周曉 曹誼林 崔磊 喻建軍 李贊 陳杰 左朝暉 劉廣鵬 莫逸 胡炳強 吳勝其

下頜骨位于面下中1/3，頜面部腫瘤切除手術常導致下頜骨缺損，傳統(tǒng)的修補方法主要是骨移植，但由于骨源的限制和自體供區(qū)的損傷，仍不是理想的修復方法。組織工程是利用種子細胞和與可降解支架材料復合的方法，在體內形成具有生理功能的組織，該方法有望成為骨缺損修復的理想方法[1]。在多種大型哺乳動物體內的實驗證實，骨髓基質干細胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)在體外能被誘導為具有成骨特征的細胞，利用其作為種子細胞所形成的組織工程化骨能成功地修復骨缺損[2]。上海市組織工程研究重點實驗室應用自體BMSCs形成的組織工程化骨成功修復了犬下頜骨缺損[3]，在此基礎上，我們應用患者自身的骨髓基質干細胞(hBMSCs)為種子細胞，修復了人頜面部腫瘤切除術后的下頜骨缺損，并通過PET-CT檢測了組織工程化骨在人體內的形成過程，取得了滿意的治療效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本組3例，均為男性，年齡25～44歲，術前三維CT檢查示下頜骨囊腫，均采用組織工程技術修復骨缺損。

1.2 方法

1.2.1 組織工程骨的體外培養(yǎng)

1.2.1.1 自體hBMSC的體外誘導和培養(yǎng)

從患者髂前上棘經(jīng)穿刺取得骨髓5～8 mL，將獲取的骨髓置于Percoll分離液(密度1.073 g/L)，骨髓與分離液的比例為1∶2，2 550 r/min離心30 min，吸取中間云霧狀細胞層，PBS洗1次，1 550 r/min離心后棄上清，獲取有核細胞，以2×107cells/cm2接種于培養(yǎng)皿，進行體外細胞擴增，以成骨條件培養(yǎng)液進行成骨誘導。使用的培養(yǎng)液為DMEM，加入β-磷酸甘油鈉(10 nmol/L)、地塞米松(10-8mol/L)、L-α-磷酸抗壞血酸(50 μmol/L)、L-谷氨酰胺(300 mg/L)、1,25(OH)2VD3(10 nmol/L)和10%自體血清。原代細胞接種后48 h換液，細胞達80%～90%融合后，采用0.25%胰酶消化，2×103cells/cm2傳代培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至第3代，血球板細胞計數(shù)。

1.2.1.2 成骨誘導后的hBMSC的成骨表型鑒定

倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，第3代細胞行鈣結節(jié)四環(huán)素熒光染色，并采用免疫熒光法檢測骨鈣蛋白(Osteocalcin，OCN)。

1.2.1.3 hBMSC復合人部分脫鈣骨體外培養(yǎng)

人部分脫鈣骨由國家組織工程工程中心提供，脫鈣比例為30%～40%，孔隙率為62%～70%，平均孔徑280 μm，主要成分為Ⅰ型膠原。成骨誘導后的hBMSCs以3.5×107cells/g的濃度接種于人部分脫鈣骨上，體外培養(yǎng)1個月，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況。

1.2.2 手術方法

患者全麻，常規(guī)消毒術野，切除下頜骨囊腫，徹底止血，顯露骨缺損，植入細胞－材料復合物，使其邊緣和周圍正常骨密切接觸。用可吸收縫線將細胞－材料復合物與周圍骨組織固定后，嚴密縫合軟組織并關閉創(chuàng)面。術前、術中和術后使用抗生素抗感染。采用的治療方法經(jīng)過湖南省腫瘤醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會通過，并征得患者及家屬同意。

1.3 隨訪

所有患者分別于手術后2周、3個月、6個月進行臨床檢查和PET-CT檢查。

2 結果

2.1 細胞－材料復合物

第3代hBMSCs形態(tài)均勻，增殖旺盛(圖1A)，經(jīng)成骨誘導2周后鈣結節(jié)四環(huán)素熒光染色和OCN免疫熒光檢測均為陽性(圖1B，C)。接種部分脫鈣骨體外構建組織工程化骨后，倒置顯微鏡下觀察，部分脫鈣骨有良好的生物相容性，細胞接種3～4 h可見hBMSCs在脫鈣骨表面貼附生長，細胞在脫鈣骨孔隙中粘附良好；5～8 d可見細胞和其分泌基質充滿脫鈣骨的孔隙(圖1D)。

2.2 組織工程化骨治療下頜骨缺損

全部患者術后PET-CT檢查示，植入的細胞材料復合物形成高密度影，提示組織工程骨形成并修復骨缺損區(qū)。表明術后外形明顯改善，且能維持長期穩(wěn)定的療效。

