王 莉,孔凡娜,茅云翔,楊 惠

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266003)

壇紫菜配子體離體細(xì)胞發(fā)育研究*

王 莉,孔凡娜,茅云翔**,楊 惠

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266003)

本文以壇紫菜(Porphyra haitanensis Chang et Zheng)雌雄配子體為材料,酶解得到單細(xì)胞并再生培養(yǎng),研究雌雄配子體體細(xì)胞發(fā)育途徑以及不同部位(根絲段、基部、中部、頂部、成熟區(qū))單細(xì)胞發(fā)育途徑。結(jié)果表明,壇紫菜雌雄配子體體細(xì)胞發(fā)育途徑大致相同,但存在一定差異,表現(xiàn)為雌性配子體體細(xì)胞發(fā)育成果孢子囊,少數(shù)體細(xì)胞直接發(fā)育成類(lèi)孢子囊枝;而雄性配子體體細(xì)胞發(fā)育成精子囊,并能釋放精子,極少數(shù)體細(xì)胞發(fā)育成類(lèi)果孢子囊。單細(xì)胞再生研究顯示,配子體體細(xì)胞發(fā)育方向受細(xì)胞所處部位影響,不同部位體細(xì)胞由于其分化程度不同,發(fā)育成不同類(lèi)型的再生體。隨著細(xì)胞所在藻體部位的上移,正常葉狀體和根絲細(xì)胞葉狀體比例均下降,畸形葉狀體的比例下降或無(wú)明顯差異,絲狀體的比例逐漸增加。

壇紫菜;雌雄配子體;單細(xì)胞;發(fā)育分化

壇紫菜(Porphyra haitanensis Chang et Zheng)是我國(guó)特有的大型經(jīng)濟(jì)海藻,在福建、浙江、廣東北部沿海被大規(guī)模栽培,經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益顯著。壇紫菜生活史為異型世代交替類(lèi)型,由大型配子體(葉狀體)世代和微型孢子體(絲狀體)世代構(gòu)成的;絕大多數(shù)配子體個(gè)體是雌雄異體,少數(shù)為雌雄同體[1]。雌雄配子體成熟后分別產(chǎn)生果胞和精子,通過(guò)有性生殖產(chǎn)生果孢子,果孢子萌發(fā)成為孢子體;孢子體成熟后釋放出殼孢子,經(jīng)減數(shù)分裂發(fā)育成配子體[1]。一般認(rèn)為,殼孢子在萌發(fā)時(shí)進(jìn)行減數(shù)分裂[2],而且分裂形成的細(xì)胞不分離,因此其配子體不同部位細(xì)胞基因型存在差異,為遺傳學(xué)上的嵌合體。開(kāi)展壇紫菜雌雄配子體不同部位細(xì)胞發(fā)育分化差異研究,不僅對(duì)進(jìn)一步闡明海藻生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞分化理論有重要意義,而且為開(kāi)展壇紫菜遺傳學(xué)研究提供重要參考。通過(guò)分離紫菜配子體細(xì)胞在離體條件下培養(yǎng),觀察再生體的形態(tài)結(jié)構(gòu)、發(fā)育形式以及趨勢(shì)是研究紫菜配子體細(xì)胞發(fā)育分化途經(jīng)的有效方法之一。由單個(gè)細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的再生體,無(wú)論是配子體還是孢子體都具有純合性高、可穩(wěn)定遺傳的特性,因此酶解單細(xì)胞獲得純系材料可為壇紫菜的雜交育種工作提供優(yōu)質(zhì)的親本材料。

