陳 劍 ，武 華 ，陳春華

（1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普外科，山西太原 030001；3.江西省武寧縣人民醫(yī)院，江西武寧 332300）

大腸癌動物模型是大腸癌實驗研究的基礎(chǔ)。動物模型的構(gòu)建，不僅是研究腫瘤預(yù)防的重要基礎(chǔ)，還可用于大腸癌發(fā)生、發(fā)展及治療等方面的研究。利用二甲基肼（1,2-dimethylhydrazine，DMH）作為工具藥誘導(dǎo)大鼠大腸癌，這種前致癌物為結(jié)直腸癌動態(tài)和治療性研究提供大量的動物模型[1-4]。如果以應(yīng)用二甲基肼為基礎(chǔ)，增加其他致癌因素作用于大鼠可提高大腸癌的誘發(fā)率，將有效縮短造模周期并節(jié)約成本。本實驗分別以二甲基肼誘導(dǎo)、環(huán)磷酰胺抑制免疫為基礎(chǔ)，應(yīng)用大腸癌細(xì)胞腸黏膜下注射，以建立一種成功率高且可靠的大腸癌動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 二甲基肼（購自Sigma公司）分子量：133.2；顏色：灰白色，4℃避光保存。SW480大腸癌細(xì)胞株（山西醫(yī)科大學(xué)生化教研室贈），環(huán)磷酰胺200 mg/支（購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）。

1.1.2 動物 4周齡Wistar大鼠60只，清潔級，近交系，雄性，購自山西醫(yī)科大學(xué)動物中心。隨機(jī)分成三組：二甲基肼組23只，環(huán)磷酰胺組23只，對照組14只，實驗過程中出現(xiàn)死亡不計入實驗。

1.2 方法及處理

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人大腸癌細(xì)胞株SW480采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后收集，以胎盤藍(lán)檢測細(xì)胞活性大于90%以上，加適量不含血清的RPMI 1640營養(yǎng)液配置成濃度為1×106個/ml的懸液備用。

1.2.2 二甲基肼組 將二甲基肼用生理鹽水配成1%溶液，用4%NaOH溶液調(diào)成pH值為6.5～7.0，抽濾除菌，大鼠頸部皮下注射，30 mg/kg，1次/周，每周測體重1次，據(jù)體重調(diào)整劑量，至第8周末，按文獻(xiàn)[5]的方法取大腸癌細(xì)胞懸液0.2 ml注入背側(cè)肛門緣上2 mm直腸黏膜下；對照組僅皮下注射二甲基肼8周。

1.2.3 環(huán)磷酰胺組 取環(huán)磷酰胺用生理鹽水配成10%溶液，200mg/kg，大鼠腹腔內(nèi)注射，24 h后直腸黏膜下注射癌細(xì)胞，方法同二甲基肼組。

三組大鼠術(shù)前皆禁飲食 12 h，10%水合氯醛（0.3 ml∶100 g）腹腔內(nèi)注射麻醉。

1.2.4 飼養(yǎng)條件及觀察 大鼠于室溫，12 h光照條件下飼養(yǎng)，自由飲水，癌細(xì)胞注射后繼續(xù)飼養(yǎng)2周，觀察實驗期間大鼠的一般生長情況，如體重變化、運(yùn)動情況、腹部體征等，著重觀察肛門有無紅腫、糜爛、結(jié)節(jié)、大便性狀改變。

2周后處死大鼠，打開腹腔，觀察有無腹水、粘連、臟器轉(zhuǎn)移等情況，切取整段結(jié)直腸用生理鹽水沖洗干凈，計算腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)目、大小，測量瘤體橫徑。標(biāo)本用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，HE染色，連續(xù)切片，光鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，χ2檢驗比較組間、組內(nèi)造模成功率差別，樣本總數(shù)＜40例或理論頻數(shù)＜1時，用Fisher精確概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠用藥后的生長狀況

注射二甲基肼后，大鼠未見明顯異常反應(yīng)；腹腔內(nèi)注射環(huán)磷酰胺，出現(xiàn)短暫不適，0.5 h后恢復(fù)；注射癌細(xì)胞后逐漸出現(xiàn)活動量明顯減少，精神萎靡，體重增長緩慢或停滯，毛發(fā)脫落，失去光澤，進(jìn)食減少，部分大鼠出現(xiàn)腹瀉、排便困難等情況。

2.2 取材后大體觀察

實驗結(jié)束取標(biāo)本時，實驗組可見大鼠直腸變硬，管腔變小，黏膜粗糙、充血水腫，皺褶變粗而不規(guī)則，組織變脆，可見結(jié)節(jié)狀隆起，大小不等，色暗紅，個別結(jié)節(jié)表面出血、壞死及或潰瘍。結(jié)節(jié)多見于癌細(xì)胞注射處，腫塊多為單發(fā)，腫塊周圍血管豐富，少數(shù)大鼠出現(xiàn)腸外組織浸潤，未見遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶，其中有2只大鼠腫塊穿透腸壁與周圍組織形成粘連梗阻并少量腹水，4只大鼠癌腫直徑達(dá)1.0 cm，對照組4只大鼠降結(jié)腸可見結(jié)節(jié)形成，均為多發(fā)。其余大鼠大腸黏膜欠光滑并充血水腫，皺褶不規(guī)則，未見結(jié)節(jié)形成。

