管小虹，鄧慧敏，林中祥

(1.中山大學(xué)測試中心，廣東 廣州 510275；2.南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037)

電噴霧電離(ESI)技術(shù)，在分析生物大分子(蛋白質(zhì)，核酸)與藥物小分子的相互作用方面具有獨(dú)特優(yōu)勢:能夠直接反映液相中分子間的非共價(jià)鍵相互作用，并具有快速、靈敏、可直接觀測到復(fù)合物化學(xué)結(jié)合計(jì)量比等特點(diǎn)[1]。近年來，DNA作為藥物篩選的靶模型已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注，研究DNA與藥物的相互作用對(duì)藥物作用機(jī)理闡釋及體外篩選有重要意義[1-4]。脫氫樅胺是重要的松香改性產(chǎn)品、屬于三環(huán)菲結(jié)構(gòu)的光學(xué)活性堿。脫氫樅胺及其衍生物已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、殺菌、染料、表面活性等領(lǐng)域[5]。對(duì)于脫氫樅胺類衍生物，已有的文獻(xiàn)大多是探討它們的合成方法及應(yīng)用，關(guān)于脫氫樅胺類化合物與DNA相互作用的研究少有報(bào)道。本文采用電噴霧質(zhì)譜法研究了有望開發(fā)成新型藥物的N-苯甲酰基-脫氫樅胺-7-酮(NBDO)[6]與4種DNA——dC6，dT6，dA6及d(AT)3的相互作用，討論了NBDO-DNA復(fù)合物的存在形式以及NBDO與DNA的結(jié)合方式。本文的工作對(duì)于進(jìn)一步深入探討N-苯甲酰基-脫氫樅胺-7-酮與DNA的相互作用機(jī)制和研發(fā)N-苯甲?；?脫氫樅胺-7-酮類藥物具有重要的意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LCQDECAXP電噴霧質(zhì)譜儀(美國Thermo-Finnigan公司)，Xcalibur 1.3數(shù)據(jù)處理軟件。甲醇(色譜純)購自美國Merck公司，超純水(自制)。dC6(相對(duì)分子質(zhì)量為1 674.2)，dT6(相對(duì)分子質(zhì)量為1 764.2)，dA6(相對(duì)分子質(zhì)量為1 818.2)，d(AT)3(相對(duì)分子質(zhì)量為1 791.2)購自上海英駿(invitrogen)生物技術(shù)有限公司。N-苯甲?；?脫氫樅胺-7-酮(NBDO，相對(duì)分子質(zhì)量為403，結(jié)構(gòu)見圖1)由南京林業(yè)大學(xué)林中祥教授實(shí)驗(yàn)室合成。

圖1 N-苯甲?；?脫氫樅胺-7-酮的結(jié)構(gòu)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

噴霧電壓3 kV，毛細(xì)管溫度250 ℃，鞘氣流速15 arb，毛細(xì)管電壓18 V， MS/MS碰撞氣為氦氣，相對(duì)碰撞能15%～20%，負(fù)離子方式掃描。

dC6，dT6，dA6，d(AT)3分別用超純水溶解，NBDO用甲醇溶解，以上各樣品均配成1.0×10-4mol/L溶液。將NBDO與DNA溶液按體積比1∶1混合后，用注射泵直接導(dǎo)入ESI-MS離子源，流速為2 μL/min。

