李瑋 譚建 龍雷

肺癌是嚴重危害人類生命健康的常見病，目前國內(nèi)外肺癌的發(fā)病率和死亡率還在不斷上升。肺癌在城市占男性惡性腫瘤死亡的38.08%，女性的16%，均居首位。大多數(shù)肺癌患者確診時已失去根治性手術(shù)切除的機會，全身化療是一種有效的治療。一項III期隨機試驗結(jié)果[1]顯示，化療對晚期NSCLC的有效率為20%-40%，1年生存率為35%-45%，中位生存期也僅為8個月-9個月。NSCLC的治療療效有待進一步提高，并需要建立新型高效的治療方法。

放射性碘是治療惡性腫瘤的一種有效治療手段，但其發(fā)揮殺傷腫瘤細胞效應的基礎(chǔ)是腫瘤細胞必須具有攝取碘的能力，從而利用131I發(fā)射的β射線發(fā)揮治療作用。為了使原來不攝碘的肺癌細胞攝取碘，我們將人鈉碘轉(zhuǎn)運體（human sodium/iodide symporter, hNIS）基因引入大細胞肺癌細胞系H460；為了延長碘在甲狀腺細胞中的滯留時間，使腫瘤細胞攝碘能力明顯增高，我們同時共轉(zhuǎn)染入人甲狀腺過氧化物酶（human thyroperoxidase, hTPO）基因，從而達到提高治療效果的目的。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 H460人大細胞肺癌細胞由中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所惠贈，pcDNA3.1/hNIS質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建并保存。G418硫酸鹽、DMEM高糖型培養(yǎng)基和脂質(zhì)體（LipofectamineTM2000）購自美國Invitrogen公司；實驗用酶類均購自日本Takara（寶生物）公司。125I購自中國中核高通公司。1261型γ計數(shù)器為澳大利亞LKB公司生產(chǎn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組腺病毒的構(gòu)建

1.2.1.1 hTPO的亞克隆 將hTPO插入腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV，C端融合6×His標簽，插入位點為NotI和HindIII，并對目的基因測序。

1.2.1.2 獲得腺病毒載體質(zhì)粒AdTPO 使用限制性內(nèi)切酶PmeI線性化pAdTrack-CMV-TPO，并與腺病毒骨架質(zhì)粒AdEasy-1共同轉(zhuǎn)化重組菌感受態(tài)大腸桿菌BJ5183，獲得重組質(zhì)粒，PacI酶切鑒定電泳。

1.2.1.3 重組腺病毒AdTPO的包裝、擴增及純化 293細胞培養(yǎng)，使用病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞，以PacI線性化AdTPO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞，轉(zhuǎn)染7天后收集細胞反復凍融3次，離心獲得P0代病毒，以一定量的P0代病毒感染新的293細胞收集并持續(xù)感染獲得P1及P2代病毒。以腺病毒純化試劑盒（CBLabs, Cat.No: VPK-100）純化P2代病毒，并檢測重組腺病毒滴度測定：滴度（VP/mL）=OD260×dilution×1012VP/mL。

1.2.2 Western blot檢測目的基因重組腺病毒AdTPO的表達pAdTrack-CMV-TPO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞，并以空載體轉(zhuǎn)染平行細胞作為陰性對照，48 h后裂解細胞并Western blot檢測，檢測抗體為His單抗（Genscript, Cat.No.: A00186）。

1.2.3 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-hNIS至H460細胞[1]以SDS堿裂解法，提取質(zhì)粒pcDNA3.1-hNIS。用LipofectamineTM2000進行轉(zhuǎn)染，G418硫酸鹽篩選轉(zhuǎn)染后的細胞，2周后出現(xiàn)抗G418的陽性克隆，即穩(wěn)定表達hNIS基因的H460細胞系。

1.2.4 在穩(wěn)定表達hNIS的H460細胞系中實現(xiàn)重組腺病毒AdTPO的共轉(zhuǎn)染 將穩(wěn)定表達hNIS的H460細胞以1×108/L接種于6孔板。待細胞長至80%-90%融合后，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入含感染復數(shù)（MOI=100）的用無血清培養(yǎng)基稀釋的病毒懸液5×104/L，37oC、5%CO2孵箱培養(yǎng)。1 h后加入足量無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。6 h后吸去含病毒液培養(yǎng)基，加入低血清培養(yǎng)液（5%FBS）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)在37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.5 測定hNIS聯(lián)合AdTPO共轉(zhuǎn)染H460細胞后的攝125I能力 將hNIS單獨轉(zhuǎn)染、hNIS聯(lián)合AdTPO共轉(zhuǎn)染的H460細胞以1×105/孔的密度接種于6孔板，并設置對照組（H460），每組重復6孔。每孔細胞均在原培養(yǎng)基中加入1 850 Bq的125I，在37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90 min后收集細胞，使用γ計數(shù)器測量細胞每分鐘放射性計數(shù)cpm值。

