黎家華

三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院(湖北宜昌 443002)

腎穿刺活檢已普遍應(yīng)用于腎小球腎炎的分類和診斷,所采取的小塊活檢,一般采用六胺銀染色法,以便清楚地顯示腎小球基底膜的改變?；啄な怯散粜湍z原蛋白、蛋白多糖和層粘連蛋白等組成,經(jīng)過(guò)氧化劑處理后,能使腎小球基底膜上的糖類及有關(guān)物質(zhì)中的 1,2-2二醇轉(zhuǎn)變?yōu)槿?暴露更多的醛基,醛與銀離子發(fā)生銀鏡反應(yīng),能較好的顯示腎小球毛細(xì)血管基底膜的情況。在日常作腎組織六胺銀染色的過(guò)程中,常會(huì)受較多不確定因素的影響,如果處理不當(dāng),將直接影響到染色效果,造成病理診斷困難[1,2]。

筆者就影響腎穿刺活檢六胺銀染色的因素作一簡(jiǎn)述。

1 組織固定不良對(duì)染色的影響

腎穿刺取得的活檢標(biāo)本,固定不及時(shí),組織產(chǎn)生自溶;或取材后沒有及時(shí)處理,放置過(guò)久組織干涸;固定時(shí)間短,固定不良等,都會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)破壞,染色質(zhì)量欠佳,不能進(jìn)行正確的診斷。因此,組織固定的好壞是制片的關(guān)鍵。新取出的活檢標(biāo)本放在紗布上用生理鹽水將血沖洗干凈,立即放進(jìn)固定液內(nèi)進(jìn)行固定。

2 包埋、切片對(duì)染色的影響

由于腎穿刺獲得的腎組織比較細(xì)小,固定、包埋時(shí)若沒有放平整,易出現(xiàn)彎曲,不能切取最大切面,導(dǎo)致腎小球數(shù)目減少或沒有;切片過(guò)厚會(huì)使六胺銀染色過(guò)深,導(dǎo)致細(xì)胞增生、基底膜增厚的假象,不利于觀察診斷,并且在高溫染色過(guò)程中容易脫片,因此;為保證切片完整及切取最大切面,腎穿刺的組織在固定、包埋時(shí),應(yīng)保證其平整性。為切取最大切面完整的切片提供保障。要求切片厚度應(yīng)≤3 μ m,且無(wú)皺折及刀痕為宜,才能有效的控制六胺銀染色的深淺,比較清晰地顯示基底膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

為防止在染色過(guò)程脫片,載玻片應(yīng)進(jìn)行放脫片處理,我們采用的方法是:載玻片經(jīng)洗衣粉擦洗,清水沖洗干凈,泡清潔液 24h,清水沖洗,蒸餾水洗凈.烘干,涂 APES(防脫片劑,用丙酮 1∶50稀釋,將洗凈載玻片放入其中 30s拿出,蒸餾水洗)晾干備用,撈片時(shí)一步到位,在 60℃溫箱考 2～4h,使切片組織充分的粘附在載玻片上。效果爽佳,沒有再出現(xiàn)脫片現(xiàn)象。

3 脫蠟不夠徹底對(duì)染色的影響

脫蠟時(shí)間太短;脫蠟劑(二甲苯)使用時(shí)間較長(zhǎng),溶蠟達(dá)到飽和時(shí),則脫蠟?zāi)芰ο陆祷騿适?在冬天室溫低,脫蠟劑的脫蠟效果差,脫蠟不徹底,組織上有殘余的石蠟,用 0.5%高碘酸氧化處理時(shí),不能對(duì)腎小球毛細(xì)血管基膜進(jìn)行有效的氧化,直接妨礙六胺銀染色。此時(shí):應(yīng)及時(shí)更換新的脫蠟劑。若因室溫低而脫蠟效果不滿意時(shí),我們采取的措施是:置于 37℃溫箱內(nèi)脫蠟、延長(zhǎng)脫蠟時(shí)間和增加一次脫蠟(30min×3次),能達(dá)到較好的脫蠟效果。

