王琴 展平 于力克 宋勇

肺癌作為一種惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率近年來(lái)一直呈上升趨勢(shì)，已成為21世紀(jì)全球面臨的嚴(yán)峻的健康問(wèn)題[1]。在中國(guó)，據(jù)預(yù)測(cè)到2025年，肺癌患者將達(dá)到100萬(wàn)，居世界第1位。肺癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是多因素、多基因、多階段共同參與的結(jié)果，目前這方面的研究主要集中在腫瘤相關(guān)基因的克隆和功能分析、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及細(xì)胞周期調(diào)控三大領(lǐng)域，其中細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)其發(fā)生發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。Wnt信號(hào)通路是一種進(jìn)化上高度保守的、對(duì)控制胚胎發(fā)育有重要作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。對(duì)Wnt基因家族成員的編碼產(chǎn)物及其生物學(xué)效應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)通路的異常激活參與了多種人類(lèi)癌癥的發(fā)生[2]。Wnt1蛋白是Wnt通路中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的蛋白[3]，目前關(guān)于Wnt1在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中的表達(dá)及與術(shù)后生存期的相關(guān)性研究尚少，為此我們探討Wnt1在NSCLC組織內(nèi)的表達(dá)情況及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病人資料 選取解放軍第八一醫(yī)院和南京市胸科醫(yī)院2001年1月-2005年12月手術(shù)切除的經(jīng)常規(guī)病理證實(shí)的NSCLC標(biāo)本115例，肺良性病變組織19例（5例肺結(jié)核、4例支氣管擴(kuò)張、6例肺大皰、4例炎性假瘤）。115例NSCLC病人詳細(xì)病理特征見(jiàn)表1，分期采用國(guó)際抗癌聯(lián)盟1997年修訂的肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)。全部病例術(shù)前均未作過(guò)化療或放療；73.9%的病人術(shù)后予以鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的2-4個(gè)療程的化療。納入的病例要求切緣陰性，術(shù)后生存3個(gè)月以上，術(shù)后5年內(nèi)肺癌是其唯一死因。本研究中病人平均生存時(shí)間為22個(gè)月（3個(gè)月-82個(gè)月），隨訪(fǎng)的截止日期為2009年3月21日。

1.2 方法 采用免疫組化Envision方法[4]，取病理科石蠟包埋的組織，切片成4 μm，經(jīng)常規(guī)脫蠟至水后，EDTA液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）高溫抗原修復(fù)，PBS沖洗1次（1 min），每張切片滴加50 μL的一抗（兔抗人Wnt1單克隆抗體，英國(guó)Abcam公司，稀釋濃度1:200），4oC冰箱孵育過(guò)夜，PBS沖洗3次，每次1 min，每張切片滴加50 μL的二抗 （二步法抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒，丹麥Dako公司），室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，每次1 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。陰性對(duì)照為PBS代替一抗。

1.3 結(jié)果判定 以PBS代替一抗設(shè)定為陰性空白對(duì)照，同時(shí)用已知陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照。Wnt1蛋白主要位于細(xì)胞漿中，細(xì)胞漿顯示棕色提示W(wǎng)nt1陽(yáng)性表達(dá)。Wnt1陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[5,6]，隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，取5個(gè)視野的算術(shù)平均值。截?cái)嘀等?0%，即≥50為陽(yáng)性，＜50%為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析處理，Wnt1表達(dá)陽(yáng)性與陰性病例的比較采用χ2檢驗(yàn)，生存分析的比較用Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)，影響生存期的相關(guān)因素分析采用Cox多因素回歸分析法，所有檢驗(yàn)和P值均為雙側(cè)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Wnt1蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá) 免疫組化的結(jié)果顯示W(wǎng)nt1在NSCLC中的表達(dá)位于細(xì)胞漿中（圖1），在NSCLC和肺良性病變組織的表達(dá)的陽(yáng)性率分別為62.6%、31.6%。Wnt1蛋白在NSCLC組織中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組（χ2=4.474, P=0.034）（表2）。

