金洪濤,夏志平,李 丹 ,薛慧亮 ,劉 軍 ,連 海

一株致仔豬腹瀉大腸桿菌的分離與鑒定＊

金洪濤,夏志平,李 丹 ,薛慧亮 ,劉 軍 ,連 海

目的 對(duì)病死仔豬腸道內(nèi)分離的大腸桿菌進(jìn)行分離培養(yǎng),通過(guò)常規(guī)生化反應(yīng)及毒力基因和分型基因的分子生物學(xué)檢測(cè)對(duì)分離株進(jìn)行初步鑒定。方法應(yīng)用多重PCR檢測(cè)方法進(jìn)行毒力基因的檢測(cè),經(jīng)細(xì)菌16S rDNA全基因擴(kuò)增測(cè)序,Flic基因擴(kuò)增測(cè)序,Blast分析,對(duì)分離的大腸桿菌進(jìn)行初步分型鑒定。結(jié)果通過(guò)對(duì)分離菌株基因組DNA的多重PCR分析,發(fā)現(xiàn)該菌株含大腸桿菌耐熱腸毒素和不耐熱腸毒素致病基因。通過(guò)細(xì)菌16S rDNA全基因擴(kuò)增測(cè)序,Flic基因擴(kuò)增測(cè)序,Blast分析顯示該分離株為H10。其中16S rDNA全基因與H10菌株同源性在99%,Flic基因與H10菌株同源性在98%。結(jié)論所分離的豬腸道致病性大腸桿菌為 H10,其含耐熱腸毒素和不耐熱腸毒素致病基因。

腹瀉;大腸桿菌;毒力基因;H10

豬大腸桿菌病是危害仔豬的一種細(xì)菌性傳染病,主要引起嚴(yán)重腹瀉,并造成仔豬脫水死亡。豬常見(jiàn)致病性大腸桿菌血清型包括 O8、O9、O20、O60、O138、O139、O149 等〔1-3〕并具有相應(yīng)的菌毛和鞭毛。產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌(ETEC)是豬的一種腸道病原菌,能夠引起仔豬黃痢、白痢和豬的水腫病。

2009年4、5月份,在吉林省某牧業(yè)公司的多家豬場(chǎng)發(fā)生1月齡左右仔豬急性死亡,死前排黃色稀便,劇烈腹瀉伴水樣便。剖檢見(jiàn)腸道嚴(yán)重出血,充氣,腸壁稀薄,腹股溝、頜下淋巴結(jié)嚴(yán)重出血。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)發(fā)病死亡仔豬的腸和腸系膜淋巴結(jié)進(jìn)行了病原分離培養(yǎng)及初步鑒定,以指導(dǎo)臨床診斷和防治,減少經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 病料及菌株來(lái)源和培養(yǎng)條件 無(wú)菌采取吉林省某牧業(yè)公司豬場(chǎng)仔豬腹瀉病死豬的腸和腸系膜淋巴結(jié)作病料。病料劃線于麥康凱平板,37℃培養(yǎng)18h;挑取典型菌落在麥康凱平板上分區(qū)劃線,37℃培養(yǎng) 18h,選取單個(gè)典型菌落純培養(yǎng)后-80℃保存〔4-5〕。

1.2 引物 根據(jù) GenBank中發(fā)表的序列,分別設(shè)計(jì)針對(duì) elt(L T)、eaeA(Intim in)、inv A、ST 的四種毒力基因的特異性多重PCR檢測(cè)引物,由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 主要試劑 麥康凱干粉培養(yǎng)基、購(gòu)自 Sigma公司(美國(guó));PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。其它常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)產(chǎn)品。

1.4 常規(guī)生化反應(yīng)鑒定 按照常規(guī)方法對(duì)分離的大腸桿菌進(jìn)行生化鑒定。

1.5 PCR檢測(cè)毒素和毒力島特異致病基因基因按文獻(xiàn)報(bào)道方法對(duì)分離株基因組DNA的elt(L T)、毒力島 eaeA(Intimin)、inv A、ST基因進(jìn)行多重PCR 檢測(cè)鑒定〔3-5〕。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離和腸毒素基因PCR檢測(cè) 病死豬的腸和腸系膜淋巴結(jié)病料劃線于麥康凱平板,37℃培養(yǎng)18h,可見(jiàn)典型紅色圓形菌落;挑取典型菌落在麥康凱平板上分區(qū)劃線,37℃培養(yǎng)18h,選取單個(gè)典型菌落接種馬林肉湯培養(yǎng)基小量培養(yǎng)后提取細(xì)菌基因組DNA,多重PCR進(jìn)行致病基因檢測(cè),發(fā)現(xiàn)該菌株含耐熱腸毒素和不耐熱腸毒素致病基因,毒力島eaeA(Intimin)、inv A致病基因 PCR陰性,說(shuō)明該分離菌株基因組中不含上述致病基因。耐熱腸毒素PCR特異性條帶大小為164bp,不耐熱腸毒素PCR特異性條帶大小為685bp,見(jiàn)圖1,分離株毒力特征為產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌(ETEC)。

圖1 單菌落基因組DNA多重PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Single colony genome DNA multi-PCRam plification of virulence gene results M DNA marker(DL 2000);1 ST positive control;2-7 single colony genome DNA multi-PCR amp lification of virulence gene results;8 negative control;9 toxin gene positive control;10-11 t multi-PCR positive control;12 agent control

2.2 大腸桿菌分離株生化反應(yīng)鑒定結(jié)果 見(jiàn)表1。

2.3 大腸桿菌16s rDNA全基因擴(kuò)增測(cè)序,Flic基因擴(kuò)增測(cè)序檢測(cè) 對(duì)分離株的大腸桿菌16s rDNA全基因PCR擴(kuò)增測(cè)序,并對(duì)Flic基因進(jìn)行 PCR擴(kuò)增測(cè)序,Blast分析顯示該分離株為 H10。其中16s rDNA全基因與 H10菌株同源性在99%,Flic基因與 H10菌株(AF169320、AM 231654)同源性在98%,見(jiàn)表 2。

