陳芬 楊超 蔡哲 石超 楊春蕾

(四川大學(xué)生命科學(xué)院,醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室,四川 成都 610041)

心臟病是嚴(yán)重威脅人類生命的疾病,據(jù)統(tǒng)計(jì)每年死于該病的人數(shù)占到總死亡人數(shù)的40%[1]。其中心肌的局部損傷是一種常見的心臟病,其病損主要由血栓或急性動(dòng)脈粥樣硬化斑塊引起動(dòng)脈血管供血不足造成的。為了挽救缺血組織,對(duì)局部缺血的心臟進(jìn)行再灌注已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。但這種措施也會(huì)造成不可逆的損傷,即缺血再灌注損傷[2]。近來(lái)很多研究表明心肌在缺血再灌注損傷會(huì)出現(xiàn)大量細(xì)胞凋亡,因此心肌缺血再灌注損傷的病理及各種保護(hù)機(jī)制已成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。

黃酮類化合物在植物代謝產(chǎn)物中普遍存在并且成為人類和動(dòng)物飲食的一部分[3]。有研究指出冠狀動(dòng)脈心臟病的死亡率和飲食中黃酮類化合物的攝入量呈負(fù)相關(guān)[4]。槲皮素對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用在實(shí)驗(yàn)和臨床研究中都已經(jīng)被證實(shí)[5]。本次實(shí)驗(yàn)主要研究槲皮素在體內(nèi)的一級(jí)代謝物異鼠李素(Isorhamnetin)[6]是否對(duì)缺血再灌注損傷的心肌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖有影響,擬尋求其對(duì)心肌細(xì)胞起到的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

新生SD大鼠(出生24～48h之內(nèi)),體重 50-60g,雌雄兼用,由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：046)。

異鼠李素(M EDCO制藥有限公司,中國(guó));DMEM、II型膠原酶、透明質(zhì)酸酶(GIBCO公司,美國(guó));胰蛋白酶、HEPES和MTT(Sigma公司,美國(guó));胎牛血清(元亨金馬公司,中國(guó));兔抗Bcl-2(sc-7832)、兔抗Bax(sc-7480)、兔抗 p53(sc-126)、兔抗NF-κ B/p65(sc-8008)和抗兔 IgG(Santa Cruz,美國(guó));乳酸脫氫酶試劑盒(建成科技公司,中國(guó));BCA蛋白試劑盒、NE-PER核酸提取試劑盒和ECL底物發(fā)光試劑(百泰克公司,中國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 新生SD大鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)

將出生24～48h SD大鼠處死后取其心臟。取出心臟用預(yù)冷的PBS清洗血塊。剝?nèi)バ陌?剪碎后用混合酶在37℃下孵育消化25min,用200μ m孔徑濾網(wǎng)除去未消化的組織塊殘?jiān)?得到的細(xì)胞懸液離心,得到的細(xì)胞沉淀加入含有10%胎牛血清的 DMEM中重懸置于培養(yǎng)箱中(37℃,5%CO2)孵育45min后,輕輕吸出細(xì)胞懸液于離心管離心后重懸培養(yǎng),重復(fù)2次。最后純化的心室肌細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清,青霉素(100μ g?ml-1)和鏈霉素(100μ g?ml-1)的 DMEM 中,置于5%CO2,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 心肌細(xì)胞的缺血再灌注模型的建立

選取3d以后生長(zhǎng)良好的心室肌細(xì)胞,首先加入模擬缺血液置于缺氧裝置中通入95%N2+2.5%CO2混合氣體缺血缺氧24h。后棄去模擬缺血液,加入模擬再灌注液置于標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)環(huán)境下(5%CO2,37℃)再灌注培養(yǎng)1h。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組

心肌細(xì)胞以相同細(xì)胞數(shù)隨機(jī)分為三組,分別為：I/R-/Isor-,I/R+/Isor-和 I/R+/Isor+組。正常對(duì)照組(I/R-/Isor-)以10%胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng),用以評(píng)估I/R對(duì)心肌細(xì)胞的損傷程度。缺血再灌注組(I/R+/Isor-)：作為實(shí)驗(yàn)組1。缺血再灌注后異鼠李素處理組(I/R+/Isor+)：除加入模擬再灌注液外再加入了適量的異鼠李素,用以評(píng)估異鼠李素對(duì)缺血再灌注(I/R)損傷后心室肌細(xì)胞的保護(hù)作用,作為實(shí)驗(yàn)組2。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.4.1 MTT測(cè)定細(xì)胞活力

將心肌細(xì)胞(1×104個(gè)?孔-1)植入96孔板。在建立缺血再灌注模型后,分別用0,1,2,4,8,16和32μ M的濃度梯度的異鼠李素處理各組心肌細(xì)胞。37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)48h后,每孔加入5mg?ml-1MTT 10μ l培養(yǎng)4h,棄上清,加0.1ml二甲基亞砜,振蕩15min,酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)儀測(cè)定OD490。每個(gè)濃度重復(fù)4孔。