關(guān)于紫菜配子體體細(xì)胞或原生質(zhì)體發(fā)育和分化的研究,國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道[3-7]。趙煥登等[8]用研磨法分離出條斑紫菜(P.yezoensis Ueda)的配子體體細(xì)胞,經(jīng)培養(yǎng)獲得新的葉狀體,證明了紫菜細(xì)胞發(fā)育的全能性。唐延林[9]用海螺酶分離出圓紫菜(P.suborbicu lata Kjellm)配子體體細(xì)胞和原生質(zhì)體,并進(jìn)一步培養(yǎng)成正常的葉狀體。Waaland等[10]分離出P.nereocystis Anderson原生質(zhì)體,發(fā)現(xiàn)其再生形成絲狀體、愈傷組織以及在愈傷組織邊緣萌發(fā)形成葉狀體。曾慶國(guó)[7]利用酶法分離壇紫菜葉狀體單細(xì)胞發(fā)現(xiàn)有3種不同的發(fā)育途徑,并探討了單細(xì)胞發(fā)育成絲狀體的情況。嚴(yán)興洪等[11]系統(tǒng)地研究了壇紫菜雌雄配子體的細(xì)胞發(fā)育分化過(guò)程,發(fā)現(xiàn)雌雄配子體體細(xì)胞再生體中,均出現(xiàn)9種不同發(fā)育類(lèi)型,再生體發(fā)育類(lèi)型的數(shù)目和比例與種藻日齡密切相關(guān)。但上述研究未對(duì)壇紫菜單性配子體不同部位的細(xì)胞發(fā)育分化途徑差異進(jìn)行深入的探討。本文以實(shí)驗(yàn)室單株隔離培養(yǎng)的壇紫菜雌雄配子體為材料,通過(guò)酶解法獲得不同部位的單細(xì)胞進(jìn)行再生培養(yǎng),研究壇紫菜雌雄配子體的細(xì)胞發(fā)育分化異同點(diǎn),以及配子體單細(xì)胞發(fā)育分化與細(xì)胞所在部位的關(guān)系,在細(xì)胞水平上為壇紫菜遺傳育種研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

壇紫菜為本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的品系,株名為AGB-PHFD-1。利用貝殼絲狀體采集殼孢子以及室內(nèi)配子體培養(yǎng)方法同文獻(xiàn)[2],其配子體長(zhǎng)到1～2 cm后分別在相同條件下單獨(dú)隔離培養(yǎng),培養(yǎng)到成熟后陰干保存于中。實(shí)驗(yàn)前挑選藻體體長(zhǎng)15 cm以上的雌性和雄性配子體各10株,分別復(fù)蘇培養(yǎng)3 d進(jìn)行酶解。

1.2 配子體的單細(xì)胞分離和再生培養(yǎng)

分離細(xì)胞所用的工具酶是粒嶸螺(Turbocoronatus granulatus Gmelin)粗酶液,酶解方法參照[12]略作修改。取一定數(shù)目的細(xì)胞于培養(yǎng)皿中,加入M ES培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度20℃,光照密度前期為5μmol·m-2·s-1,光周期12L∶12D。培養(yǎng)1周后,將光照密度提高到20μmol·m-2·s-1,其余條件不變。每周更換1次培養(yǎng)液。

1.3 配子體不同部位單細(xì)胞再生植株培養(yǎng)

從藻體的固著器向上依次劃分成5個(gè)區(qū)段,即根絲段(0～1 cm)、基部(1～4 cm)、中部(4～7 cm)、頂部(7～10 cm)、成熟區(qū)(10～15 cm),剪取5個(gè)區(qū)段分別進(jìn)行酶解獲得單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)方法和條件同上。

2 結(jié)果

2.1 雌配子體離體細(xì)胞發(fā)育分化類(lèi)型

根據(jù)配子體單細(xì)胞再生植株的形態(tài)、細(xì)胞排列形式和大小、細(xì)胞色素體的形態(tài)、有無(wú)假根、發(fā)育分化趨勢(shì),壇紫菜雌配子體體細(xì)胞發(fā)育分化可分為以下6種類(lèi)型:

第一種類(lèi)型是發(fā)育成葉狀體

Ⅰ.形態(tài)正常葉狀體。單細(xì)胞經(jīng)第1次極性分裂產(chǎn)生2個(gè)極性細(xì)胞(見(jiàn)圖1-1),然后進(jìn)行第2次分裂形成線性四分子(見(jiàn)圖1-2),其中位于基部的細(xì)胞色素體較小而液泡較大,并逐漸伸長(zhǎng)長(zhǎng)成假根;另一細(xì)胞經(jīng)過(guò)幾次橫分裂形成單列細(xì)胞組成的葉狀體,再經(jīng)過(guò)縱分裂發(fā)育成多列細(xì)胞組成的正常葉狀體小苗(見(jiàn)圖1-3)。葉狀體多數(shù)為紅褐色,細(xì)胞大小一致且排列規(guī)則,葉片邊緣光滑,細(xì)胞色素體呈現(xiàn)星狀,具有較粗壯的透明狀假根且附著牢固。這種發(fā)育方式類(lèi)似于殼孢子發(fā)育。

Ⅱ.具假根的畸形葉狀體。其葉狀體形狀不同于正常葉狀體,細(xì)胞大小不一致且排列不規(guī)則,葉片邊緣光滑或不光滑,具有單根或多根粗壯且內(nèi)含色素的類(lèi)假根或假根(見(jiàn)圖1-4和圖1-5),附著不牢固,生長(zhǎng)一段時(shí)間后多數(shù)脫落漂浮生長(zhǎng),長(zhǎng)到一定大小時(shí)整個(gè)葉片邊緣卷曲。

Ⅲ.不具假根的畸形葉狀體(見(jiàn)圖1-6)。單細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次分裂后發(fā)育成無(wú)假根的畸形葉狀體,細(xì)胞大小不一致且排列不均勻,少部分細(xì)胞色素體呈現(xiàn)黃綠色,葉片形狀不規(guī)則但邊緣較光滑,均漂浮于水中。此類(lèi)型的葉狀體較難長(zhǎng)成大的葉狀體,部分葉片在生長(zhǎng)后期逐漸死亡。

第二種類(lèi)型是發(fā)育成細(xì)胞團(tuán)

Ⅰ.紅色細(xì)胞團(tuán)(見(jiàn)圖1-7),細(xì)胞團(tuán)內(nèi)的細(xì)胞大小不一致,排列無(wú)序呈堆積狀,色素體為紅褐色且呈彌散狀,外緣細(xì)胞突起。其發(fā)育趨勢(shì)是部分細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞繼續(xù)分裂形成畸形葉狀體;少數(shù)細(xì)胞團(tuán)其中一端的細(xì)胞直接萌發(fā)長(zhǎng)出細(xì)長(zhǎng)的絲狀體,另一端少數(shù)細(xì)胞由紅褐色變?yōu)辄S綠色(見(jiàn)圖1-8),其余細(xì)胞團(tuán)逐漸變白死亡。

Ⅱ.黃綠色細(xì)胞團(tuán)(見(jiàn)圖1-9),細(xì)胞比正常葉狀體細(xì)胞稍大,多為卵圓形,色素體為黃褐色且呈彌散狀。多數(shù)細(xì)胞團(tuán)繼續(xù)分裂形成畸形葉狀體;少數(shù)細(xì)胞團(tuán)在發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞色素體凝集,細(xì)胞變紅且變圓,被釋放出來(lái)的細(xì)胞萌發(fā)成絲狀體(見(jiàn)圖1-10),其中多數(shù)在萌發(fā)后不久失去色素然后死亡;其余細(xì)胞團(tuán)逐漸變得透明隨后裂解死亡。

第三種類(lèi)型是發(fā)育成果孢子囊。離體單細(xì)胞在培養(yǎng)大約1～2周開(kāi)始分裂成3～16個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán),細(xì)胞排列不規(guī)則,細(xì)胞色素體紅褐色,然后細(xì)胞全部釋放出來(lái)并以單極萌發(fā)方式形成絲狀體或直接在囊內(nèi)萌發(fā)成絲狀體(見(jiàn)圖1-11)。

