發(fā)病與腸道微生物密切相關(guān)[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)，劉氏小兒推拿可改善ASD兒童的核心癥狀，并通過腸道菌群及代謝組學聯(lián)合分析，揭示其作用機制可能為調(diào)節(jié)ASD兒童的腸道菌群及其代謝產(chǎn)物，進而影響氨基酸代謝、蛋白質(zhì)消化與吸收、氨酰tRNA生物合成等關(guān)鍵通路。本研究為劉氏小兒推拿干預(yù)ASD的作用提供了客觀依據(jù)，在當前ASD缺乏特效治療方法的情況下，劉氏小兒推拿具有潛在的治療優(yōu)勢。然而，本研究樣本量偏小，具體機制尚需進一步研究。未來可通過多中心研究和深入探討信號通路，進一步驗證劉氏小兒推拿在ASD治療中的作用機制。

參考文獻

[1] 鄒小兵， 鄧紅珠. 美國精神疾病診斷分類手冊“孤獨癥譜系障礙診斷標準”解讀[J]. 中國實用兒科雜志， 2013， 28（8）： 561-563.

[2] 周豪欽， 陳艷妮， 郭鳳宜， 等. 孤獨癥譜系障礙綜合治療模式介紹及解讀建議[J]. 中國實用兒科雜志， 2021， 36（4）： 266-274.

[3] SHAW K A， MAENNER M J， BAIO J， et al. Early identification of autism spectrum disorder among children aged 4 years-early autism and developmental disabilities monitoring network， six sites， United States， 2016[J]. Morbidity and Mortality Weekly Report Surveillance Summaries， 2020， 69（3）： 1-11.

[4] SUN X， ALLISON C， WEI L P， et al. Autism prevalence in China is comparable to Western prevalence[J]. Molecular Autism， 2019， 10： 7.

[5] 占" 紅， 白淑霞， 王金堂. 兒童孤獨癥譜系障礙發(fā)病機制的研究進展[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合兒科學， 2021， 13（2）： 112-116.

[6] 陳" 霄， 嚴雋陶， 尹" 露. 重復(fù)經(jīng)顱磁刺激在孤獨癥譜系障礙中的應(yīng)用進展[J]. 中國醫(yī)學物理學雜志， 2021， 38（5）： 643-646.

[7] 梁枝懿. 脾虛體質(zhì)兒童的尿液代謝組學特征及劉氏小兒推拿對其影響的研究[D]. 長沙： 湖南中醫(yī)藥大學， 2023.

[8] 宓寶來. 振腹推拿干預(yù)孤獨癥兒童臨床療效觀察及腸道菌群變化[D]. 北京： 北京中醫(yī)藥大學， 2021.

[9] 劉安南， 姜志梅， 公" 超. 孤獨癥譜系障礙推拿治療研究進展[J]. 按摩與康復(fù)醫(yī)學， 2023， 14（7）： 70-74.

[10] 王" 靜， 劉" 蕓， 黃浩宇， 等. 推拿療法對孤獨癥譜系障礙兒童核心癥狀及胃腸道疾病癥狀的影響[J]. 教育生物學雜志， 2023， 11（3）： 207-211， 217.

[11] CHRSTIANSZ J A， GRAY K M， TAFFE J， et al. Autism spectrum disorder in the DSM-5： Diagnostic sensitivity and specificity in early childhood[J]. Journal of Autism and Developmental Disorders， 2016， 46： 2054-2063.

[12] 湖南省中醫(yī)藥和中西醫(yī)結(jié)合學會兒科專業(yè)委員會. 兒童孤獨癥譜系障礙中西醫(yī)結(jié)合干預(yù)專家共識[J]. 湖南中醫(yī)藥大學學報， 2024， 44（2）： 169-175.

[13] FAILLA C， SCARCELLA I， VETRANO N， et al. Autism， intelligence， language， and adaptive behavior， disentangling a complex relationship[J]. Frontiers in Psychiatry， 2024， 15： 1411783.

[14] HUANG C Y， CHEN K S， LEE K Y， et al. Different autism measures targeting different severity levels in children with autism spectrum disorder[J]. European Archives of Psychiatry and Clinical Neuroscience， 2024， 274（1）： 27-33.

[15] HU C Q， YANG T， CHEN J， et al. Phenotypic characteristics and rehabilitation effect of children with regressive autism spectrum disorder： A prospective cohort study[J]. BMC Psychiatry， 2024， 24（1）： 514.

[16] 中華中醫(yī)藥學會脾胃病分會. 脾胃病癥狀量化標準專家共識意見（2017）[J]. 中華中醫(yī)藥雜志， 2017， 32（8）： 3590-3596.

[17] 丑易倩. 基于菌腸腦軸探討以脾為核心辨治孤獨癥譜系障礙的療效及機制研究[D]. 北京： 北京中醫(yī)藥大學， 2020.

[18] STEVANOVIC D， COSTANZO F， FUCà E， et al. Measurement invariance of the Childhood Autism Rating Scale （CARS） across six countries[J]. Autism Research， 2021， 14（12）： 2544-2554.

[19] DE THEIJE C G， WOPEREIS H， RAMADAN M， et al. Altered gut microbiota and activity in a murine model of autism spectrum disorders[J]. Brain， Behavior， and Immunity， 2014， 37： 197-206.

[20] STRATI F， CAVALIERI D， ALBANESE D， et al. New evidences on the altered gut microbiota in autism spectrum disorders[J]. Microbiome， 2017， 5（1）： 24.

[21] HSIAO E Y， MCBRIDE S W， HSIEN S， et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders[J]. Cell， 2013， 155（7）： 1451-1463.

[22] STRATI F， CAVALIERI D， ALBANESE D， et al. New evidences on the altered gut microbiota in autism spectrum disorders[J]. Microbiome， 2017， 5（1）： 24.

[23] STEINMAN G， MANKUTA D. The role of oligopeptides in preventing autism[J]. Medical Hypotheses， 2020， 138： 109604.

[24] COLLINGRIDGE G L， VOLIANSKIS A， BANNISTER N， et al. The NMDA receptor as a target for cognitive enhancement[J]. Neuropharmacology， 2013， 64： 13-26.

[25] GONZáLEZ-MADRID E， RANGEL-RAMíREZ M A， OPAZO M C， et al. Gestational hypothyroxinemia induces ASD-like phenotypes in behavior， proinflammatory markers， and glutamatergic protein expression in mouse offspring of both sexes[J]. Frontiers in Endocrinology， 2024， 15： 1381180.

[26] LIU X， SUN X， GUO C， et al. Untargeted urine metabolomics and machine learning provide potential metabolic signatures in children with autism spectrum disorder[J]. Frontiers in Psychiatry， 2024， 15： 1261617.

[27] NICKEL K， MENKE M， ENDRES D， et al. Altered markers of mitochondrial function in adults with autism spectrum disorder[J]. Autism Research， 2023， 16（11）： 2125-2138.

[28] LI H， GUO W， LI S， et al. Alteration of the gut microbiota profile in children with autism spectrum disorder in China[J]. Frontiers in Microbiology， 2024， 14： 1326870.

〔收稿日期〕2024-07-15

〔基金項目〕湖南省中醫(yī)藥科研計劃重點項目（A2023036）;湖南省衛(wèi)生健康委員會科研課題（202206010043）;湖南省衛(wèi)生健康委員會科研計劃項目（D202306048765）;湖南省中醫(yī)藥科研課題（B2023121）。

〔通信作者〕*胡國恒，男，博士，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導師，E-mail：hugh9198@163.com。