3 典型病例

患者，男，43歲。2005年10月14日入院，CT檢查示中線部位見約5 cm×4 cm×3 cm單房狀膨脹性骨質破壞，骨皮質變薄，牙槽側骨質稍稀疏，左右第1、2根尖骨質吸收，左右第3牙根尖受壓移位。診斷:下頜骨囊腫。2005年11月24日，在全麻下行下頜骨頦部囊腫切除術加體外構建的組織工程化骨修復術，術中將囊腫壁和少量骨壁完整切除，測量下頜骨實際缺損明顯小于囊腫大小，根據(jù)骨缺損范圍，將4周前在上海市組織工程研究重點實驗室就開始準備的6塊自體骨髓干細胞體外構建的組織工程化骨(大小4.5 cm×2.0 cm×2.5cm)植于缺損處。留置負壓引流，逐層縫合傷口?；颊咝g后康復順利，傷口愈合良好，術后病檢:下頜骨符合牙源性角化囊腫。隨訪2年，下頜骨缺損已修復，形態(tài)良好(圖2)。

患者，男，24歲。2005年12月20日入院，CT檢查示下頜骨改變，右下頜骨可見多個囊性骨質破壞、缺失。該患者3年前曾因右下頜骨囊腫在外院手術治療，故診斷為右下頜骨囊腫術后復發(fā)。2005年12月22日，全麻下行下頜囊腫切除加組織工程化骨植入術。術中見下頜骨體部有2 cm×2 cm和2 cm×1.5 cm大小囊腫兩個，囊腫與牙齦黏膜粘連，將兩個囊腫和粘連的牙齦黏膜切除，骨床用磨鉆磨除部分骨質后下頜骨缺損3.5 cm×2 cm×1 cm。沖洗傷口，將4周前在上海市組織工程研究重點實驗室就開始準備的以自體骨髓干細胞體外構建的組織工程化骨約3 cm×2 cm×1 cm大小植于缺損處。留置負壓引流，逐層縫合傷口。術后病檢:右下頜骨造釉細胞瘤。術后1月發(fā)現(xiàn)下頜骨黏膜缺損，組織工程化骨有0.5 cm×0.5 cm外露。術后2個月傷口發(fā)生感染，經(jīng)抗生素治療，保留脫鈣骨。組織工程骨部分成活，傷口逐漸愈合，治愈出院。隨訪2年，組織工程化骨已修復下頜缺損，形態(tài)良好(圖3)。

患者，男，17歲。2007年12月19日入院。CT檢查示左下頜骨頜角體部及升支內見膨脹性骨質密度減低區(qū)，囊腫大小為7.5 cm×5.7 cm×3.2 cm，左下第6、7牙根伸入囊內。診斷為左下頜骨囊腫。2007年12月24日，全麻下行左下頜骨囊腫刮除術加體外構建的組織工程化骨修復術。術中，切開部分變薄的骨皮質，將囊腫壁完整切除，沖洗傷口。根據(jù)骨缺損范圍，將事先準備的6塊以自體骨髓干細胞體外構建的組織工程化骨植于缺損處。留置負壓引流，逐層縫合傷口。術后13 d拔除引流管，次日發(fā)現(xiàn)左面部腫脹，行探查術，術中見組織工程化骨顏色紅潤，無特殊異常發(fā)現(xiàn)，再放置引流管。12 d后再次拔除引流管。傷口愈合良好。術后病檢:左下頜骨牙源性囊腫。隨訪2年，組織工程化骨成活良好，下頜骨缺損區(qū)修復(圖4)。

3 討論

1993年，Vacanti等[4]將牛成骨細胞接種于聚羥基乙酸后，植入裸鼠皮下，形成組織工程化骨，證實了以組織工程技術構建骨組織的可能性。袁捷等[3]研究證實了經(jīng)誘導的自體BMSC復合珊瑚、羥基磷灰石構建組織工程化骨能修復犬下頜骨缺損。Schliephake等[7]以煅燒牛骨為支架，復合BMSCs，修復羊的下頜骨節(jié)段缺損，組織學結果顯示，新骨形成量較單純材料組有顯著增加。Krzy-manski等[8]將經(jīng)培養(yǎng)的BMSC與纖維蛋白復合修復兔下頜骨部分缺損，結果顯示經(jīng)培養(yǎng)的BMSCs移植較異體凍干骨移植時修復能力顯著增強，與自體骨移植無顯著性差異，表明BMSCs與成骨細胞具有同樣的成骨效率；與骨髓混合，可能骨髓不僅提供前體細胞，還提供生長因子，后者的出現(xiàn)會提高BMSC在體內的增殖。這些研究成果為開展臨床應用研究提供了依據(jù)。但是，以組織工程化骨修復骨缺損，在臨床應用前必須解決兩個關鍵的問題①組織工程化骨能否在人體內形成；②形成的組織工程化骨在人體內的轉歸和遠期效果能否達到臨床修復骨缺損的目的。