1.2.6 測定hNIS聯(lián)合AdTPO共轉(zhuǎn)染H460細胞后的125I外流及有效半衰期 hNIS聯(lián)合AdTPO共轉(zhuǎn)染組（實驗組）、H460單獨轉(zhuǎn)染組（陰性對照組）和未進行任何轉(zhuǎn)染的空白對照組，在1 850 Bq的125I環(huán)境中孵育120 min后，使用新的10%DMEM培養(yǎng)基置換含125I的培養(yǎng)基，分別在0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30min測定細胞的放射性活性，繪制125I外流曲線，并測定有效半衰期，公式見下。每組測定6孔細胞。

生物半衰期是T′，物理半衰期為T″，有效半衰期為T。

1.2.7 統(tǒng)計學處理 所得數(shù)據(jù)用方差分析進行比較，樣本均數(shù)兩兩比較用q檢驗（Newman-Keuls法），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，采用SPSS 15.0系統(tǒng)進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

2.1 重組腺病毒的構(gòu)建

2.1.1 hTPO的亞克隆 將目的hTPO基因使用NotI和HindIII酶切位點，插入腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV。

2.1.2 腺病毒載體質(zhì)粒AdTPO的獲得 限制性內(nèi)切酶PmeI線性化重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-TPO并與腺病毒骨架質(zhì)粒AdEasy-1共轉(zhuǎn)化重組大腸桿菌BJ5183，然后提取重組病毒，并使用PacI限制性內(nèi)切酶，酶切重組病毒并電泳鑒定，顯示可將病毒切成長約4 500 bp及18 000 bp左右的片段，與預期一致，結(jié)果見圖1。

2.1.3 包裝、擴增及純化AdTPO病毒 線性化的AdTPO質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體包裹后轉(zhuǎn)染293細胞，24 h后可見綠色熒光表達，7天-10天后熒光顯微鏡下可見大量細胞有綠色熒光，細胞變圓。由于初次收集的病毒滴度低，需要多次感染293細胞，在7天后收集293細胞反復凍融3次，離心獲得P0代病毒，并持續(xù)感染獲得P1及P2代病毒，以腺病毒純化試劑盒（CBLabs, Cat.No: VPK-100）純化P2代病毒，并檢測OD260=0.255。滴度（VP/mL）=OD260×dilution×1012= 0.205×5×1012=1.025×1012VP/mL。

2.2 Western blot檢測目的基因重組腺病毒AdTPO的表達pAdTrack-CMV-TPO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞，并以空載體轉(zhuǎn)染平行細胞作為陰性對照，48 h后裂解細胞并Western blot檢測，檢測抗體為His單抗（Genscript, Cat.No: A00186），Western blot顯示90 kDa大小處有陽性反應條帶出現(xiàn)，結(jié)果見圖2。

2.3 穩(wěn)定表達hNIS基因的細胞系hNIS-H460的獲得 使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染hNIS基因后，經(jīng)濃度為600 ng/L的G418篩選后獲得穩(wěn)定表達hNIS基因的細胞系hNIS-H460。

2.4 重組腺病毒AdTPO的共轉(zhuǎn)染 在穩(wěn)定表達hNIS的H460細胞系中實現(xiàn)重組腺病毒AdTPO的共轉(zhuǎn)染，獲AdTPO-hNIS-H460細胞系。其病毒感染復數(shù)MOI=100。

2.5 hNIS聯(lián)合AdTPO共轉(zhuǎn)染H460細胞后的攝125I能力 在1 850 Bq的125I環(huán)境中孵育90 min后，AdTPO-hNIS-H460細胞每分鐘放射性計數(shù)為59 637.67±1 281.13，hNIS-H460細胞為48 622.17±2 242.28，H460細胞為1 440.17±372.86。三組間總體具有統(tǒng)計學差異（F＝576.38, P＜0.01），AdTPO-hNIS- H460組較對照組（H460）攝125I能力增高約41倍（t=106.84, P＜0.01），hNIS-H460組較對照組（H460）攝碘能力增高約34倍（t=50.84, P＜0.01），AdTPO-hNIS-H460組較hNIS- H460組高約1.2倍（t=10.45, P＜0.01）。見圖3。