2.2 Wnt1蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)和臨床病理特征的關(guān)系 Wnt1蛋白在NSCLC中的表達(dá)與性別、年齡、吸煙、腫瘤部位、腫瘤大小、T分期、病理類(lèi)型、淋巴結(jié)分期、pTNM分期、是否為BAC和腫瘤細(xì)胞的分化無(wú)明顯相關(guān)性（表3）。

2.3 Wnt1蛋白的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的關(guān)系 115例NSCLC患者從手術(shù)日期開(kāi)始隨訪(fǎng)，至患者死亡結(jié)束，未死亡的至2009年3月21日截止。用Kaplan-Meier生存分析，Log-rank檢驗(yàn)，Wnt1蛋白陽(yáng)性表達(dá)組與陰性表達(dá)組在生存上有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.03）（圖2）；對(duì)性別、年齡、吸煙、腫瘤部位、腫瘤大小、T分期、病理類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否為BAC、腫瘤細(xì)胞的分化、pTNM分期、Wnt1蛋白等12個(gè)因素進(jìn)行Cox模型多因素分析，結(jié)果表明，Wnt1蛋白和腫瘤分化是影響非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，Wnt1蛋白陽(yáng)性的患者預(yù)后差（OR=1.834, P=0.032），腫瘤細(xì)胞分化越差的患者預(yù)后越差（OR=2.931, P＜0.001）（表4）。

3 討論

Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可分為經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路兩類(lèi)，而目前認(rèn)為經(jīng)典通路調(diào)控細(xì)胞增殖和活化，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。Wnt蛋白作用于細(xì)胞膜上的受體，信號(hào)傳入細(xì)胞后，經(jīng)散亂蛋白傳至糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β）、β連環(huán)蛋白、APC蛋白和軸蛋白，形成多聚蛋白復(fù)合體。GSK-3β的磷酸化作用引起β連環(huán)蛋白降解，使后者在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的游離量保持在較低水平；當(dāng)GSK-3β被Wnt信號(hào)抑制后，β連環(huán)蛋白的降解隨即被中斷，使細(xì)胞內(nèi)游離的β連環(huán)蛋白含量增加，并進(jìn)入核內(nèi)，作用于T細(xì)胞因子/淋巴樣增強(qiáng)因子（T cell factor/lymphocyte enhancer factor, TCF/LEF），并形成β連環(huán)蛋白-TCF/LEF轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，最終激活Wnt信號(hào)的有關(guān)靶基因（主要為c-myc和cyclin D1），調(diào)控胚胎發(fā)育及細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡。

表 1 115例非小細(xì)胞肺癌病人臨床特點(diǎn)Tab 1 Characteristics of 115 patients with NSCLC

表 2 Wnt1蛋白在NSCLC和良性病變組織中的表達(dá)Tab 2 Expression of Wnt1 in NSCLC and benign lesion

表 3 NSCLC組織中Wnt蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)特征的關(guān)系Tab 3 Relationship between the expression of Wnt1 and clinicopathological characteristics of NSCLC patients

表 4 NSCLC預(yù)后因素多變量Cox回歸分析Tab 4 Multivariate regression analysis in predicting survival of 115 patients with NSCLC

圖 1 Wnt1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況（DAB，×400）。A：Wnt1在鱗癌組織中的陰性表達(dá)；B：Wnt1在鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)；C、D：Wnt1在腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)。Fig 1 Expression of Wnt1 in NSCLC (DAB, ×400). A: Negative expression of Wnt1 in squamous cell carcinoma； B: Positive expression of Wnt1 in squamous cell carcinoma； C, D: Positive expression of Wnt1 in adenocarcinoma.

