謝顯傳,王曉蓉,張幼寬,吳穎欣,薛銀剛 (污染控制與資源化研究國家重點實驗室,南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院,水科學(xué)研究中心,江蘇 南京 210093)

全氟辛酸(PFOA)是典型的全氟化合物(PFCs).由于含有高能量的C-F共價鍵,因而具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性、高表面活性及疏水疏油性能,PFOA被大量應(yīng)用于聚合物添加劑、表面活性劑、電子工業(yè)、電鍍等多種行業(yè)[1-2].在1951～2004年期間,全球 PFOA 的總生產(chǎn)量大約在 3600～5700t,其中約有400～700t排入環(huán)境[3].PFOA可能通過食物鏈傳遞產(chǎn)生生物富集[4-5],對動物可能造成肝臟、神經(jīng)、生殖遺傳及致癌性等多種毒性[6-7].美國國家環(huán)保局(USEPA)在有關(guān)報告中把全氟辛酸認為是“可能的(1ikely)致癌物”或“提示性(suggestive)致癌物”[8].

PFOA由于疏水又疏油的特點,與一般持久性有機污染物(POPs)不同,進入生物體內(nèi)不易在脂肪組織中積蓄,而是優(yōu)先和生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合后發(fā)生生物蓄積[9].血清白蛋白是哺乳動物血漿中含量最豐富的載體蛋白, 能與外源性化合物結(jié)合,起到存儲和運輸?shù)淖饔肹10].由于與人血清白蛋白的結(jié)構(gòu)相似且廉價易得,牛血清白蛋白(BSA)常被選為模型蛋白質(zhì)以研究小分子有機物與蛋白質(zhì)的相互作用.本實驗在模擬生理條件下,研究 PFOA 與 BSA 的相互作用, 對了解PFOA在生物體內(nèi)遷移、代謝及致毒機理等有重要意義.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器:F-700型熒光光譜儀(日本日立Hitachi公司),Millipore Q超純水系統(tǒng).

試劑:牛血清白蛋白(BSA)購于 Fluka公司,全氟辛酸(PFOA)購自 Sigma-Aldrich公司,其他所有試劑均為分析純產(chǎn)品,購于國藥集團上海化學(xué)試劑有限公司和南京化學(xué)試劑公司.

1.2 實驗方法

溶液配制:以0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.4,含0.1mol/L NaCl)為溶劑,配制 1.0×10-5mol/L PFOA溶液,同時配制4.0×10-6mol/L BSA溶液.置于4℃冰箱中保存.

熒光光譜測定:10mL聚丙烯離心管中加入2mL4.0×10-6mol/L BSA 溶液和2mL不同濃度PFOA稀釋液混勻,在不同溫度條件下(277,298和310K)反應(yīng)10min后,測定熒光光譜.熒光比色皿光徑為1cm,熒光掃描的固定激發(fā)波長為280 nm,激發(fā)和發(fā)射通帶均為5nm,掃描 300～450nm的熒光光譜.同步熒光光譜掃描測定時固定激發(fā)和發(fā)射波長間隔Δλ分別為15nm和60nm.

2 結(jié)果與討論

2.1 PFOA對BSA熒光猝滅作用

因分子中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等殘基,BSA能在紫外光激發(fā)下產(chǎn)生內(nèi)源熒光.當(dāng)激發(fā)光波長為280nm時,BSA熒光發(fā)射峰位置在340nm附近.由于無熒光活性基團,PFOA不會產(chǎn)生與BSA相互干擾的熒光.由圖1可見,當(dāng)反應(yīng)體系中BSA濃度固定時,隨著PFOA濃度的增加,BSA內(nèi)源熒光產(chǎn)生有規(guī)律的猝滅,且其最大發(fā)射波長有明顯逐漸藍移現(xiàn)象,由此可判斷它們發(fā)生了相互作用.這種作用可能造成蛋白質(zhì)的熒光發(fā)色團微環(huán)境及分子構(gòu)象行為變化,從而發(fā)生熒光猝滅.