組織工程化骨體內構建的關鍵是種子細胞和支架材料。hBMSCs具有能誘導分化為成骨細胞的特性及良好的體外增殖能力，能滿足體內形成組織工程化骨對種子細胞“質和量”的要求[5]。同時采用自體細胞可避免疾病傳播和免疫排斥的風險?，F(xiàn)有多種生物材料可作為骨組織工程的支架材料[6]，如部分脫鈣骨、珊瑚、磷酸三鈣等。脫鈣骨單純臨床應用存在體內吸收過早，在降低免疫源性的同時，易保持骨誘導性等優(yōu)點，本組患者均采用人部分脫鈣骨作為支架材料。術后2周的PET-CT示:移植骨致密部分呈放射性缺損，與下頜骨分界清楚，邊緣銳利，移植松質骨見放射性濃聚影，提示移植松質骨血供豐富。術后3個月的PET-CT檢查提示:組織工程化骨與下頜骨分界模糊，提示組織工程化骨與下頜骨已融為一體，生長良好。尤其是本組的第二位患者，在傷口感染的情況下，組織工程化骨仍能存活，并最終修復了骨缺損區(qū)。本組患者術后2年隨訪提示，組織工程化骨已完全修復缺損區(qū)，形態(tài)良好，效果穩(wěn)定。

組織工程化骨在骨缺損修復中的應用具有明顯優(yōu)勢:從少量骨髓中分離hBMSCs，經(jīng)體外大規(guī)模擴增后可修復大范圍的缺損，改變目前骨缺損治療中供區(qū)骨來源不足的問題，避免對自體骨供區(qū)的損傷。形成的組織工程化骨穩(wěn)定存在，并發(fā)揮其生理功能。和傳統(tǒng)自體骨移植相比，組織工程技術修復缺損可不受缺損面積、形狀等的限制，不造成供區(qū)的組織缺損和功能障礙，因此可達到無創(chuàng)修復大范圍骨缺損的目的，易于被患者接受。德國Warnke等[9]在動物實驗基礎上，應用組織工程化骨修復人下頜骨缺損取得了滿意的臨床療效。充分證明了hBMSCs在人體內可形成組織工程化骨，并能修復骨缺損，展示了組織工程骨組織構建在臨床具有廣闊的應用前景。

但是，本臨床研究并未從組織學上來檢測組織工程化骨的成骨過程，而是應用PET-CT動態(tài)觀察下頜部組織工程骨的成骨過程。因此，對于組織工程化骨在體內建立血液循環(huán)的原理，其在局部愈合和塑形過程中的變化等尚待進一步的研究。

[1]Crane GM,Lshang SL,Mikos AG,et al.Bone tissue engineening[J].Nature Medicine,1995,1:322-324.

[2]Petite H,Viateau V,Bensaid W,et al.Tissue-enginneered bone regeneration[J].Nat Biotechnol,2000,18(6):959-963.

[3]袁捷,祝聯(lián),王敏,等.自體骨髓基質干細胞珊瑚羥基磷灰石修復下頜骨節(jié)段缺抽的實驗研究[J].中華口腔醫(yī)學雜志,2006,41(2):94-97.

[4]Vacanti CA,Kim WS,Mooney D,et al.Tissue engineered composites of bone and cartilage using synthetic poly mers seeded with two cell types[J].Orthop Trans,1993,18(5):276-277.

[5]Prockop DJ.Marrow stromal cells as stem cells for nonhe matopoietic tissues[J].Sci,1997,276(2):71-74.

[6]Bauer TW,Muschler GF.Bone graft materials.An overview of the basic science[J].Clin Orthop,2000,371(1):10-27.

[7]Schliephake H,Knebel JW,Aufderheide M,et al.Use of cultivated osteoprogenitor cells to increase bone formation in segmental mandibular defects:an experimental pilot study in sheep[J].Int J Oral Maxillofac Surg,2001,30(6):513-537.

[8]Krzymanski G,Kalczak M,Wiktor-Jedrzejczak W.The use of bone-marrow derived fibroblastoid cells and fresh bone marrow in the treatment of bone defects:an experimental study[J].Int J Oral Maxillofac Surg,1997,26(1):55-60.

[9]Warnke PH,Wiltfang J,Springer I,et al.Man as living bioreactor:fate of an exogenously prepared customized customized tissueengineered mandible[J].Biomater,2006,27(17)3163-3165.