劉國(guó)華，陳燕明，蔡 慶，陳曉軍，洪若瑜

（1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州市立醫(yī)院東區(qū)呼吸科，江蘇蘇州 215001；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州市立醫(yī)院東區(qū)放射科，江蘇蘇州 215001；3.蘇州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇蘇州 215123）

超微超順磁性氧化鐵納米粒的制備及性能研究

劉國(guó)華1，陳燕明1，蔡 慶2，陳曉軍1，洪若瑜3

（1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州市立醫(yī)院東區(qū)呼吸科，江蘇蘇州 215001；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州市立醫(yī)院東區(qū)放射科，江蘇蘇州 215001；3.蘇州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇蘇州 215123）

目的：制備超微超順磁性氧化鐵納米粒，并研究其物理、磁學(xué)性質(zhì)及傳遞特性，探討其作為磁共振陰性對(duì)比劑的可能性。方法：共沉淀一步法制備葡聚糖包被的四氧化三鐵納米粒，采用X射線(xiàn)粉末衍射法(XRD)分析其內(nèi)部晶體結(jié)構(gòu)，傅立葉紅外光譜儀(FT－IR)分析其表面結(jié)構(gòu)，透射電鏡(TEM)及動(dòng)態(tài)激光粒度儀測(cè)量其大小，振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM)檢測(cè)磁化率等參數(shù)。此外，采用原子吸收光譜儀檢測(cè)家兔血和不同臟器中的樣品鐵含量，MRI觀察注射樣品后肝、淋巴結(jié)的增強(qiáng)效果。結(jié)果：所得樣品核心為四氧化三鐵晶體，表面包覆葡聚糖，核心粒徑6～8 nm，整體顆粒直徑為33 nm，樣品鐵含量為0.2 mmol/L。磁化曲線(xiàn)表現(xiàn)為超順磁性，飽和磁化強(qiáng)度為48.1 emu/g。樣品在家兔體內(nèi)血循環(huán)時(shí)間較長(zhǎng)(＞6 h),主要分布至脾、肝、肺、心、淋巴等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，注射樣品后肝、淋巴結(jié)在T2WI信號(hào)明顯降低。結(jié)論：實(shí)驗(yàn)表明，制備的樣品可作為一種新型的磁共振陰性造影劑，廣泛用于肝脾、淋巴結(jié)等多種疾病的診斷和治療。

超微超順磁性氧化鐵納米粒；物理性質(zhì)；磁學(xué)性質(zhì)；傳遞特性；磁共振陰性對(duì)比劑

隨著科技的進(jìn)一步發(fā)展，納米生物材料被廣泛研究并投入臨床，其中超微超順磁性氧化鐵納米粒（ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO）作為一種新型的磁性納米生物材料，常用于磁共振的陰性對(duì)比劑、示蹤劑及靶向藥物載體等，但該產(chǎn)品價(jià)格昂貴，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)難覓蹤影，本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)共沉淀一步法制備USPIO，從物理、磁學(xué)性質(zhì)、傳遞特性等方面進(jìn)行研究，探討其作為磁共振陰性對(duì)比劑應(yīng)用于臨床的可能性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

H－600－Ⅱ型透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM）（日本日立公司），D/max－ⅢC型X射線(xiàn)粉末衍射儀（X-ray，diffraction，XRD）（日本理學(xué)公司），220FS/ZS 型原子吸收光譜儀（美國(guó)varian spectra公司），Avatar 360型傅立葉紅外光譜儀（Fouriertransform infrared，F(xiàn)T-IR）（美國(guó) Nicolet公司），HPPS 5001型動(dòng)態(tài)激光粒度儀（英國(guó)Malvern公司），BHV-55型振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)（vibrating sample magnetometer，VSM），德國(guó)Philips 1.5T超導(dǎo)MR系統(tǒng)。

1.2 試藥

三氯化鐵、氨水、葡聚糖T20、水合肼均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司生產(chǎn)；硝酸（分析純）為江蘇金城試劑公司產(chǎn)品；高氯酸（分析純）為桃油化工廠產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 共沉淀一步法制備樣品

共沉淀一步法制備外包葡聚糖的四氧化三鐵納米粒（USPIO）見(jiàn)圖 1，具體步驟：將三氯化鐵和氯化亞鐵（Fe3+∶Fe2+摩爾比1.75∶1）和2.5 g葡聚糖T20混合，加入0.5 ml水合肼，溶解在30 ml去離子水中，恒溫磁力攪拌器攪拌，滴加26.5%氨水10 ml，攪拌15 min，緩慢滴加氨水調(diào)節(jié)pH至10，升溫至60℃繼續(xù)反應(yīng)3 h，冷卻后7 000 r/min離心20 min以除去大顆粒，取出上層磁流體，用截留分子量為50 000的透析膜透析24 h以除去磁流體中的剩余物。超聲振蕩5 min，將磁流體60℃真空干燥，分裝后滅菌，置于4℃冰箱，備用。

