張平 張志培 李香敏 雷杰 蘇凱 李小飛 王小平

肺癌是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)。我國(guó)數(shù)個(gè)大中城市中肺癌的發(fā)病率、死亡率已占男性惡性腫瘤的首位，女性惡性腫瘤的第二位[1]，對(duì)于這一疾病急需深入的研究。近年來(lái)的研究[2-4]發(fā)現(xiàn)，磷酸酶家族成員肝再生磷酸酶（PRL，包括PRL1-3共3種分子）參與多種類(lèi)型腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，其中PRL3在結(jié)直腸癌[3,5]、卵巢癌[6]和胃癌[7]高表達(dá)中，在腫瘤細(xì)胞的增殖、粘附、遷移、侵襲以及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的正向調(diào)控作用。但有關(guān)PRL-3在肺癌不同病程中的表達(dá)情況及與腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系鮮有報(bào)道。RhoC屬于小分子G蛋白超家族中的Rho亞家族，是Rho信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要分子，許多研究表明RhoC在卵巢癌[8]、肝癌[9]、肺癌[10]等腫瘤中高表達(dá)并與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移高度相關(guān)。Fiordalisi等[11]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)提示PRL-3可能是通過(guò)激活Rho信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)促進(jìn)腫瘤的運(yùn)動(dòng)與轉(zhuǎn)移。本研究應(yīng)用免疫組化的方法檢測(cè)PRL-3和RhoC在肺癌組織中的表達(dá)情況，探討二者與肺癌臨床病理特征的關(guān)系，分析其與肺浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，并探討PRL-3與RhoC在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）組織中的表達(dá)是否存在相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 收集2008年6月-2009年6月第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸外科手術(shù)標(biāo)本92例。其中鱗癌51例，腺癌41例；男性61例，女性31例；最大年齡72歲，最小年齡30歲，平均年齡57.83歲。將標(biāo)本用10%中性甲醛溶液固定，脫水、透明、石蠟包埋。組織病理分類(lèi)及分級(jí)由我院病理科醫(yī)生確定，結(jié)合手術(shù)、影像學(xué)資料進(jìn)行TNM分期。鼠抗人PRL-3單克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，兔抗鼠IgG/辣根酶標(biāo)記二抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗人RhoC多克隆抗體為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記二抗和DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 石蠟包埋的組織塊經(jīng)5 μm厚連續(xù)切片，分別做HE染色和免疫組織化學(xué)染色。免疫組化染色采用SP（streptavidin-perosidase）法。步驟如下：脫蠟至水、3 mol/L尿素溶液消化、3%過(guò)氧化氫溶液封閉、檸檬酸鹽緩沖液微波修復(fù)抗原、自然冷卻至室溫、血清封閉、加一抗（稀釋比例：抗PRL-3抗體為1:75，抗RhoC抗體為1:150）后4oC過(guò)夜、37oC復(fù)溫、加二抗37oC反應(yīng)、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分化、脫水透明、中性樹(shù)膠封片。用PBS液取代一抗做空白對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷 PRL-3和RhoC免疫組化染色均位于細(xì)胞質(zhì)和胞膜。每張組化結(jié)果隨機(jī)選取5個(gè)不同的視野，分別計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算其算術(shù)平均值。按照半定量積分方法判定，每例均隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野，判斷結(jié)果：陽(yáng)性細(xì)胞≤5%為0分，6%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，＞75%為4分；陽(yáng)性強(qiáng)度黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將細(xì)胞陽(yáng)性率與染色強(qiáng)度積分相乘，0分為陰性（-），1分-4分為弱陽(yáng)性（+），5分-8分為中度陽(yáng)性（++），9分-12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）[12]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，臨床病理特征分組統(tǒng)計(jì)采用Mann-whitney U檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色表達(dá)定位 結(jié)果顯示PRL-3和RhoC蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜上，呈黃色或棕黃色顆粒（圖1）。

2.2 臨床病理特征分組統(tǒng)計(jì)結(jié)果 應(yīng)用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Mann-Whitney U檢驗(yàn)對(duì)PRL-3和RhoC蛋白在性別、年齡、病理類(lèi)型、分化程度、TNM分期、是否伴淋巴結(jié)及胸膜轉(zhuǎn)移7個(gè)分組之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，性別、年齡、病理類(lèi)型、分化程度4個(gè)分組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而TNM分期、是否伴淋巴結(jié)及胸膜轉(zhuǎn)移3個(gè)分組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。

2.3 相關(guān)性分析 應(yīng)用Spearman檢驗(yàn)對(duì)PRL-3和RhoC蛋白在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的強(qiáng)度進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示二者的表達(dá)存在較強(qiáng)的相關(guān)性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.754,P＜0.001）（表2）。