第四種類(lèi)型是直接發(fā)育成絲狀體(見(jiàn)圖1-12)。培養(yǎng)一周后,單細(xì)胞變圓,色素體顏色加深并凝集成塊狀,然后從細(xì)胞邊緣多極萌發(fā)長(zhǎng)出絲狀體,長(zhǎng)到一定大小形成絲狀體藻落。

第五種類(lèi)型是發(fā)育成類(lèi)孢子囊枝(見(jiàn)圖1-13)。經(jīng)過(guò)一周的培養(yǎng),細(xì)胞色素體由最初的黃褐色轉(zhuǎn)為紅色,細(xì)胞邊緣萌發(fā)長(zhǎng)出膨大且顏色更深的藻絲,分支多,細(xì)胞之間的間隔較明顯,最終長(zhǎng)成類(lèi)孢子囊枝。

第六種類(lèi)型是發(fā)育成根絲細(xì)胞葉狀體。根絲細(xì)胞位于葉狀體的根絲段和基部,剛解離下來(lái)時(shí)多為梨形,在較細(xì)的一端具有1條根絲(見(jiàn)圖1-14)。此類(lèi)型細(xì)胞分裂較慢,培養(yǎng)大約1～2周才開(kāi)始發(fā)生分裂,經(jīng)過(guò)幾次分裂發(fā)育形成根絲細(xì)胞葉狀體(見(jiàn)圖1-15),其中最顯著的特征是假根細(xì)長(zhǎng)。葉片一般長(zhǎng)到十幾個(gè)細(xì)胞就停止生長(zhǎng)漸漸衰老死亡。

圖1 雌配子體體細(xì)胞的發(fā)育情況Fig.1 The development of somatic cells isolated from female gametophytes

圖2 雄配子體體細(xì)胞的發(fā)育情況Fig.2 The development of somatic cells isolated from male gametophytes

2.2 雄配子體離體細(xì)胞發(fā)育分化類(lèi)型

壇紫菜雄配子體體細(xì)胞的發(fā)育分化類(lèi)型與其雌配子體類(lèi)似,主要有6種發(fā)育類(lèi)型:

第一種類(lèi)型是發(fā)育成葉狀體,其中Ⅰ(見(jiàn)圖2-1)、Ⅱ(見(jiàn)圖2-2、圖2-3)、Ⅲ(見(jiàn)圖2-4)發(fā)育類(lèi)型分別與雌配子體單細(xì)胞的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ發(fā)育類(lèi)型基本相同。

第二種類(lèi)型是發(fā)育成細(xì)胞團(tuán),其中的Ⅰ、Ⅱ發(fā)育類(lèi)型分別與雌配子體單細(xì)胞的Ⅰ、Ⅱ發(fā)育類(lèi)型基本相類(lèi)似,但是發(fā)育分化趨勢(shì)不同。Ⅰ發(fā)育類(lèi)型(見(jiàn)圖2-5)多數(shù)細(xì)胞團(tuán)繼續(xù)分裂形成畸形葉狀體;少數(shù)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)一步發(fā)育成黃綠色的精子囊團(tuán)(見(jiàn)圖2-6),然后精子囊從細(xì)胞團(tuán)中游離出來(lái),大量成熟的精子從精子囊中釋放,隨后解體退化(見(jiàn)圖2-7);另有少數(shù)細(xì)胞團(tuán)中紅褐色細(xì)胞直接萌發(fā)形成細(xì)長(zhǎng)的絲狀體(見(jiàn)圖2-8),其余細(xì)胞團(tuán)逐漸死亡。Ⅱ發(fā)育類(lèi)型(見(jiàn)圖2-9)大多數(shù)細(xì)胞團(tuán)分化成精子囊團(tuán),成熟的精子囊釋放大量精子;極少數(shù)細(xì)胞團(tuán)釋放出紅色圓形的細(xì)胞并萌發(fā)形成絲狀體,但較難成活(見(jiàn)圖2-10);其余的細(xì)胞團(tuán)裂解死亡。