2 結(jié)果與討論

圖2為NBDO與DNA混合液的電噴霧質(zhì)譜圖。由圖2可知， NBDO與dC6，dT6，dA6，d(AT)3均可發(fā)生相互作用形成非共價(jià)復(fù)合物,且復(fù)合物離子主要以-4價(jià)形式存在。圖2 A-D中的m/z518.1(100%)、m/z540.5(90%)、m/z554.0(50%)、m/z547.3(50%)分別為[NBDO+dC6-4H]4-、[NBDO+dT6-4H]4-、[NBDO+dA6-4H]4-、[NBDO+d(AT)3-4H]4-離子峰，這4種復(fù)合物離子的相對(duì)豐度及圖2給出的其他質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明，以化學(xué)計(jì)量比1∶1形成的-4價(jià)復(fù)合物離子[NBDO+DNA-4H]4-比所有其他形式的復(fù)合物離子都更加穩(wěn)定。此外，NBDO與dT6還可形成更高價(jià)態(tài)(-5價(jià))的復(fù)合物離子[NBDO+dT6-5H]5-(m/z432.5)和[(NBDO)2+dT6-5H]5-(m/z512.8)(見圖2B)；DNA分子中含有較多磷酸基團(tuán)，在ESI-MS負(fù)電離模式下，容易失去多個(gè)質(zhì)子形成多電荷負(fù)離子；相比之下，NBDO則較難負(fù)電離且只產(chǎn)生單電荷負(fù)離子，因此，NBDO-DNA復(fù)合物多電荷離子的形成主要取決于DNA分子的性質(zhì)，復(fù)合物所帶的多個(gè)電荷主要分布在DNA分子端。NBDO與dC6，dT6，dA6還可以形成化學(xué)計(jì)量比為2∶1的復(fù)合物[(NBDO)2+dC6-4H]4-(m/z618.8)、[(NBDO)2+dT6-4H]4-(m/z641.2)和 [(NBDO)2+dA6-4H]4-(m/z654.8)。NBDO與4種DNA形成的復(fù)合物在離子價(jià)態(tài)及化學(xué)結(jié)合計(jì)量比方面存在的差異，與4種DNA的分子組成及結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。NBDO與DNA分子中，分別具有酰胺基、羰基、氨基、磷酸基等極性官能團(tuán)，因此容易通過分子間氫鍵作用形成非共價(jià)復(fù)合物[7-9]。

表1列出了對(duì)以[NBDO+DNA-4H]4-為母離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離(CID)分析得到的二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果。表1數(shù)據(jù)顯示，[NBDO+DNA-4H]4-發(fā)生裂解所需的碰撞能不超過20%，且4種不同[NBDO+DNA-4H]4-復(fù)合物離子具有相同的裂解方式。根據(jù)4種[NBDO+DNA-4H]4-離子的二級(jí)質(zhì)譜都產(chǎn)生-3和-4價(jià)的DNA分子離子以及-1價(jià)的NBDO分子離子、且NBDO分子負(fù)電離程度不高的結(jié)果推測，[NBDO+DNA-4H]4-復(fù)合物離子的形成可能有兩種方式：①由中性NBDO分子與-4價(jià)DNA分子離子通過非共價(jià)鍵作用形成；②由-1價(jià)NBDO分子離子與-3價(jià)DNA分子離子通過非共價(jià)鍵作用形成。

圖2 NBDO與dC6(A) , dT6 (B) , dA6 (C) , d(AT)3 (D)摩爾比為1∶1混合液的電噴霧負(fù)離子質(zhì)譜圖

表1 [NBDO+DNA-4H]4-的MS/MS譜圖數(shù)據(jù)

Table 1 ESI-MS/MS analyses of [NBDO+DNA-4H]4-

母離子/(m/z)子離子/(m/z)/(相對(duì)豐度%)碰撞能量/%[NBDO+dC6]4-/(518.1)dC3-6/(556.7)/(15)18dC4-6/(417.3)/(100)[NBDO-H]-/(402.2)/(5)[NBDO+dT6]4-/(540.5)dT3-6/(586.7)/(70)15dT4-6/(439.8)/(100)[NBDO-H]-/(402.2)/(10)[NBDO+dA6]4-/(554.0)dA3-6/(604.7)/(90)20dA4-6/(453.3)/(100)[NBDO-H]-/(402.2)/(10)[NBDO+d(AT)3]4-/(547.3)d(AT)33(595.6)/(100)18d(AT)4-3/(446.5)/(80)[NBDO-H]-/(402.3)/(12)

3 結(jié) 論

N-苯甲?；?脫氫樅胺-7-酮與dC6，dT6，dA6，d(AT)3可通過非共價(jià)鍵作用形成化學(xué)結(jié)合計(jì)量比1∶1和2∶1的復(fù)合物，這些復(fù)合物在電噴霧方式下電離可產(chǎn)生[NBDO+DNA-3H]3-,[NBDO+DNA-4H]4-,[NBDO+DNA-5H]5-,[(NBDO)2+DNA-4H]4-,[(NBDO)2+DNA-5H]5-等多種不同形式的離子，其中[NBDO+DNA-4H]4-為豐度最強(qiáng)和最穩(wěn)定的復(fù)合物離子。[NBDO+DNA-4H]4-離子可能由[NBDO-H]-與[DNA-3H]3-和NBDO與[DNA-4H]4-兩兩之間發(fā)生分子間相互作用而形成。

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