3 討論

人類(lèi)PRL-3基因位于染色體8q24.3，編碼173個(gè)氨基酸，大約75%的氨基酸序列與其家族中其他兩個(gè)成員PRL-1、PRL-2相同，其分子質(zhì)量約為20 kDa，是非典型磷酸酪氨酸蛋白磷酸脂酶。在人類(lèi)正常組織中，PRL-3主要在心肌、平滑肌和骨骼肌中表達(dá)[13]。Saha等[3]應(yīng)用基因表達(dá)系列分析（SAGE）發(fā)現(xiàn)PRL-3基因在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移組織中過(guò)度表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PRL-3在正常結(jié)、直腸粘膜和無(wú)轉(zhuǎn)移原位癌中低度表達(dá)，在有轉(zhuǎn)移的原發(fā)癌中則中度表達(dá)，而且在原發(fā)癌切除術(shù)后出現(xiàn)肝肺等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)率隨原發(fā)癌組織中PRL-3高表達(dá)而增加。目前，對(duì)PRL-3在NSCLC組織的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析PRL-3在不同的性別、年齡、病理類(lèi)型、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜轉(zhuǎn)移分組的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PRL-3的表達(dá)在不同的性別、年齡、病理類(lèi)型、分化程度無(wú)明顯差別，而隨著TNM分期的增高、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胸膜轉(zhuǎn)移，PRL-3的表達(dá)明顯增高，這一現(xiàn)象提示PRL-3可能有促進(jìn)NSCLC轉(zhuǎn)移的功能。

圖 1 PRL-3、RhoC在肺癌組織中的表達(dá)。A、B、C: 腺癌； D、E、F: 鱗癌； A、D: PRL-3陽(yáng)性表達(dá)； B、E:RhoC陽(yáng)性表達(dá)； C、F空白對(duì)照（SP, A、B、D、E×400； C、F×200）。Fig 1 Expressions of PRL-3, RhoC in lung cancer. A,B, C: lung adenocarcinome； D, E, F: squamous cell lung cancer； A, D: positive expression of PRL-3； B, E:positive expression of RhoC； C, F: blank control (SP,A, B, D, E×400； C, F×200).

表 1 PRL-3、 RhoC在肺癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系（Mann-Whitney U檢驗(yàn)）Tab 1 The relationship between PRL-3, RhoC expressions in NSCLC and clinical pathological factors (Mann-Whitney U Test)

表 2 PRL-3與RhoC在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)相關(guān)性（Spearman檢驗(yàn)）Tab 2 The correlation of PRL-3 expression with RhoC expression in NSCLC (Spearman test)

RhoC基因定位于1p13-p21，RhoC蛋白含193個(gè)氨基酸，其分子量在20 kDa-30 kDa之間，屬于Ras超家族中的小GTP結(jié)合蛋白，在真核細(xì)胞中作為分子開(kāi)關(guān)控制著眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[14]。RhoC蛋白在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中作為信號(hào)轉(zhuǎn)換器，調(diào)控各種細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞形態(tài)建成等功能[15]，通過(guò)對(duì)細(xì)胞骨架蛋白的調(diào)節(jié)加快細(xì)胞遷移[16,17]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析RhoC在不同的性別、年齡、病理類(lèi)型、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜轉(zhuǎn)移分組的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)RhoC的表達(dá)在不同的性別、年齡、病理類(lèi)型、分化程度無(wú)明顯差別，而隨著TNM分期的增高、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胸膜轉(zhuǎn)移，RhoC的表達(dá)明顯增高，這一現(xiàn)象提示RhoC可能有促進(jìn)NSCLC轉(zhuǎn)移的功能。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化SP法檢測(cè)PRL-3和RhoC在92例NSCLC的表達(dá)，二者的表達(dá)陽(yáng)性率分別為69.6%（64/92）、73.9%（68/92），表達(dá)的強(qiáng)弱在不同的TNM分期、淋巴結(jié)及胸膜是否轉(zhuǎn)移的分組之間具有顯著的差異性，同時(shí)二者的表達(dá)強(qiáng)弱具有較強(qiáng)的相關(guān)性。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以得出：在轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)的NSCLC中PRL-3和RhoC蛋白的表達(dá)較高，二者可能具有促進(jìn)癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生物學(xué)功能，這一結(jié)論證實(shí)了現(xiàn)階段對(duì)這兩個(gè)蛋白的功能的認(rèn)識(shí)。目前RhoC蛋白比較明確的功能是引起F-肌動(dòng)蛋白的重組和動(dòng)態(tài)變化[18]，但是在該通路中RhoC蛋白活化及其信號(hào)傳遞機(jī)制還不是很清楚，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及Fiordalisi等[11]、Ming等[19]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，PRL-3可能對(duì)RhoC蛋白的表達(dá)有調(diào)節(jié)功能，可能通過(guò)RhoC蛋白促進(jìn)NSCLC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，但PRL-3作為磷酸酶直接的作用是使底物去磷酸化，而RhoC蛋白只有在結(jié)合GTP（即磷酸化狀態(tài)）時(shí)才具有生物學(xué)活性，可以推論出PRL-3不是直接作用于RhoC蛋白來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)作用，而有可能是通過(guò)一些未知的分子來(lái)調(diào)節(jié)RhoC蛋白，再通過(guò)其下游因子促進(jìn)癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。目前已知磷酸化與脫磷酸化修飾在體內(nèi)各種代謝的調(diào)節(jié)中及受體功能調(diào)節(jié)上起重要作用，PRL-3作為一種磷酸酶可能通過(guò)其脫磷酸化功能參與體內(nèi)某些代謝的調(diào)節(jié)及某些受體功能調(diào)節(jié)，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。PRL-3促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制仍不清楚，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)闡明，同時(shí)RhoC蛋白對(duì)PRL-3是否具有反饋?zhàn)饔靡残枰钊氲难芯俊?/p>