第三種類(lèi)型是發(fā)育成精子囊(見(jiàn)圖2-11)。單細(xì)胞經(jīng)過(guò)1～2周的培養(yǎng)分裂形成精子囊狀細(xì)胞,細(xì)胞色素體呈淺黃色,逐漸形成精子細(xì)胞,隨后釋放精子。

第四種類(lèi)型是極少數(shù)單細(xì)胞發(fā)育成類(lèi)果孢子囊(見(jiàn)圖2-12),其發(fā)育過(guò)程與雌配子體單細(xì)胞基本相同。

第五種類(lèi)型是直接發(fā)育成絲狀體(見(jiàn)圖2-13),其發(fā)育過(guò)程與雌配子體單細(xì)胞相類(lèi)似。

第六種類(lèi)型是發(fā)育成根絲細(xì)胞葉狀體(見(jiàn)圖2-14),其發(fā)育過(guò)程與雌配子體單細(xì)胞相類(lèi)似。

表1 壇紫菜雌配子體不同部位單細(xì)胞的發(fā)育類(lèi)型和百分比(%)以及每個(gè)部位檢查的總個(gè)體數(shù)(培養(yǎng)15 d)Table 1 Developmental types and their percentages of the single cells isolated from different parts of the female gametophytes and total examined individuals of every part in P.haitanensis after being cultured for 15 days

表2 壇紫菜雄配子體不同部位單細(xì)胞的發(fā)育類(lèi)型和百分比(%)以及每個(gè)部位檢查的總個(gè)體數(shù)(培養(yǎng)15 d)Table 2 Developmental types and their percentages of the single cells isolated from different parts of the male gametophytes and total examined individuals of every part in P.haitanensis after being cultured for 15 days

2.3 配子體離體細(xì)胞發(fā)育分化的位置效應(yīng)

對(duì)同一株配子體不同部位(根絲段、基部、中部、頂部、成熟區(qū))分別進(jìn)行酶解獲得單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),結(jié)果表明不同部位細(xì)胞其發(fā)育類(lèi)型和不同類(lèi)型細(xì)胞比例也不同。對(duì)于雌配子體,從根絲段向上到成熟區(qū),正常葉狀體和根絲細(xì)胞葉狀體2種發(fā)育類(lèi)型僅出現(xiàn)在根絲段和基部,其所占比例均小于3%且逐漸下降;畸形葉狀體所占比例無(wú)明顯差別;細(xì)胞團(tuán)所占比例除成熟區(qū)外無(wú)明顯差別;從配子體中部開(kāi)始出現(xiàn)絲狀體類(lèi)型且比例逐漸增加,尤其在成熟區(qū)所占比例接近40%;果孢子囊與類(lèi)孢子囊枝類(lèi)型僅出現(xiàn)在成熟區(qū)(見(jiàn)表1)。與雌配子體不同的是,在雄配子體單細(xì)胞的發(fā)育類(lèi)型中畸形葉狀體所占比例逐漸下降,出現(xiàn)精子囊類(lèi)型且所占比例逐漸增加;少數(shù)類(lèi)果孢子囊僅出現(xiàn)在根絲段(見(jiàn)表2)。這說(shuō)明配子體根絲段和基部大部分細(xì)胞處于未分化狀態(tài)或者初分化狀態(tài),中部的大多數(shù)細(xì)胞已進(jìn)入分化階段,頂部細(xì)胞已經(jīng)接近于性細(xì)胞,成熟區(qū)中大多數(shù)細(xì)胞已分化成為性細(xì)胞。由此可見(jiàn),無(wú)論雌性配子體或雄性配子體,同一株藻體的不同部位的細(xì)胞其分化狀態(tài)不同,從藻體根絲段開(kāi)始向上移,細(xì)胞的分化狀態(tài)越接近于精子囊或果孢。