2.6 hNIS聯(lián)合AdTPO共轉(zhuǎn)染H460細胞后的125I外流及有效半衰期測定 在1 850 Bq的125I環(huán)境中孵育120 min后，分別在不同時間測定細胞的放射性活性，繪制AdTPO-hNISH460（實驗組）、hNIS-H460（陰性對照組）和H460（空白對照組實驗組）的外流曲線，結(jié)果如圖4。結(jié)果表明實驗組AdTPO-hNIS-H460在環(huán)境中撤掉125I后，細胞中的125I外流速度較陰性對照組相比減慢，實驗組AdTPO-hNIS-H460中125I 的有效半衰期為14 min，陰性對照組hNIS-H460中125I的有效半衰期為7 min，空白對照組細胞H460因為不能攝取125I，故其外流曲線不隨時間變化，故可知hNIS與H460共轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)的碘儲留時間比較單獨轉(zhuǎn)染hNIS的細胞碘儲留時間延長。

3 討論

放射性碘用于甲狀腺疾病的顯像和治療是一種非常成熟而有效的方法。在甲狀腺中，碘是通過hNIS基因被主動轉(zhuǎn)運入細胞的[2,3]。如今，hNIS基因已經(jīng)被廣泛地轉(zhuǎn)染至腫瘤細胞，如甲狀腺癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、骨髓瘤等[4-11]，并成功地使這些腫瘤細胞具有攝碘功能。為了提高治療效果，可以將hNIS聯(lián)合hTPO基因共轉(zhuǎn)染腫瘤細胞以延長碘在細胞中的停留時間；還可以將NIS基因改造成具有腫瘤特異性啟動子的重組基因，使其具有腫瘤靶向性，避免損傷正常組織，增強131I的殺傷力。

一些研究者將NIS基因轉(zhuǎn)入不攝取碘的甲狀腺腫瘤和非甲狀腺腫瘤細胞，使其表達NIS蛋白而利用131I治療，且均成功地將NIS基因轉(zhuǎn)入這些腫瘤中并表達出有功能的NIS蛋白。然而，由于碘從腫瘤細胞中流出太快[12]，131I只能在較短的時間內(nèi)對腫瘤組織進行破壞，從而達不到明顯的治療效果。同時，在轉(zhuǎn)染率相對較低的情況下，雖然可在腫瘤細胞表達出有功能的NIS蛋白，但如果表達的NIS數(shù)量不足則可能會導致其攝取的131I的量不足而不能起到治療作用。另外，在這種情況下，131I相對較短的半衰期（8天）和β粒子較低的能量可能也是導致該結(jié)果的原因之一。因此，為了克服這些問題，學者們應用了一些不同的方法，其中包括hNIS聯(lián)合hTPO基因共轉(zhuǎn)染腫瘤細胞以延長碘在細胞中的停留時間[13]。

甲狀腺過氧化物酶（thyroid peroxidase, TPO）在正常甲狀腺中參與碘的有機化過程，將進入甲狀腺細胞內(nèi)的I-有機化，從而延長碘在甲狀腺細胞中的滯留時間。正常甲狀腺組織和甲狀腺癌組織內(nèi)碘的生物半衰期分別約為60天和10天，正是因為甲狀腺內(nèi)的TPO使碘有機化才可使碘在細胞內(nèi)停留足夠長的時間。因此，如果將NIS和TPO基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染NIS表達陰性的腫瘤細胞，使其攝取碘并使得攝入細胞內(nèi)的碘有機化，從而延長放射性碘在腫瘤細胞內(nèi)的滯留時間，達到提高治療效果的目的。Wenzel等[14]將NIS、TPO基因單獨及聯(lián)合轉(zhuǎn)染甲狀腺癌細胞，結(jié)果顯示TPO基因單獨轉(zhuǎn)染組及NIS、TPO基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染組可觀察到碘的有機化，而NIS單獨轉(zhuǎn)染組未觀察到碘的有機化。本研究使用脂質(zhì)體法將hNIS基因轉(zhuǎn)染至大細胞肺癌細胞系H460細胞中，通過G418篩選后成功獲得了穩(wěn)定表達hNIS基因的H460細胞系，并在穩(wěn)定表達hNIS的H460細胞系中實現(xiàn)重組腺病毒AdTPO的共轉(zhuǎn)染，獲得AdTPO-hNIS-H460細胞系，進行穩(wěn)定表達細胞系的體外攝125I實驗。結(jié)果顯示AdTPO-hNIS-h460組與hNIS-H460組相比攝碘能力有所增高，證明hNIS和hTPO基因共轉(zhuǎn)染可以增強H460細胞的攝碘能力。而且實驗組AdTPO-hNIS-H460中125I的有效半衰期比較對照組hNIS-H460的有效半衰期延長，證明AdTPO-hNIS-H460組中細胞碘滯留時間比hNIS-H460有所延長，但是延長的碘滯留時間是否能強化放射性碘對腫瘤細胞的殺傷效果，還需進一步研究。

