王昇 石來鳳 阿力騰才斯克 趙曉鳳 新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所

L-羥脯氨酸是人體非必需氨基酸，是膠原蛋白（動物水解蛋白）特有的氨基酸，占正常膠原蛋白氨基酸總量的10%以上，是衡量機體膠原含量的一個重要指標(biāo)，牛奶中不含此氨基酸。

動物水解蛋白是一種廉價的工業(yè)原料，最常見的就是皮革粉。將其摻入牛奶或奶粉中可提高蛋白質(zhì)的含量。如果人食用摻入動物水解蛋白的產(chǎn)品，則會導(dǎo)致消化不良，吸收利用率降低，從而影響人體健康。

1 測定原理

試樣經(jīng)酸水解后，過濾，用稀鹽酸溶解，注入氨基酸分析儀進(jìn)行測定。采用外標(biāo)法定量。

2 試劑與材料

2.1 除非另有規(guī)定，應(yīng)選用優(yōu)級純試劑和符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。

2.2 鹽酸7.8mol/L，將650mL優(yōu)級純的濃鹽酸小心倒入350mL超純水中，混勻。

2.3 配制茚三酮顯色液，方法如表1所示。

2.4 配制苯酚水溶液（5.0%，w/v）：稱取苯酚5.0g，溶于100mL水中。

2.5 配制鹽酸溶液（0.1 mol/L）：量取鹽酸（7.8mol/L）16.6mL，倒入1000mL水中。

2.6 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99%。

2.7 配制L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取100mg（精確到0.1mg）羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，用鹽酸溶液（0.1mol/L）溶解并定容至100mL容量瓶中。該溶液的濃度為1000mg/L，于4℃冰箱內(nèi)貯存，有效期3個月。

2.8 準(zhǔn)備苯酚溶液。

2.9 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.00mL于100mL的容量瓶內(nèi)，用鹽酸溶液（0.1mol/L）定容。該溶液的濃度為10.00mg/L，于4℃冰箱內(nèi)貯存，有效期1周。

3 儀器與設(shè)備

L-8900氨基酸自動分析儀、電熱恒溫干燥箱、配有聚四氟乙烯密封蓋的水解管、電子天平（精確到0.0001g）、定量濾紙、0.45μm水性樣品過濾器（直徑13mm）、氮吹儀。

4 分析步驟

4.1 樣品處理

稱取1～2g（精確至0.001g）牛奶樣品于水解管中，加8.00mL鹽酸，滴入3滴苯酚溶液，用一級水補足10.00mL，充氮后封管，置于110℃烘箱中保持22～24h，冷卻后經(jīng)濾紙過濾。取0.400mL濾液于氮吹儀上吹干，殘留物用2.00mL鹽酸溶液（0.1mol/L）溶解，過0.45μm濾器，備用。同時做空白對照。

表1 日立L-8900型氨基酸分析儀茚三酮溶液的配制方法

4.2 樣品測定

4.2.1 氨基酸分析儀條件

①分離柱：6 0 m m×4.6 m m（i.d）不銹鋼柱，交換樹脂為氨基酸分析專用樹脂；②柱溫：反應(yīng)柱57℃、分離柱135℃；③泵流速：泵10.400mL/min、泵20.350mL/min；④進(jìn)樣體積：20μL；⑤檢測波長：440nm；⑥茚三酮顯色液：可按表1配制，也可根據(jù)儀器自身要求配制；⑦流動相緩沖液：可按照表2配制，也可根據(jù)儀器自身要求配制。

4.2.2 定量測定

按照外標(biāo)法進(jìn)行定量計算。

5 結(jié)果計算和表述

試樣中L-羥脯氨酸的含量X，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)mg/kg表示，單點校正按下式計算：

式中：

V1— 加入稀鹽酸溶液定容的體積，mL；

V2— 水解液的定容體積，mL；

V3—水解樣液的取樣量，mL；

AS—L—羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液對應(yīng)的色譜峰面積響應(yīng)值；

A — 試樣溶液對應(yīng)的色譜峰面積響應(yīng)值；

CS— L—羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，Hg/mL；

m — 試樣質(zhì)量，g。

平行測定結(jié)果用算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留3位有效數(shù)字。

6 重復(fù)性

在同一實驗室由同一操作人員使用同一儀器完成的2個平行測定的相對偏差不大于10%。

表2 日立L—8900型氨基酸分析儀流動相緩沖溶液的配制方法

表3 生鮮乳中動物水解蛋白添加回收率結(jié)果（上機測定液中）

表4 生鮮乳中加標(biāo)重復(fù)性測定結(jié)果

7 L-羥脯氨酸的添加回收率測定

選擇未添動物水解蛋白的生鮮乳樣品，再分別添加不同量的動物水解蛋白，測定添加回收率，實驗結(jié)果如表3所示。

8 方法的重復(fù)性測定

在不含L-羥脯氨酸的乳品中人為添加少量定量的標(biāo)品，進(jìn)行方法重復(fù)性驗證實驗，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于10%，測定結(jié)果如表4所示。

9 小結(jié)

動物水解蛋白是以結(jié)締組織中的膠原蛋白為原料，在嚴(yán)格控制的條件下進(jìn)行水解、精制而成的氨基酸多肽。本方法的檢出限為25mg/kg，如果用本方法能檢出，相當(dāng)于牛奶中摻皮革粉在0.025%以上。