圖 2 Wnt1蛋白的表達(dá)與115例NSCLC患者Kaplan-Meier生存分析Fig 2 Kaplan-Meier survival curve of the expression of Wnt1 in 115 patients with NSCLC

已發(fā)現(xiàn)Wnt1與許多腫瘤有關(guān)，包括結(jié)直腸癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、頭頸部腫瘤、黑素瘤、肉瘤、白血病、基底細(xì)胞癌、肺癌、間皮瘤[8-10]。Wnt1蛋白在NSCLC組織中的表達(dá)目前報(bào)道較少，國(guó)內(nèi)目前只有兩篇小樣本（分別為60例、63例）文獻(xiàn)報(bào)道[11,12]，這兩篇報(bào)道均未闡述Wnt1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，國(guó)外同一所醫(yī)院的Na-kashima、Huang等[6,13]報(bào)道Wnt1蛋白在NSCLC組織中表達(dá)與預(yù)后相關(guān)，并可作為獨(dú)立的預(yù)后因素。本研究通過(guò)免疫組化的方法檢測(cè)NSCLC組織內(nèi)Wnt1蛋白的表達(dá)情況及與臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果顯示W(wǎng)nt1蛋白在NSCLC中的陽(yáng)性表達(dá)顯著高于肺良性病變組織，但與臨床病理特征無(wú)明顯的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)隨訪(fǎng)獲得患者的生存期，用Kaplan-Meier生存分析、Log-rank檢驗(yàn)提示W(wǎng)nt1陽(yáng)性表達(dá)的NSCLC患者預(yù)后較差，Cox模型多因素分析結(jié)果表明Wnt1蛋白是影響NSCLC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與Nakashima、Huang等[6,13]的研究結(jié)果一致。提示W(wǎng)nt1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)可以作為判斷NSCLC預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)之一。Nakashima、Huang等[6,13]同時(shí)通過(guò)研究得出Wnt1的表達(dá)與其下游的Ki-67、c-Myc、Cylin D1、MMP-7、VEGF-A有關(guān)，而上述因子主要與腫瘤的增殖及腫瘤新生血管形成有關(guān)，故這是Wnt1的可能作用機(jī)制。本文是國(guó)內(nèi)第一篇研究Wnt1與NSCLC預(yù)后的文獻(xiàn)，同時(shí)本文還研究了Wnt1的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性，其結(jié)果與兩篇國(guó)外報(bào)道一致，而國(guó)內(nèi)的兩篇文獻(xiàn)報(bào)道其陽(yáng)性表達(dá)與部分臨床病理特征相關(guān)，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于Wnt1預(yù)后的文獻(xiàn)報(bào)道較少，其確切的機(jī)制及與臨床病理特征的相關(guān)性有待進(jìn)一步探討。

分子靶向治療的發(fā)展開(kāi)創(chuàng)了NSCLC治療的新領(lǐng)域，目前已被NCCN推薦作為二線(xiàn)藥物及部分患者的一線(xiàn)藥物，尋找作用于新的靶點(diǎn)的藥物是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。抑制肺癌組織中Wnt信號(hào)異常表達(dá)可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤增殖，利用該通路中特異信號(hào)分子及其下游效應(yīng)物可以實(shí)施腫瘤靶向性治療策略，通過(guò)基因選擇性殺傷惡性腫瘤細(xì)胞。目前，已發(fā)現(xiàn)作用于Wnt信號(hào)通路的拮抗劑有DKK（Dickkopf）家族、分泌型frizzled相關(guān)蛋白（secreted frizzled-related protein family, sFRP）、Wnt抑制因子-1（Wnt inhibitory factor-1, WIF-1）[14,15]和內(nèi)皮抑素[16]。隨著對(duì)Wnt信號(hào)通路及其各成員研究的不斷深入，我們對(duì)Wnt信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用將會(huì)進(jìn)一步明確，預(yù)計(jì)針對(duì)Wnt信號(hào)通路不同位點(diǎn)的特異性靶向治療藥物將得到開(kāi)發(fā)。

雖然對(duì)Wnt通路的研究取得許多突破，但仍有很多方面有待進(jìn)一步研究，如對(duì)該通路中的一些未知因子的探索；進(jìn)一步研究Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中各基因及表達(dá)蛋白的互相作用，從而更深層次闡明腫瘤的發(fā)生機(jī)制；在單一細(xì)胞中Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析與其他通路之間的相互聯(lián)系；將Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為抗腫瘤治療起點(diǎn)，研制抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床有待深入研究。