圖 1 PacI酶切AdTPO載體Fig 1 Ad-TPO vector digested with PacI

圖 2 Western blot結(jié)果。M：Marker條帶；1：pAdTrack-CMV-TPO轉(zhuǎn)染后細胞系；2：對照組細胞系。Fig 2 Result of Western blot. M: Marker； 1: lysate of cells transfected with pAdTrack-CMV-TPO； 2: lysate of control cells.

圖 3 G418篩選后各細胞系的攝125I 能力Fig 3 The 125I uptake ability of cell lines after selected by G418 antibiotics

圖 4 各組細胞125I外流圖Fig 4 125I efflux experiments of cell lines

2001年Huang等[15]首次報道將NIS、TPO基因克隆至含有巨細胞病毒啟動子的質(zhì)粒中并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到非小細胞肺癌中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞對碘的攝取能力增加，碘在腫瘤細胞內(nèi)的滯留時間顯著延長，腫瘤細胞的凋亡也明顯增加。我們成功將NIS及TPO基因共轉(zhuǎn)染入神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中并初步證明，其共轉(zhuǎn)染可以延長膠質(zhì)瘤細胞中碘的滯留時間，但是以前的研究采用的是質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，只能做細胞水平的轉(zhuǎn)染而不能用作動物體內(nèi)研究，且前次TPO的轉(zhuǎn)染為瞬時轉(zhuǎn)染未篩選，轉(zhuǎn)染效率低[16]。與之相比，本次研究使用腺病毒載體系統(tǒng)以攜帶hTPO基因，轉(zhuǎn)染效率高，效果好，更能準確地體現(xiàn)細胞轉(zhuǎn)染后攝碘情況。重組腺病毒可以有效地轉(zhuǎn)染分裂和靜止期細胞，而且攜帶基因不整合到宿主細胞基因組中，無潛在致癌危險[17]。本實驗中采用的腺病毒載體AdEasy系統(tǒng)是近年來較新的載體系統(tǒng)，它重組效率高、周期短；利用含不同抗生素的平板篩選重組子，簡化了篩選工作；經(jīng)重組的腺病毒帶有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）基因，可直接通過熒光顯微鏡監(jiān)測病毒的生成，且GFP表達與空斑形成實驗之間具有很好的一致性，結(jié)果可信。因此，應用該系統(tǒng)可方便地生成重組腺病毒，進一步拓寬了腺病毒在基因治療中的應用。

理想的基因治療方案必須具備有效性和安全性。在目前的研究中，組織特異性啟動子的應用在提高治療效果方面是一個重要的突破。有很多研究將NIS基因改造成具有腫瘤特異性啟動子的重組基因，使其特異性地表達于腫瘤細胞，從而提高腫瘤細胞攝碘的數(shù)量，增強131I的殺傷力。Chen等[18]應用白蛋白啟動子和增強子調(diào)控的NIS逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建了穩(wěn)定表達NIS的肝癌細胞系MHmAlbhNIS6，131I治療實驗結(jié)果較滿意。更值得一提的是，hTERT啟動子作為一種廣譜的腫瘤細胞的特異性啟動子，可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控目的基因的表達，以確保對腫瘤細胞的殺傷，而正常組織細胞則不受到傷害，為今后體內(nèi)實驗中如何保護正常組織不受誤傷的研究確立了方向。隨著各相關(guān)研究的進一步發(fā)展，基因治療領(lǐng)域還將取得更新的進展。