3 討論

3.1 海螺酶對(duì)配子體細(xì)胞狀態(tài)的影響

正常生長(zhǎng)的配子體細(xì)胞飽滿呈紅褐色,細(xì)胞間致密,整個(gè)葉片除了根絲段和成熟區(qū)以外所有細(xì)胞形態(tài)基本一致。經(jīng)海螺酶酶解得到的單細(xì)胞色素體墨綠且呈彌散狀,基本處于不分裂狀態(tài)。培養(yǎng)3～4 d后細(xì)胞逐漸恢復(fù)各種生理機(jī)能,在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁加厚,色素體變?yōu)樾菭畛始t褐色,細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)入分裂狀態(tài)。同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)大量酶解出來(lái)的單細(xì)胞呈現(xiàn)淺綠色,這類(lèi)細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中逐漸變透明死亡,這與唐延林[9]的研究結(jié)果是一致的,出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因?yàn)楸狙芯克煤Ｂ菝笧閺?fù)合酶,除了含有分解紫菜細(xì)胞壁的有效酶類(lèi)(纖維素酶、木聚糖酶、瓊膠酶等)外[13],還含有一些對(duì)單細(xì)胞具有毒害作用且活性較高的蛋白酶等酶類(lèi)[9],若處理?xiàng)l件掌握不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致單細(xì)胞大量死亡。

3.2 壇紫菜雌雄配子體離體細(xì)胞發(fā)育分化的異同點(diǎn)

通過(guò)觀察壇紫菜雌雄配子體體細(xì)胞的發(fā)育途徑,發(fā)現(xiàn)不同性別配子體細(xì)胞發(fā)育分化類(lèi)型及趨勢(shì)基本類(lèi)似,雌性和雄性配子體離體細(xì)胞都可以發(fā)育成葉狀體、細(xì)胞團(tuán)、性細(xì)胞、絲狀體以及根絲細(xì)胞葉狀體,這與嚴(yán)興洪[11]和王素娟[14]所報(bào)道的部分結(jié)果相似,但上述作者未觀察到單細(xì)胞發(fā)育成類(lèi)孢子囊枝的情況。Po lne-Fuller[15]等發(fā)現(xiàn),在野生P.perforate J.Agardh配子體中,鄰接成熟生殖塊的未分化單離細(xì)胞發(fā)育成與孢子囊枝形態(tài)上相似的膨大藻絲但沒(méi)有放散殼孢子。曾慶國(guó)[7]利用栽培海區(qū)的壇紫菜配子體,觀察到極個(gè)別單細(xì)胞可以形成1種類(lèi)似于膨大細(xì)胞的結(jié)構(gòu),但未指出雌雄配子體單細(xì)胞發(fā)育的差異和哪種性別配子體單細(xì)胞可發(fā)育成類(lèi)膨大細(xì)胞。王娟[16]以采自栽培海區(qū)的壇紫菜成熟配子體為材料,發(fā)現(xiàn)少數(shù)雌性配子體營(yíng)養(yǎng)組織和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞可以直接形成孢子囊枝,并且當(dāng)培養(yǎng)溫度在25℃時(shí)比例明顯高于20℃,孢子囊枝經(jīng)培養(yǎng)能正常放散殼孢子。與曾慶國(guó)[7]和王娟[16]的報(bào)道不同的是,為了排除自然栽培海區(qū)混合群體中果孢子囊或受精細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾,本研究使用單株隔離培養(yǎng)的配子體為材料,采用酶法分離培養(yǎng)其單細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)僅來(lái)自雌性配子體成熟區(qū)的單細(xì)胞可發(fā)育形成類(lèi)似于孢子囊枝的膨大藻絲,將其粉碎后繼續(xù)培養(yǎng)仍保持膨大藻絲的形態(tài),維持3～4個(gè)月后死亡。將膨大藻絲培養(yǎng)于28℃條件下時(shí)生長(zhǎng)速度稍大于20℃但生長(zhǎng)均非常緩慢,再經(jīng)過(guò)降溫促放培養(yǎng)未放散殼孢子,這與Polne-Fuller[15]在野生P.perforate J.Agardh的研究結(jié)果相似。一般情況下,正常生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)絲狀體只有在特定的光照和溫度等誘導(dǎo)條件下才能成熟形成孢子囊枝,而本研究中成熟區(qū)少數(shù)單細(xì)胞未經(jīng)過(guò)特定條件的誘導(dǎo)就可直接形成類(lèi)孢子囊枝,推測(cè)原因是成熟區(qū)未受精的果孢或者分化更接近于果孢的細(xì)胞具有直接形成類(lèi)孢子囊枝的能力。但是在雄配子體單細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中未觀察到孢子囊枝,其原因有待于進(jìn)一步探索。另外雌性配子體細(xì)胞在離體條件下可以發(fā)育成果孢子囊,但未觀察到發(fā)育成精子囊;與雌配子體相比,雄配子體單細(xì)胞發(fā)育成精子囊,而根絲段的極少數(shù)細(xì)胞發(fā)育成類(lèi)果孢子囊,本研究認(rèn)為根絲段少數(shù)離體細(xì)胞可能發(fā)生性別轉(zhuǎn)化,發(fā)育成與其來(lái)源配子體不同性別的生殖細(xì)胞,這種性轉(zhuǎn)化現(xiàn)象在動(dòng)物界的魚(yú)類(lèi)中普遍存在。這與王娟[16]的報(bào)道不同,后者發(fā)現(xiàn)壇紫菜少數(shù)雌性或雄性配子體單細(xì)胞都能分化出2種性細(xì)胞。

