蘇 靜,孫際童,劉 寧,鐘加滕,劉 菲,于慧美,康勁松

(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系,吉林長春130021)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,基因突變導(dǎo)致的細(xì)胞周期失控及抗凋亡能力增加是其發(fā)生的主要原因[1]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度高,預(yù)后差,傳統(tǒng)的放療、化療及手術(shù)治療在內(nèi)的綜合療法均不能解決腫瘤的惡化轉(zhuǎn)移問題。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)具有誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和抑制凋亡的作用,作為Janus激酶(Janus kinase,JAK)-STAT途徑中JAK激酶的底物,STAT3的酪氨酸殘基被磷酸化形成二聚體入核后啟動基因轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞因子(cytokine,CK)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵性的作用[2]。已有研究證明,在多種腫瘤包括膠質(zhì)瘤中,STAT3及其下游基因包括cyclinD1、c-Myc、Bcl-2和VEGF等常顯示異常表達(dá)或活性增強(qiáng)[3]。RNA干擾(RNAi)是一種轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。它能觸發(fā)某種轉(zhuǎn)錄后監(jiān)控程序,導(dǎo)致特異的 mRNA單鏈降解[4]。本實(shí)驗(yàn)利用pSilencer 1.0-U6-siRNA-STAT3重組質(zhì)粒有效抑制人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá),并觀察其對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的U251細(xì)胞損傷作用的影響,希望為膠質(zhì)瘤臨床治療提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞和大腸埃希菌JM109由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系提供;帶有U6啟動子的質(zhì)粒載體(pSilencer-1.0-U6)購自美國Ambion公司;新生小牛血清、IMDM培養(yǎng)基購自Hyclone公司;膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶、APAⅠ、EcoRⅡ和H indⅢ限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒提取試劑盒、RTPCR相關(guān)試劑及寡核苷酸合成均購自Takara公司;STAT3、pSTAT3、Bcl-2、Bax、β-actin 抗體,辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗均購自Santa Cruz公司;脂質(zhì)體(lipofectamine2000)、Trizol試劑購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3構(gòu)建及鑒定根據(jù)genebank(NM 31500)人STAT3基因mRNA的已知序列和本實(shí)驗(yàn)室前期工作,確定合適的靶位點(diǎn)(2143-2162)。寡核苷酸鏈序列:GCAGCAGCTGAACAACATG;siRNA模板:sense:5'-GAT CCG CAG CAG CTG AAC AAC ATG TTC AAG AGA CAT GTT GTT CAG CTG CTG CTT TTT TGG AAA-3';antisense:5'-AGC TTT TCC AAA AAA GCA GCA GCT GAA CAA CAT GTC TCT TGA ACA TGT TGT TCAGCT GCT GCG-3'。pSilencer1.0-U6經(jīng)APAⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶線性化,在T4 DNA連接酶的作用下與退火后形成的雙鏈結(jié)構(gòu)連接,形成 pSilencer1.0-U6-siRNASTAT3重組質(zhì)粒。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將U251細(xì)胞(1×106個(gè))分別接種于100 ml培養(yǎng)瓶中(10%小牛血清IMDM培養(yǎng)液,37℃,5%CO2),培養(yǎng)至80%-90%細(xì)胞融合。用無血清培養(yǎng)液洗3遍,將重組質(zhì)粒pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3按脂質(zhì)體(Lipofectamine 2000)使用說明操作,培養(yǎng)4 h后(無血清IMDM培養(yǎng)液,37℃,5%CO2),棄上清,加入含10%小牛血清培養(yǎng)液及給藥后繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí),收集細(xì)胞備用。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 實(shí)驗(yàn)共分4組,對照組:轉(zhuǎn)染 pSilencer1.0-U6質(zhì)粒;STAT3-SiRNA組:轉(zhuǎn)染pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3質(zhì)粒;H2O2組:轉(zhuǎn)染pSilencer1.0-U6質(zhì)粒4 h后加入H2O2(終濃度為1 mmol/L)給藥 24 h;STAT3-SiRNA+H2O2組:轉(zhuǎn)染pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3質(zhì)粒4 h后加入H2O2(終濃度為1 mmol/L)給藥24 h。

1.2.4 亞甲基四唑藍(lán)(MTT)比色法檢測細(xì)胞生存率 取對數(shù)生長的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板,按細(xì)胞數(shù)1×104/well種入細(xì)胞,待細(xì)胞長滿孔底90%時(shí)按上述方法轉(zhuǎn)染給藥,每組設(shè)5復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h加MTT(5 mg/ml)20 μ l/well,37 ℃孵育4 h后吸出所有液體加入二甲基亞砜(DMSO)150 μ l/well,室溫孵育15 min,全自動酶標(biāo)儀(波長570 nm)檢測各孔的吸光度,計(jì)算細(xì)胞生存率。結(jié)果應(yīng)用SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5 Western-blot檢測蛋白表達(dá) 用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白,Biofrad法蛋白定量,進(jìn)行Westernblot分析:取30 μ g總蛋白上樣,實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)天能凝膠成像系統(tǒng)攝像、進(jìn)行灰度值分析。