1.2.4.2 乳酸脫氫酶活力測(cè)定

分別在I/R-/Isor-,I/R+/Isor-和I/R+/Isor+組中檢測(cè)作為細(xì)胞損傷生化指標(biāo)之一的乳酸脫氫酶的釋放。整個(gè)檢測(cè)遵照試劑盒的產(chǎn)品說(shuō)明,在340nm下的吸光值即反映乳酸脫氫酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4.3 流式細(xì)胞術(shù)凋亡率測(cè)定

分別收集 I/R-/Isor-,I/R+/Isor-和I/R+/Isor+組心肌細(xì)胞1×106,70%預(yù)冷的乙醇固定[7]。固定的細(xì)胞用PBS洗兩次后用DNA萃取試劑在室溫下孵育5min。離心后,細(xì)胞在含碘化丙啶(20mg?l-1)和 RNA酶 A(1 g?l-1)的溶液中重懸避光孵育30min。然后將樣品放入FACS420流式細(xì)胞儀中測(cè)量DNA含量來(lái)估算每個(gè)樣品中細(xì)胞的凋亡率。所有檢測(cè)結(jié)果來(lái)自相同的儀器和相同的實(shí)驗(yàn)條件。

1.2.4.4 Western blot檢測(cè) Bcl-2、Bax、p53及 NF-kB/p65的表達(dá)

用胰酶消化I/R-/Isor-,I/R+/Isor-和I/R+/Isor+組心肌細(xì)胞,再以PBS洗兩次后,溶于含有亮胰蛋白酶肽(Leupeptin,10μ g?ml-1),抑肽酶(aprotinin,10μ g?ml-1)和苯甲基磺酰氟(PMSF,100μ g?ml-1)的細(xì)胞裂解液置于冰上30min后12000g離心10min。上清液既是整個(gè)細(xì)胞的提取物。核蛋白用NE-PER核蛋白萃取試劑進(jìn)行分離。以BCA蛋白檢測(cè)試劑盒定量后,調(diào)整至同一濃度。取50μ g上樣至12%濃縮膠和5%分離膠上,120V恒壓電泳1.5h。50V恒壓轉(zhuǎn)膜30min。將膜置于NC膜與5%脫脂牛奶和TBST封閉液中封閉1h。再將NC膜與 TBST 稀釋的一抗 Bax(1：400)、Bcl-2(1：400)、NF-κ B/p65(1：400)、p53(1：400)、β-actin(1：1000)進(jìn)行孵育4℃過夜。TBST洗膜三次,后將膜和辣根過氧化偶聯(lián)的二抗(1：10000)室溫孵育1h,洗膜三次,每次10min。在膜上加ECL化學(xué)發(fā)光劑,暗室觀察后用膠片(Kodak)曝光對(duì)免疫印跡進(jìn)行采集。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MT T檢測(cè)結(jié)果

相對(duì)于正常的I/R-/Isor-組,I/R+/Isor-組的心肌細(xì)胞生長(zhǎng)活力受到嚴(yán)重影響(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)觀察到異鼠李素對(duì)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)活力的雙重作用：異鼠李素的濃度在1-4μ M 范圍時(shí),隨著濃度的加大,細(xì)胞的活力逐漸增強(qiáng);當(dāng)濃度在8至32μ M 逐步增大時(shí),細(xì)胞活力逐漸減弱(見圖 1)。異鼠李素對(duì)缺血再灌注后心肌細(xì)胞的活力正面或負(fù)面的影響都存在一個(gè)濃度效應(yīng)而4μ M的異鼠李素可以有效的補(bǔ)救缺血再灌注對(duì)心肌細(xì)胞造成的損傷。本研究中的后續(xù)實(shí)驗(yàn)都基于此最適濃度(4μ M)。

圖1 不同濃度的異鼠李素對(duì)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

I/R-/Isor-與I/R+/Isor-相比：＊P＜0.05;I/R+/Isor+(4μ M)與I/R+/Isor-相比：＊＊P＜0.05。下同。

2.2 乳酸脫氫酶活力檢測(cè)

與正常對(duì)照組相比,I/R+/Isor-組乳酸脫氫酶的活力提高了近4倍,從5.9±0.7升至 24.1±2.3;異鼠李素處理后可明顯抑制乳酸脫氫酶的活力,降低近50%至 11.4±1.2。(P＜0.05)(見表 1)。

表1 乳酸脫氫酶活力檢測(cè)(,n=3)

表1 乳酸脫氫酶活力檢測(cè)(,n=3)

組乳酸脫氫酶活力(U?L-1)I/R-/isor- 5.9±0.7 I/R+/Isor- 24.1±2.3＊I/R+/isor+ 11.4±1.2＊＊

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

缺血再灌注處理后心肌細(xì)胞的凋亡率由5.8±0.96%升至21.4±1.56%(P＜0.05);而異鼠李素可以使這些細(xì)胞的凋亡率降至7.87±0.97%(P＜0.05)(見圖 2)。