3.3 低溫冷凍對(duì)壇紫菜配子體離體細(xì)胞發(fā)育分化的影響

實(shí)驗(yàn)所用的壇紫菜配子體在-20℃保存了10～20 d,復(fù)蘇后酶解得到的單細(xì)胞經(jīng)過(guò)再生培養(yǎng)發(fā)育分化成多種類(lèi)型的再生植株。同時(shí)在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn),冷凍6～12個(gè)月的材料其發(fā)育分化類(lèi)型明顯減少,大多數(shù)只觀察到發(fā)育成無(wú)假根的畸形葉狀體、具假根的畸形葉狀體以及細(xì)胞團(tuán),正常葉狀體、性細(xì)胞和絲狀體發(fā)育類(lèi)型明顯減少,孢子囊枝及根絲細(xì)胞葉狀體類(lèi)型極少見(jiàn)。王素娟[14]報(bào)道10月中下旬或11月上中旬不冷藏或冷藏天數(shù)少的材料出苗多。由此可見(jiàn)冷藏時(shí)間越長(zhǎng)配子體細(xì)胞受到的低溫傷害就越大,這樣單細(xì)胞活力下降,成活率低,發(fā)育分化類(lèi)型減少。為了提高酶解效率并獲得盡可能多的發(fā)育分化類(lèi)型,建議利用新鮮的材料或者冷藏天數(shù)少的材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.4 酶法育苗在生產(chǎn)研究中的應(yīng)用前景