4 氧化劑濃度及處理時(shí)間對(duì)染色的影響

高碘酸處理切片時(shí)的濃度和時(shí)間的不同,導(dǎo)致著色深淺不一。濃度偏低、處理時(shí)間短,對(duì)腎小球毛細(xì)血管基膜氧化作用不足,著色比較淺或根本不著色,往往需要延長(zhǎng)六胺銀染色時(shí)間,濃度高、處理時(shí)間長(zhǎng),則易導(dǎo)致氧化過(guò)度,著色很深,造成基膜增厚變粗的假象,不能正確顯示其病理改變,還易形成黑色反光膜,給觀察診斷造成困難。氧化劑經(jīng)長(zhǎng)期反復(fù)使用,其氧化功能也會(huì)逐漸減弱,則需要更換新的氧化劑。因此:保持氧化劑足夠的濃度和處理時(shí)間,是做好基底膜染色的前提。通過(guò)做預(yù)實(shí)驗(yàn):設(shè)計(jì)不同的濃度和不同的處理時(shí)間,反復(fù)做幾次,再根據(jù)染色結(jié)果確定適合本實(shí)驗(yàn)室的染色方案。有文獻(xiàn)報(bào)道[1,2]:采用雙重氧化,即先用 1%高碘酸 10min,再用 5%鉻酸 20～40min,能充分暴露更多的醛基,加強(qiáng)基底膜著色。

5 六胺銀染色的時(shí)間和溫度對(duì)染色的影響

六胺銀染色的時(shí)間的長(zhǎng)短受染液的新鮮度、溫度高低等因素的影響,染色時(shí)間過(guò)短,染色反應(yīng)不足,基底膜著色淺,腎小球基底膜不能清晰顯示出來(lái);染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng),染色反應(yīng)過(guò)度,基底膜著色很深,組織切片表面還會(huì)出現(xiàn)的銀鏡反應(yīng)所形成的黑色反光膜,切片背景顯得很臟,影響對(duì)比染色。

溫度的高低,決定染色結(jié)果的是否成功,溫度低于 60℃,組織的反應(yīng)緩慢,浸染時(shí)間長(zhǎng),易出現(xiàn)的黑色沉淀,氯化金調(diào)色時(shí)無(wú)法清除,溫度更低,則幾乎不反應(yīng),溫度過(guò)高(高于 70℃)溶液易加速氧化反應(yīng)而變混濁,組織的反應(yīng)快,易過(guò)染,難以控制,不利于觀察病變。

選擇合適染色的溫度是六胺銀染色成功的關(guān)鍵,有專家采用微波快速預(yù)熱的方法、溫度控制在60℃～65℃之間[2,3]。在氣溫較低時(shí),六胺銀溶液先用微波預(yù)預(yù)熱,使六胺銀溶液溫度快速達(dá)到65℃,將切片放進(jìn)溶液內(nèi)開始染色,可以縮短在高溫中的染色時(shí)間,減少黑色沉淀的形成。隨時(shí)查看染色進(jìn)度,每隔 10 m i n取出切片在顯微鏡下觀察,不足繼續(xù)浸染,直至腎小球基底膜呈黑色,清晰顯示出基底膜時(shí),即可終止染色。

做好每一張六胺銀染色是很不容易的,相信每一個(gè)操作人員,經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的染色,對(duì)成功與失敗的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行徹底地分析和總結(jié),不斷積累豐富的經(jīng)驗(yàn),熟練生巧,充分掌握六胺銀染色的關(guān)鍵步驟,會(huì)染出非常滿意的切片的。

要做好六胺銀染色,應(yīng)該注意以下幾點(diǎn):

(1)組織取材后,要及時(shí)、充分的固定。

(2)載玻片應(yīng)進(jìn)行放脫片處理,攤片要平整,不能有皺褶。

(3)染色所用玻璃器皿要嚴(yán)格清洗,經(jīng)酸浸泡,再用蒸餾水沖洗干凈,保證所用器皿的潔凈度,不留任何雜質(zhì),否則染液會(huì)出現(xiàn)混濁現(xiàn)象。

(4)配制的染液要即時(shí)使用,保存于冰箱,保證染液的新鮮度,氧化要充分。

(5)要隨時(shí)觀察染色進(jìn)度,嚴(yán)格控制染色時(shí)間,不能過(guò)染。

(6)染色過(guò)程中使用塑料鑷子,以防金屬鑷子與銀染液發(fā)生反應(yīng),造成銀污染切片。

[1] 張健,劉濤,朱禮國(guó),等.腎穿刺組織六胺銀染色的改進(jìn)[J].鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,24(1):49.

[2] 張威,梁英杰,賴英英.自控微波技術(shù)在腎穿刺活檢六胺銀染色中的應(yīng)用[J].中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,23(9):143-144.

[3] 周穎川.腎穿刺標(biāo)本制片的質(zhì)量控制[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2007,23(9):1355-1356.

[4] 駱新蘭,蔡秀,王朝杰,等.腎小球基膜六胺銀染色的比較[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2005,20(4):493-494.

[5] 朱國(guó)良,張曉嵐,石麒麟.微波改良腎穿刺活檢六胺銀染色[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2010,11(1):66-67.