2.2 PFOA對BSA熒光猝滅機理

蛋白質(zhì)熒光猝滅機理主要可分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅.動態(tài)熒光猝滅是指猝滅劑分子與熒光分子在分子運動發(fā)生碰撞而引起熒光猝滅.動態(tài)猝滅受反應(yīng)溫度影響大,隨著反應(yīng)溫度升高,分子運動加快,動態(tài)猝滅加劇.各類猝滅劑的最大動態(tài)猝滅常數(shù)為2.0×1010L/(mol·s).熒光靜態(tài)猝滅是指猝滅劑與熒光物質(zhì)相互結(jié)合生成無熒光特性的復(fù)合物而造成熒光猝滅.與動態(tài)猝滅相比,熒光靜態(tài)猝滅受反應(yīng)溫度影響較小[11].

圖1 全氟辛酸對BSA熒光光譜影響Fig.1 Effect of PFOA on florescence spectra of BSA

分別測定了在277,298和310K溫度條件下PFOA對BSA的熒光猝滅作用.假設(shè) PFOA對BSA為動態(tài)猝滅,則采用Stern-Volmer方程可得式(1):

式中:F0和F分別表示無猝滅劑和有猝滅劑時BSA的熒光強度;[Q]為猝滅劑即 PFOA的濃度;KSV為熒光動態(tài)猝滅常數(shù);Kq為熒光動態(tài)猝滅速率常數(shù);τ0為無猝滅劑時熒光分子的平均壽命(約10－8s).由表1可見,PFOA對BSA在277、298、310K時熒光猝滅速率常數(shù)Kq分別是9.3×1012,6.8×1012,6.2×1012L/(mol·s), 遠大于最大動態(tài)猝滅常數(shù)為2.0×1010L/(mol·s);且隨著溫度升高,Kq值降低.說明PFOA對BSA的熒光猝滅是靜態(tài)猝滅而非動態(tài)猝滅.

2.3 PFOA與BSA的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點數(shù)

當(dāng)PFOA對BSA產(chǎn)生靜態(tài)猝滅時,它們將形成新的復(fù)合物.假設(shè)PFOA在BSA上有n個相同且獨立的結(jié)合位點,那么PFOA與BSA的關(guān)系可由式(2)表達:

式中:F0和F分別表示無猝滅劑和有猝滅劑時BSA的熒光強度;[Q]為猝滅劑即PFOA的濃度;[P]為BSA的濃度;K為結(jié)合常數(shù);n為結(jié)合位點 數(shù)[12].以lg((F0–F)/F)為縱坐標(y軸),以lg(1/([Q]-(F0–F)[P]/ F0))為橫坐標(x 軸)作圖(圖2),即可求出PFOA與BSA的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點數(shù).

表1 全氟辛酸對牛血清白蛋白的熒光動態(tài)猝滅常數(shù)Table 1 Florescence dynamic quenching constants of PFOA-BSA system

圖2 全氟辛酸與牛血清白蛋白的lg((F0–F)/F)-lg(1/([Q]-(F0–F)[P]/F0))圖Fig.2 The pots of lg((F0–F)/F)-lg(1/([Q]-(F0–F) [P]/F0))of PFOA-BSA system

從表 2可見,PFOA與 BSA的結(jié)合常數(shù)在104L/mol數(shù)量級以上,結(jié)合位點數(shù)約為1,說明二者形成較穩(wěn)定的1:1復(fù)合物,同時也意味著PFOA進入生物體內(nèi)后,能被血清蛋白攜帶著在體內(nèi)進行運移.此外,隨著溫度的增加結(jié)合常數(shù)降低,進一步驗證PFOA對BSA的熒光猝滅是一靜態(tài)過程.有研究表明,BSA在134和212位有2個色氨酸殘基[13],Laura等[14]根據(jù) Stern-Volmer二級方程曲線形狀推測 BSA的兩個色氨酸殘基都是PFOA 結(jié)合位點,其中一個是強結(jié)合位點,一個是弱結(jié)合位點.然而,本文采用改進的雙對數(shù)方程方法分析得到只有一個強結(jié)合位點,是否還存在一個弱結(jié)合位點,需要進一步深入研究.