圖1 共沉淀一步法制備的樣品

2.2 樣品的性能研究

2.2.1 物理性質(zhì)研究

2.2.1.1 TEM觀察粒子的形態(tài)和直徑 取適量磁流體樣品滴加于已制膜的銅網(wǎng)上，濾紙吸除多余的液體，干燥置于TEM觀察孔下觀察粒子的形態(tài)和直徑。

2.2.1.2 XRD分析粒子的晶體結(jié)構(gòu) 取適量真空干燥的樣品顆粒研細(xì)成粉末，置于XRD進(jìn)行掃描，將所得圖譜與JCPDS標(biāo)準(zhǔn)卡片相比，確定樣品是否為四氧化三鐵晶體結(jié)構(gòu)。

2.2.1.3 樣品含量測(cè)定 原子吸收光譜儀測(cè)定樣品中的鐵含量。

2.2.1.4 FT-IR分析粒子的表面結(jié)構(gòu) 取適量真空干燥的樣品顆粒研細(xì)成粉末，加入KBr壓片，充分混合直至形成KBr小丸，用FT-IR分析粒子的表面結(jié)構(gòu)。

2.2.1.5 樣品的總體平均粒徑測(cè)定 取適量磁流體樣品置于粒度儀比色杯中，采用動(dòng)態(tài)激光粒度儀測(cè)定總體平均粒徑。

2.2.2 磁學(xué)性質(zhì)研究

取適量磁流體樣品置于VSM儀內(nèi)，測(cè)定磁化曲線(xiàn)。

2.2.3 傳遞性質(zhì)研究

2.2.3.1 樣品溶液在家兔體內(nèi)分布測(cè)定 取家兔21只，隨機(jī)分成7組，每只按1.25 ml/kg的劑量由耳緣靜脈注射樣品溶液，給藥后 0.5、1、2、3、6、9、12 h 后分別從耳緣靜脈收集全血1～2 ml，置于肝素抗凝的試管中，后處死家兔，剖取其心、肺、肝、脾、淋巴結(jié)，預(yù)處理后，用原子吸收光譜儀測(cè)定各標(biāo)本中鐵含量。

2.2.3.2 組織標(biāo)本中攝入的樣品粒子觀察 取肝、脾、肺、淋巴結(jié)標(biāo)本，采用4%戊二醛固定，丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，作50 nm左右的超薄切片，染色后電鏡觀察。

2.2.4 注射樣品前后肝淋巴結(jié)的增強(qiáng)效果

MR 掃描參數(shù)：SE 序列，T2WI（TR/TE 為 1 800/60 ms），矩陣 256×256，層厚 3 mm。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 12.0軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行比較。

2.4 結(jié)果

2.4.1 樣品的物理性質(zhì)

2.4.1.1 TEM顯示，四氧化三鐵核心部分為分散均勻、圓整的顆粒，以TEM標(biāo)尺100 nm，其粒徑不超過(guò)10 nm（6～8 nm），見(jiàn)圖 2。

圖2 樣品的TEM圖譜

2.4.1.2 XRD顯示，圖中出現(xiàn)一系列特征峰，分別為2.964（220）、2.525（311）、2.092（400）、1.717（422）、1.612（511）、1.478（440）、1.276（533），與四氧化三鐵JCPDS標(biāo)準(zhǔn)卡片的位置一致，可確定樣品核心為四氧化三鐵晶體結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖3。

圖3 樣品的XRD圖譜（A：Fe3O4納米粒；B：樣品 1；C：樣品 2；D：樣品 3；E：樣品 4）

2.4.2 樣品鐵含量測(cè)定結(jié)果

原子吸收光譜儀測(cè)得樣品鐵含量為0.2 mmol/ml。

2.4.3 FT-IR分析結(jié)果

FT-IR分析結(jié)果顯示，外包葡聚糖的四氧化三鐵出現(xiàn)了一些新的吸收峰，如 3 300、2 925、1 636、1 427 cm-1及 1 011、1 111、1157 cm-1，與純葡聚糖粉末吸收峰位置大致相同，表明葡聚糖主要以氫鍵、范德華力及靜電作用等方式與四氧化三鐵納米粒子結(jié)合，見(jiàn)圖4。

圖4 樣品的FT-IR圖譜（A：Fe3O4納米粒；B：葡聚糖；C：樣品）

2.4.4 樣品的總體平均粒徑測(cè)定結(jié)果

動(dòng)態(tài)激光粒度儀測(cè)得樣品的總體平均粒徑為33 nm。

2.5 樣品的磁學(xué)性質(zhì)