圖2 心肌細(xì)胞凋亡率

2.4 Western blot檢測(cè)

缺血再灌注處理的I/R+/Isor-組心肌細(xì)胞bax表達(dá)量顯著上升而Bcl-2顯著下降;但在I/R+/Isor+組,異鼠李素處理后bcl-2表達(dá)量升高,相對(duì)bax表達(dá)量下降(見圖3 a)。因此,相對(duì)于I/R+/Isor-組,Bcl-2/Bax比率在異鼠李素處理后得到顯著上升。此外I/R+/Isor-組心肌細(xì)胞p53的表達(dá)上調(diào),在經(jīng)異鼠李素處理后表達(dá)量開始下降(見圖3 c)。

另外,利用NE-PER核蛋白萃取試劑得到全部的核蛋白,Western blot分析顯示缺血再灌注可以明顯誘導(dǎo)NF-κ B/p65在核內(nèi)的大量聚集,異鼠李素可減少該蛋白在核內(nèi)的聚集,表明異鼠李素能阻斷 NF-κ B信號(hào)通路(見圖3b)。

圖3 Western blot檢測(cè)

3 討論

缺血再灌注損傷和氧自由基的形成有關(guān)[8]。這種過氧化作用導(dǎo)致了無(wú)氧代謝和細(xì)胞死亡的標(biāo)記物乳酸脫氫酶的釋放[9]。Bao和 Lou證實(shí)異鼠李素對(duì)氧化修飾低密度脂蛋白(LDL)引起的體外內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[10]。另有研究指出蓮屬堅(jiān)果醛的雄蕊中分離出的異鼠李素還具有清除氧自由基和過氧亞硝酸鹽陰離子(ONOO)的能力[11]。我們研究發(fā)現(xiàn),在I/R+/Isor-組我們檢測(cè)到乳酸脫氫酶的活力上升。經(jīng)異鼠李素處理后,乳酸脫氫酶的活力受到抑制。而且I/R+/isor-組的心肌細(xì)胞出現(xiàn)了大量的凋亡,其凋亡率是對(duì)照組的4倍;但是異鼠李素也使心肌細(xì)胞的存活率明顯提高。細(xì)胞水平的這種結(jié)果導(dǎo)出了一個(gè)假設(shè)：異鼠李素通過抑制凋亡來(lái)完成它的保護(hù)任務(wù)和發(fā)揮抗氧化作用。

為了探討異鼠李素潛在的抗凋亡機(jī)制,我們首先檢測(cè)了四個(gè)典型的與凋亡相關(guān)的蛋白。

Bcl-2家族中的蛋白兼具有促凋亡和抗凋亡的作用。該家族的數(shù)個(gè)蛋白中,Bcl-2具抗凋亡作用,同時(shí)Bax被視為具促凋亡作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2/Bax的比率在包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[13]。最近研究顯示降低Bcl-2/Bax比率可以顯著的增加凋亡率。在本實(shí)驗(yàn)I/R+/isor+組,則檢測(cè)到Bcl-2/Bax比率的升高。

據(jù)報(bào)道,NF-κ B在心臟缺血再灌注過程中起了關(guān)鍵作用,作為多向調(diào)節(jié)性的核轉(zhuǎn)錄因子,近年發(fā)現(xiàn)其廣泛調(diào)控與免疫反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因。Maulik等發(fā)現(xiàn)急性缺血再灌注可誘導(dǎo)NF-κ B的活化和心肌細(xì)胞的凋亡及抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)減少[14]。而NF-κ B信號(hào)通路的激活依賴于 NF-κ B/p65從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位[13]。本實(shí)驗(yàn)顯示經(jīng)異鼠李素處理后NF-κ B/p65在心肌細(xì)胞核的積累減少,凋亡也明顯的減少,顯示異鼠李素的抗凋亡作用和NF-κ B信號(hào)通路有很大關(guān)系。

在細(xì)胞各個(gè)方面都發(fā)揮重要作用的p53在過去幾十年得到了廣泛的研究[15]。上調(diào)p53通過刺激bax的表達(dá)或者抑制bcl-2的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡[16]。此外,研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷在包括心臟在內(nèi)的不同器官和組織中與p53的激活有關(guān)[17-19]。在凋亡的心肌細(xì)胞中還觀察到作為p53轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)的Bax也同時(shí)增加[20]。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示異鼠李素抑制了p53的表達(dá),這可能和下調(diào)bax表達(dá)有關(guān)系[18,21]。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,我們揭示了缺血再灌注損傷后異鼠李素對(duì)心肌細(xì)胞可能的保護(hù)作用,同時(shí)異鼠李素對(duì)缺血再灌注損傷的心肌細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制之一是通過抗凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

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