3 討 論

大腸桿菌是主要的一類腸道非致病菌,但也有表1 生化反應(yīng)鑒定結(jié)果

注:“”產(chǎn)不產(chǎn)氣;“-”不反應(yīng)

表2 菌種鑒定結(jié)果Table 2 Strain identification result

Table 1 Biochem ical event identification result一些大腸桿菌具有引起健康動(dòng)物胃腸道、尿道或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的能力。在分類學(xué)上大腸桿菌被列為埃希氏大腸桿菌科,埃希氏大腸桿菌屬。就致腸道疾患的大腸桿菌來(lái)說(shuō),依據(jù)致病機(jī)理、臨床癥狀和流行病學(xué)特點(diǎn)的不同主要分為7種類型,即產(chǎn)腸毒素性大腸埃希菌(ETEC)、腸致病性大腸埃希菌(EPEC)、腸道聚集-黏附性大腸埃希菌 (EAAggEC)、腸侵襲性大腸埃希菌(EIEC)、腸出血性大腸埃希菌(EHEC)、腹瀉相關(guān)溶血性大腸埃希菌(DHEC)、產(chǎn)細(xì)胞腫脹致死毒素性大腸埃希菌(CDT-EC)。引起仔豬腹瀉的大腸桿菌血清型隨地區(qū)和時(shí)間不同而有所差異,世界范圍內(nèi)豬源 ETEC菌株多屬于 O8、O9、O20、O45、O64、O101、O138、O139、O141、O147、O149 等血清型 ,國(guó)外發(fā)現(xiàn)致仔豬腹瀉最常見(jiàn)的 ETEC屬于血清型 O149、O8、O147,并能產(chǎn)生L T、STb 腸毒素〔1〕。H 10 菌株為引起嬰幼兒和仔豬等劇烈腹瀉的常見(jiàn)病原性大腸桿菌,引用生水或食用污染的食品飼料為主要原因,應(yīng)該注意加強(qiáng)預(yù)防。

幼畜腹瀉是嚴(yán)重制約畜牧業(yè)發(fā)展的主要問(wèn)題之一,每年在世界范圍內(nèi)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。ETEC是引起幼畜腹瀉的主要病原之一,其致病因子包括黏附素(adhesion)、腸毒素(Enterotoxins)、水腫病毒素(edema disease p rincip le,EDP)、內(nèi)毒素(endotoxin)、溶血素(haemolysin)及 EatA等。本實(shí)驗(yàn)分離的大腸桿菌主要含有耐熱腸毒素和不耐熱腸毒素致病基因,腸毒素有耐熱性腸毒素(heat stable entero toxin,ST)和不耐熱性腸毒素(heat labile enterotoxin,L T)兩種,二者單獨(dú)或共同存在于所有ETEC中,是導(dǎo)致幼齡動(dòng)物腹瀉的直接致病因子〔2〕。

本研究分離的菌株為 H10,并且其對(duì)仔豬的致病性非常強(qiáng),本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)應(yīng)用分離菌株培養(yǎng)后作為滅活疫苗進(jìn)行相應(yīng)流行豬場(chǎng)的免疫預(yù)防,但菌株的來(lái)源及其更進(jìn)一步的菌株特性值得繼續(xù)研究。隨著基因組學(xué)、生物信息學(xué)、生物技術(shù)的發(fā)展和對(duì)ETEC的深入了解,會(huì)有越來(lái)越先進(jìn)的方法來(lái)預(yù)防幼畜腹瀉的發(fā)生。

〔1〕陳一兵,苗曉青,高崧,等.豬腹瀉病例分離大腸桿菌的血清學(xué)分布〔J〕.中國(guó)獸醫(yī)雜志,2008,44(9):36-37.

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〔3〕陳祥,趙娟,高崧,等.我國(guó)部分地區(qū)豬源大腸桿菌LEE和 HPI毒力島相關(guān)基因的檢測(cè)〔J〕.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2006,22(1):33.

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〔5〕Chen X,Gao S,Jiao X,et al.Prevalence of serogroups and virulence factors of Escherichia coli strains isolated from pigs with postweaning diarrhea in eastern China〔J〕.Vet Microbi,2004,103:13-20.

Isolation and identification of pathogen ic bacterium which caused hemorrhagic diarrhea in newborn swine

JIN Hong-tao,X IA Zhi-ping,L IDan,XU E Hui-liang,L IU Jun,L IAN Hai
(Basic Veterinary Medicine Laboratory,Institute of M ilitary Veterinary M edicine,Changchun 130062,China)

The Escherichia coli(E.coli)strain from intestinal tract of died new born swine was isolated and cultured.Preliminary identification of the isolated strain was conducted by conventional biochemical tests,and the molecular biology detections of toxicity gene and typing gene were comp leted bymulti-PCR.Stable toxin and heat-labile enterotoxin genes of E.coli were detected from the isolated strain.By amp lifying and sequencing bacterial 16s rDNA and fliC gene,the isolated strain was identified as H10 by Blast analysis.The homology of strain H10 was 99%with bacterial 16s rDNA gene and 98%with fliC gene.

diarrhea;Escherichia coli;toxicity gene;H10

S852

A

1002-2694(2010)03-0209-02

＊國(guó)家科技重大專項(xiàng)(2009ZX10604)

夏志平,Email:jinhtao@126.com

軍事獸醫(yī)研究所基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究室,長(zhǎng)春 130062

2009-08-30;

2009-12-17