VSM測(cè)得的樣品磁化曲線(xiàn)顯示，樣品矯頑力為0，無(wú)磁滯現(xiàn)象，表現(xiàn)為超順磁性，樣品飽和磁化強(qiáng)度為48.1 emu/g，見(jiàn)圖5。

圖5 樣品的磁化曲線(xiàn)圖譜

2.6 樣品的傳遞性質(zhì)

2.6.1 鐵元素濃度測(cè)定結(jié)果

樣品注射后，鐵元素在兔子體內(nèi)血循環(huán)時(shí)間較長(zhǎng)，從血漿中清除較慢，6 h后血液中仍存在較高濃度鐵元素，另外，樣品注射后，鐵元素迅速分布至各器官組織，依次為脾、肝、肺、心、淋巴結(jié)，其中，脾肝富集量最高，而在淋巴結(jié)中，6 h后鐵元素含量達(dá)最高值，隨后保持穩(wěn)定，分別見(jiàn)表1、圖6。

2.6.2 肝、脾、肺、淋巴結(jié)切片結(jié)果

組織標(biāo)本的電鏡顯示，肝、脾、肺、淋巴結(jié)切片具有較高密度的粒狀物，為氧化鐵顆粒，見(jiàn)圖7。

2.7 T2WI信號(hào)結(jié)果

注射樣品后，可見(jiàn)肝、淋巴結(jié)在T2WI信號(hào)明顯降低，見(jiàn)圖8。

表1 鐵元素在家兔各臟器的動(dòng)態(tài)分布（n=3，μg/g）

3 討論

USPIO作為一種新型的磁性納米生物材料，是一種理想的磁共振陰性對(duì)比劑，近年來(lái)，學(xué)者們研究了較多的制備方法，其中較為簡(jiǎn)單有效且技術(shù)成熟者當(dāng)屬化學(xué)共沉淀法[1]，本實(shí)驗(yàn)采用共沉淀一步法，合成了USPIO樣品，并通過(guò)加水合肼、超聲振蕩等手段，使納米顆粒分散性更好，粒徑更小。XRD顯示，樣品核心為Fe3O4晶體結(jié)構(gòu)，TEM顯示，F(xiàn)e3O4分散均勻、圓整，粒徑在10 nm以下（6～8 nm），小于單疇超順磁性氧化鐵顆粒的理論臨界值25 nm[2]。裸露的Fe3O4納米粒易發(fā)生團(tuán)聚、沉淀，為了增加其懸浮穩(wěn)定性及生物相容性，通常需對(duì)其進(jìn)行表面修飾，而葡聚糖是目前常用的殼層生物大分子，具有良好的親水性，因此，本實(shí)驗(yàn)亦采用了葡聚糖進(jìn)行表面修飾，F(xiàn)T-IR顯示，葡聚糖主要以氫鍵、范德華力及靜電作用等方式與Fe3O4納米粒緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的磁流體[3]。包被后的Fe3O4納米粒懸浮穩(wěn)定性好，外觀呈黑棕色，含量為0.2 mmol/ml，4℃冰箱放置2個(gè)月，未見(jiàn)絮凝及沉淀現(xiàn)象。外包葡聚糖的Fe3O4顆粒直徑一般在納米數(shù)量級(jí)，其顆粒大小不同將影響其磁特性、藥代動(dòng)力學(xué)特性及體內(nèi)的分布。目前，根據(jù)顆粒大小將超順磁性氧化鐵顆粒（SPIO）分為兩類(lèi)[4]：一類(lèi)是普通的SPIO，一般納米顆粒直徑＞50 nm；另一類(lèi)是USPIO，最大直徑＜50 nm。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)態(tài)激光粒度儀檢測(cè)表明，樣品的總體平均粒徑為33 nm，顆粒大小符合USPIO，與國(guó)外處于臨床試驗(yàn)階段的AMI-227相似。VSM結(jié)果表明，樣品在外加磁場(chǎng)下有良好的磁響應(yīng)性，飽和磁化強(qiáng)度為48.1 emu/g，高于MR對(duì)比劑要求的最低強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)[5]，當(dāng)撤消磁場(chǎng)后剩磁為0，無(wú)磁滯現(xiàn)象，由于此時(shí)每個(gè)粒子都是一個(gè)單磁疇，磁化方向產(chǎn)生無(wú)規(guī)則的變化，導(dǎo)致超順磁性的出現(xiàn)，滿(mǎn)足了作為磁共振造影劑的基本要求。至于樣品在體內(nèi)的傳遞及分布情況，一般來(lái)說(shuō)，USPIO由于其顆粒小，與血漿蛋白和調(diào)理素的作用減弱，血循環(huán)半衰期延長(zhǎng)，故可通過(guò)毛細(xì)血管壁更廣泛地分布于組織中，特別是通過(guò)毛細(xì)血管末梢進(jìn)入骨髓，并通過(guò)淋巴管輸送到淋巴結(jié)[6]。筆者以家兔為對(duì)象進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果表明，鐵元素在兔子體內(nèi)的血循環(huán)時(shí)間確實(shí)較長(zhǎng)（＞6 h），從血中清除較慢，另外，樣品注射后，鐵元素迅速分布至各組織，如脾、肝、肺、心、淋巴結(jié)，其中，脾、肝富集量最高，而在淋巴結(jié)中，6 h后鐵元素含量達(dá)最高值，隨后保持穩(wěn)定，因此，USPIO易沉積在網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞豐富的組織中，是一種網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的對(duì)比劑，可用于肝、脾，特別是淋巴結(jié)的MR增強(qiáng)[7]。當(dāng)USPIO顆粒分布于組織后，由于具有很強(qiáng)磁矩，可局部擴(kuò)增外加磁場(chǎng)，使磁場(chǎng)不均勻，水分子彌散穿過(guò)不均勻磁場(chǎng)時(shí)加速了質(zhì)子的失相，造成了組織的T2明顯縮短，信號(hào)減低，目前主要用于T2WI成像（負(fù)性增強(qiáng)），而對(duì)T1影響較?。ǖ蜐舛葧r(shí)亦有T1增強(qiáng)效應(yīng)，高濃度時(shí)磁化率效應(yīng)一定程度平衡了T1效應(yīng)）[8]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，注射樣品后肝實(shí)質(zhì)及淋巴結(jié)信號(hào)強(qiáng)度在T2WI上明顯下降，提示本樣品確實(shí)可作為肝、脾、淋巴結(jié)等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)MR的陰性對(duì)比劑。