無(wú)論雌性配子體或雄性配子體離體細(xì)胞均能發(fā)育成正常葉狀體,但與絲狀體發(fā)育類(lèi)型相比,正常葉狀體的比例均較低,推測(cè)可能與壇紫菜配子體離體細(xì)胞的發(fā)育全能性及酶解所用藻體的日齡和成熟程度有關(guān)。條斑紫菜配子體能形成單孢子,放散萌發(fā)后形成新的配子體,而目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為壇紫菜配子體不能形成單孢子,這一點(diǎn)也表明壇紫菜配子體體細(xì)胞的全能性較差。嚴(yán)興洪[11]報(bào)道正常葉狀體的比例隨著藻齡的增加而急劇下降,由此作者認(rèn)為種藻日齡越大,配子體的成熟程度越高,其大多數(shù)體細(xì)胞的分化程度越接近于性細(xì)胞,發(fā)育成正常葉狀體就越少。所以在酶法育苗過(guò)程中為了獲得較高的出苗率,可以利用日齡小的藻體進(jìn)行酶法分離細(xì)胞;對(duì)于較成熟的配子體,由于根絲段區(qū)域較小的局限可以選擇藻體基部區(qū)域進(jìn)行酶解。戴繼勛[17]和王素娟[14,18]將壇紫菜和條斑紫菜的單細(xì)胞附于網(wǎng)繩上下網(wǎng)栽培并取得了成效。但是由于單細(xì)胞在網(wǎng)繩上的附著率低,使得目前酶法育苗在生產(chǎn)實(shí)踐中仍未得到大面積的推廣利用,所以提高單細(xì)胞在網(wǎng)繩上的附著效率成為亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。此外,由于壇紫菜配子體是遺傳上的嵌合體,給遺傳育種工作及遺傳學(xué)研究帶來(lái)了一定的困難,而通過(guò)酶法分離培養(yǎng)單細(xì)胞得到的形態(tài)正常葉狀體為純合葉狀體,這將為開(kāi)展遺傳育種研究提供極大的便利。

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Studies on the Development of Cells Isolated from Gametophytes in Porphyra haitanensis

WANG Li,KONG Fan-Na,MAO Yun-Xiang,YANG Hui
(Labo rato ry of Marine Genetics and Breeding,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

This paper investigated the developmental patternsof somatic cells isolated from male and female gametophytes in Porphyra haitanensis Chang et Zheng and the developmental patterns of the single cells isolated from different parts of the gametophytic thallus(rhizoid section,bottom section,central section,top section,mature section).The single cells enzymatically isolated from both male and female gametophytes of P.haitanensis were cultured.The results showed that the development of somatic cells of male and female gametophytes in P.haitanens is were a little different although their patterns were nearly the same.These differences included some somatic cells isolated from female gametophytes developing into carpospo rangia,a few somatic cells developing into conchospo rangia-like cells;but some somatic cells isolated from male gametophytes developing into spermatangia from which spermatia were released,only few somatic cells developing into carpospo rangia-like cells.Researches on regeneration of the single cells showed that the development of somatic cells isolated from gametophyteswere affected by the part of the gametophytic thallus.The somatic cells isolated from different parts of the thallus regenerated into different types of plants because of the difference of the differentiation stages of the cells in the thallus.With the position w here the cells were isolated moving upward from rhizoid section,the percentages of both normal thalli and thalli regenerated from rhizoid cells decreased,and the percentages of the abnormal thalli also decreased o r had no significant difference,while the percentages of the conchocelis increased.

Porphyra haitanensis;male and female gametophytes;single cell;development and differentiation

Q343

A

1672-5174(2010)12-081-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30700621,30972247);國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA 10A 402,2006AA10A 413);教育部新世紀(jì)人才支持計(jì)劃(NCET-06-0596);山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金(2008BS06002);農(nóng)業(yè)部行業(yè)公益性專(zhuān)項(xiàng)(200903030)資助

2009-12-21;

2010-04-27

王 莉(1983-),女,碩士生,主要從事藻類(lèi)遺傳育種研究。E-mail:liwang830423@yahoo.cn

**通訊作者:Tel:0532-82032017;E-mail:yxmao@ouc.edu.cn

責(zé)任編輯 于 衛(wèi)