表2 全氟辛酸與牛血清白蛋白結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點數(shù)Table2 The binding constant and binding site number of PFOA-BSA system

2.4 PFOA與BSA相互作用力類型

表3 全氟辛酸與牛血清白蛋白結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 The thermodynamic parameters of PFOA-BSA system

根據(jù)3個熱力學(xué)公式:1)ln(K2/K1)=ΔH(1/T1-1/T2)/R,2) ΔG=-RTlnK,3) ΔS=(ΔH-ΔG)/ T.分別計算出PFOA與BSA的反應(yīng)焓變ΔH、自由能變ΔG和熵變ΔS.從表3中可以看出PFOA與BSA的相互結(jié)合是一個自發(fā)的(ΔG＞0)、放熱的(ΔH＜0＝過程,也是一個熵增過程(ΔS＞0),因此它們的相互作用是熵和焓共同驅(qū)動完成. 有機小分子與蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子之間主要通過疏水力、氫鍵、范德華力和靜電引力等非共價力相互作用.Ross等[15]實驗總結(jié)出了小分子與生物大分子結(jié)合作用力類型的熱力學(xué)規(guī)律,即:當(dāng)ΔH＞0,ΔS＞0 時,主要作用力是疏水作用力;當(dāng)ΔH＞0,ΔS＜0 時,主要作用力是氫鍵或范德華力;當(dāng)ΔH＜0,ΔS＞0時,主要作用力是靜電引力.由表3可見,PFOA與BSA 反應(yīng)的ΔH＜0, ΔS＞0,因此它們的相互作用力主要是靜電引力.在水相中PFOA電離成酸根離子可能是靜力引力產(chǎn)生的主要原因.然而,由于PFOA具有一定的疏水性,所以疏水力對它們相互結(jié)合也有不可忽略的作用.

2.5 PFOA對BSA分子構(gòu)象的影響

圖3 酪氨酸和色氨酸的同步熒光光譜Fig.3 Effect of PFOA on the synchronous fluorescence spectra of tyrosine and tryptophan.

蛋白質(zhì)中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸這3種有熒光的芳香族氨基酸的熒光光譜發(fā)射峰嚴重重疊,常規(guī)熒光掃描光譜難以把它們的特征光譜區(qū)分,所以需要采用同步熒光光譜掃描才能對這些氨基酸進行特征掃描.同步熒光光譜是指固定激發(fā)波長與發(fā)射波長的間距Δλ,同時掃描激發(fā)波和發(fā)射波所測的掃描光譜.它可提供熒光發(fā)射基團附近微環(huán)境的變化信息.血清蛋白分子中酪氨酸殘基和色氨酸殘基的同步熒光特征光譜分別是Δλ=15nm 和Δλ=60nm[16].當(dāng)固定BSA濃度時,隨著PFOA濃度的增大,酪氨酸殘基的熒光強度被激活升高,而色氨酸殘基熒光強度顯著猝滅(圖3),說明PFOA與BSA的結(jié)合位點接近于色氨酸殘基.色氨酸最大發(fā)射波長均發(fā)生了藍移,表明BSA與PFOA相互作用后,色氨酸附近的極性減弱,疏水環(huán)境增強,蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)趨于折疊狀態(tài).酪氨酸殘基熒光強度被激活升高的原因可能是靠近酪氨酸附近的極性和親水環(huán)境增強,蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的趨于松散,從而使酪氨酸更容易受到紫外光激發(fā)下產(chǎn)生熒光效應(yīng).

3 結(jié)論

3.1 全氟辛酸(PFOA)對牛血清白蛋白(BSA)內(nèi)源熒光具有強烈的靜態(tài)猝滅作用,兩者反應(yīng)生成無熒光的復(fù)合物是導(dǎo)致BSA熒光猝滅的主要原因.

3.2 PFOA與BSA的結(jié)合常數(shù)在104L/mol數(shù)量級以上,結(jié)合位點為1個,結(jié)合位點接近于色氨酸殘基.

3.3 熱力學(xué)參數(shù)表明,FOA與BSA的相互結(jié)合可能是靜電引力和疏水力共同作用的結(jié)果.

3.4 與PFOA相互作用后,BSA的色氨酸殘基附近的疏水環(huán)境增強,蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)趨于折疊狀態(tài);而酪氨酸殘基附近的親水性環(huán)境增強,蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)趨于松散狀態(tài).

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