2.3 HE染色觀察

大腸標(biāo)本病理診斷有正常組織、不典型增生、腺癌，大腸癌總誘導(dǎo)率為32.7%，腸壁內(nèi)腫塊占96.0%。結(jié)節(jié)光鏡下可見黏膜腺上皮擁擠增生或變淺消失，多呈高柱狀排列，細(xì)胞核極性消失或分裂，濃染，演變?yōu)榘┘?xì)胞，并以單層或多層排列，腺腔極不規(guī)則，局部有帶蒂的間質(zhì)突入腔內(nèi)，彌漫于黏膜下層，并向肌層浸潤生長，為典型的腺癌改變。實驗結(jié)束時52只大鼠完成實驗，共有19只在大腸壁上發(fā)現(xiàn)不同時期的結(jié)節(jié)，病理診斷為腺癌共17只。實驗組：侵入黏膜下層16只，其中穿透漿肌層2只；對照組：不典型增生3只，原位腺癌1只。見表1。

表1 大鼠大腸結(jié)節(jié)病理分型和誘導(dǎo)成功率（只）

三種造模方法總體成功率差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義 （χ2=6.024，P＜0.01），二甲基肼組與環(huán)磷酰胺組、二甲基肼組與對照組相比，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），環(huán)磷酰胺組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生及發(fā)展是一個多步驟、多階段、多基因參與的過程，是飲食、環(huán)境、遺傳、疾病等多因素相互作用的結(jié)果[6]。其主要造模方法可分為：DMH化學(xué)誘導(dǎo)法，腫瘤細(xì)胞種植法。DMH是一種有效誘導(dǎo)結(jié)腸癌動物模型的致癌原[7]，致癌作用確切，且有誘發(fā)大腸癌的特異性，其本身無毒，通過肝臟轉(zhuǎn)化后轉(zhuǎn)變成活性陽離子，并隨膽汁排泄進(jìn)入消化道，在結(jié)腸黏膜處發(fā)揮間接致癌活性[8]，促進(jìn)大腸癌的發(fā)生。目前常用的化學(xué)致癌物主要包括DMH、蘇木素、氧化偶氮甲烷、二甲基聯(lián)苯胺和黃曲霉素等，主要通過皮下注射給藥，其中有些藥物在誘發(fā)大腸癌的同時?？烧T發(fā)其他部位的腫瘤[9-10]。因此，DMH被更多地應(yīng)用于大腸癌模型的構(gòu)建。

另一種造模方法：腫瘤細(xì)胞種植法。SW480細(xì)胞株為人結(jié)腸高分化腺癌細(xì)胞株，直接在大鼠上種植其成瘤率偏低[11]，而它在裸鼠大腸癌模型的建立中使用最常見，且多見于皮下種植或結(jié)腸漿膜下種植，條件要求較高，操作相對復(fù)雜。另外小鼠壽命短，且免疫功能差，自然條件下易并發(fā)肺部感染死亡，而無法完成相對需時較長的實驗研究；而機(jī)體的免疫功能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，當(dāng)宿主免疫功能低下或受抑制時，腫瘤發(fā)生率增高，而在腫瘤進(jìn)行性生長時腫瘤患者的免疫功能受抑制，二者互為因果[12]。大鼠自然免疫系統(tǒng)較完善，所以造模前應(yīng)用環(huán)磷酰胺。它的主要毒副作用是免疫抑制，在作用于腫瘤細(xì)胞的同時也殺傷正常組織細(xì)胞，特別是生長旺盛的血液、淋巴組織細(xì)胞，而這些組織細(xì)胞是機(jī)體免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，破壞了機(jī)體的免疫系統(tǒng)，腫瘤就會迅速發(fā)展[13-15]。

在選擇模型動物時，與小鼠相比，大鼠價格便宜，環(huán)境要求低，飼養(yǎng)簡單，但自然條件下發(fā)生腫瘤是極少見的，如何克服這一困難對于腫瘤的成功誘導(dǎo)很關(guān)鍵。本實驗選取Wistar大鼠作為模型動物及以DMH、環(huán)磷酰胺作為基礎(chǔ)用藥。閱讀文獻(xiàn)可知：DMH用藥量為20～40 mg/kg不等，注射方法選取的部位不盡相同，有頸部皮下、腹部及背部皮下等；模型構(gòu)建成功率也不盡相同，為20%～70%不等，因此，找到一種方法簡單、成功率高、模型性質(zhì)穩(wěn)定的方法頗為重要。本實驗應(yīng)用經(jīng)肛直腸黏膜下注射，對大鼠機(jī)體影響小，從而減小了混雜因素的干擾，亦符合大腸癌發(fā)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在大鼠皮下注射DMH 8周后，直腸黏膜形成炎性水腫狀態(tài)下腸黏膜屏障受到破壞時注射腫瘤細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞更易定植于黏膜下，使造模成功率提高[16]。

在二甲基肼基礎(chǔ)上種植癌細(xì)胞，兩種促癌因素的作用下更加符合腫瘤發(fā)生的多因素和多階段性，從實驗結(jié)果來看，此方法不失為構(gòu)建大腸癌模型的一種有效可行的造模方法；而大鼠大腸癌模型對評估人類結(jié)腸癌非常有價值，在研究腫瘤生物學(xué)和治療中的重要性已經(jīng)顯現(xiàn)[17-18]，但由于實驗時間短，未能就癌腫進(jìn)一步浸潤、轉(zhuǎn)移等問題做更進(jìn)一步的研究。

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