1.2.6 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 U251細(xì)胞接種于預(yù)先放置蓋玻片的24孔板中,按前述方法轉(zhuǎn)染給藥。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)用冷PBS沖洗3次,冷4%中性多聚甲醛固定20 min,室溫干燥過夜。干燥后蓋玻片-20℃保存。按TUNEL使用說明書染色。熒光顯微鏡下成像,激發(fā)波長為450-500 nm,檢測波長為515-565 nm(綠色熒光)。按說明書設(shè)立陰性對照。計(jì)算細(xì)胞凋亡率。每組重復(fù)3次。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件分析。計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。單變量配對資料之間的比較采用配對樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3能夠有效抑制STAT3在U251細(xì)胞中的表達(dá)

Western-blot結(jié)果顯示,與對照組相比,STAT3-SiRNA組U251細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)明顯下降,對結(jié)果進(jìn)行灰度分析,蛋白表達(dá)降低53.7±6.2%(P＜0.05,n=3)(見圖1)。

2.2 抑制STAT3表達(dá)對H2O2作用下U251細(xì)胞生存率的影響

MTT結(jié)果顯示,與對照組相比,H2O2組細(xì)胞生存率為53.8±6.2%(P＜0.05,n=3);STAT3-SiRNA+H2O2組生存率為32.3±11.6%,明顯低于對照組和H2O2組(P＜0.05,n=3)(見圖2)。

2.3 TUNEL法檢測抑制STAT3表達(dá)對H2O2作用下U251細(xì)胞凋亡的影響

使用TUNEL法檢測抑制STAT3表達(dá)和H2O2作用引起U251細(xì)胞發(fā)生凋亡的情況。熒光顯微鏡下觀察,細(xì)胞核呈綠色熒光為凋亡陽性細(xì)胞。TUNEL結(jié)果顯示:與對照組相比,H2O2組細(xì)胞凋亡率(17.0±4.3%)明顯增加(P＜0.05,n=3);STAT3-SiRNA+H2O2組細(xì)胞凋亡率(27.8±8.6%)明顯高于H2O2組(P＜0.05,n=3)。

2.4 凋亡相關(guān)蛋白BCL-2和BAX表達(dá)變化

Western-blot結(jié)果顯示,與對照組(1.0±0.08)相比,H2O2組BCL-2與BAX蛋白表達(dá)之比(0.56±0.11)明顯降低(P＜0.05,n=3);與H2O2組相比,STAT3-SiRNA+H2O2組BCL-2與BAX蛋白表達(dá)之比(0.32±0.14)明顯降低(P＜0.05,n=3)(見圖3)。

圖1 STAT3-SiRNA重組質(zhì)粒對U251細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)的影響

圖2 抑制STAT3表達(dá)對H2O2作用下U251細(xì)胞生存率的影響

圖3 抑制STAT3表達(dá)對H2O2作用下U251細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白BCL-2和BAX表達(dá)的影響

3 討論

活性氧H2O2是體內(nèi)氧化代謝的中間產(chǎn)物,易通過細(xì)胞膜產(chǎn)生細(xì)胞毒性,引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞死亡,常用于復(fù)制細(xì)胞氧化損傷模型[5]。STAT3可被多種細(xì)胞因子和生長因子激活,在胚胎發(fā)生和早期發(fā)育過程中具有不同的功能。在腫瘤發(fā)生過程中,常存在由蛋白酪氨酸激酶(PTKs)異常激活導(dǎo)致的STAT3的異?；罨痆6]。近來研究發(fā)現(xiàn),在多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和頭頸部腫瘤中STAT3持續(xù)激活[3]。利用反義寡核苷酸抑制STAT3表達(dá)或STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道抑制劑,均能降低細(xì)胞生存率,誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是一種轉(zhuǎn)錄后的基因沉默,能夠觸發(fā)某種轉(zhuǎn)錄后監(jiān)控程序,導(dǎo)致特定mRNA單鏈降解,調(diào)控特定基因的表達(dá)[4]。我們利用RNAi技術(shù)特異性抑制STAT3表達(dá),觀察其對氧化應(yīng)激損傷U251細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,我們設(shè)計(jì)構(gòu)建合成的pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞,能夠有效抑制STAT3蛋白表達(dá)(抑制率＞50%)。有效抑制STAT3表達(dá)能降低U251細(xì)胞生存率、增加細(xì)胞凋亡率,同時(shí)降低凋亡相關(guān)蛋白BCL-2和BAX表達(dá)比值。氧化應(yīng)激損傷U251細(xì)胞模型中,抑制STAT3表達(dá),進(jìn)一步降低細(xì)胞生存率,增加細(xì)胞凋亡,使BCL-2和BAX表達(dá)比值降低。最近的研究已經(jīng)證實(shí)STAT3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系都存在異常持續(xù)性激活,在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增殖、分化和進(jìn)展過程中具有重要的作用[3]。在我們的研究工作中,得到如下結(jié)論:有效抑制STAT3表達(dá)能降低神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生存率,并增加其對氧化應(yīng)激損傷的敏感性。

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