綜上所述，利用共沉淀一步法制得的本樣品符合USPIO特點(diǎn)，具有良好的物理磁學(xué)性質(zhì)及傳遞特性，USPIO的增強(qiáng)掃描為其廣泛用于肝、脾、淋巴結(jié)等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)疾病的診斷奠定了基礎(chǔ)。

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Preparation and performance study on ultrasmall superparamagnetic iron oxide(USPIO)nanoparticles

LIU Guohua1,CHEN Yanming1,CAI Qing2,CHEN Xiaojun1,HONG Ruoyu3
(1.Department of Respiration,East－section of the Affliated Suzhou Municipal Hospital of Nanjing Medical University,Suzhou 215001,China;2.Department of Radiology,East－section of the Affliated Suzhou Municipal Hospital of Nanjing Medical University,Suzhou 215001,China;3.Department of Chemistry and Chemical Engineering,Suzhou University,Suzhou 215123,China)

Objective:To study the physical,magnetic and transportable properties of USPIO nanoparticles prepared in our laboratory and explore its possibility for using as negative contrast agents in MRI.Methods:The iron oxide nanoparticles was obtained by means of co－precipitation one－step method,its inner crystal structure was analyzed by X－ray diffraction(XRD),its surface structure was analyzed by Fourier transform infrared(FT－IR),its size was measured by transmission electron microscopy(TEM)and dynamic loser scattering system,and its susceptibility was measured by vibrating sample magnetometer(VSM).The iron content in blood and various organ in rabbits at different time was measured by atomic absorption spectrometer,the enhancing－effect of liver and lymph after injecting sample was observed by MRI.Results:The diameter of dextran－coated iron oxide nanoparticles was 6－8 nm,its overall diameter was 33 nm,the iron content of sample was 0.2 mmol/L.These particles possed some characteristics of superparamagnetic,saturation magnetic intensity was 48.01 emu/g.The circulation time of sample in blood plasma of rabbit was long,it distributed in some organs,such as spleen,liver,lung,heart and lymph which had abundant of reticuloendothelial cells.The signal of T2－weighted MR images of liver and lymph decreased remarkably.Conclusion:The experimental conclusion shows the sample USPIO can be used as a promising negative MR agent for various types of liver,spleen and lymph diseases diagnosis.

USPIO;Physical property;Magnetic property;Transportable property;Negative contrast agents in MRI

R394

A

1673-7210（2010）07（a）-033－05

2010-03-31）

南京醫(yī)科大學(xué)科技發(fā)展基金(編號(hào)：NY0586)。

劉國(guó)華，男，江蘇蘇州人，醫(yī)學(xué)碩士，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)槟[瘤基礎(chǔ)與臨床。