李桂蘭 芮 成

江西省醫(yī)藥學(xué)校（330200）

杏香兔耳風(fēng)Ainsliaea fragrans Champ.為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，民間以全草入藥，具有清熱補(bǔ)虛、涼血止血、利濕解毒、發(fā)表祛風(fēng)等作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，杏香兔耳風(fēng)中具有良好的抗炎效果，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了3種杏香兔耳風(fēng)提取物對(duì)常見菌的抑制作用，闡明了其抑菌活性，旨在能開發(fā)出一種天然的抑菌藥，為杏香兔耳風(fēng)臨床開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料

杏香兔耳風(fēng)提取物A、杏香兔耳風(fēng)提取物B和杏香兔耳風(fēng)提取物C，由本院制劑室提供，置于冰箱中冷藏備用。

1.2 供試菌種

細(xì)菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草桿菌（Bacillus subtilis）、沙門菌（Salmonella sp.）；霉菌：黑曲霉（Aspergillus niger）、桔青霉（Penicillium citrinum）；酵母菌：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）由南京師范大學(xué)生科院和南京中醫(yī)藥大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 培養(yǎng)基[1]

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于細(xì)菌的培養(yǎng)），具體組成為：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、瓊脂15～20g、水1000mL、pH 7.2～7.4；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（用于霉菌和酵母菌的培養(yǎng)），具體組成為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15～20g、水1000mL、pH自然（將馬鈴薯去皮，切成小塊，置于鍋中并加水1000mL，煮沸半個(gè)小時(shí)，用雙層紗布過濾，取其濾液加葡萄糖20g，加瓊脂15～20g，并加水補(bǔ)足1000mL，調(diào)pH成自然）。

1.4 試劑

乙醇、氫氧化鈉、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀所用試劑均為分析純，市售的豬肉、茄子、豆腐。

1.5 儀器與設(shè)備

HH-2型恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司），DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），KS-120D超聲波清洗器（寧波海曙科聲超聲設(shè)備有限公司），D-1型自動(dòng)蒸氣滅菌鍋（北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司），DGF30/7-IADC型電熱鼓風(fēng)干燥箱（南京實(shí)驗(yàn)儀器廠），超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），手動(dòng)（可調(diào)試）移液槍（上海大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司）

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌懸液的制備

取試管若干，裝入融化的培養(yǎng)基滅菌后擺成斜面。在無菌條件下用劃線法將供試菌種移接入相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上，每個(gè)菌種活化多支，放入培養(yǎng)箱中，細(xì)菌37℃下培養(yǎng)18～24h，酵母菌和霉菌于28℃下培養(yǎng)48h。然后取出置于4℃冰箱中冷藏。取出活化好的菌種，無菌操作，用適量的滅過菌的生理鹽水洗入已滅菌的干凈試管中，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要采用比濁法[2]配置成含菌數(shù)為106～107CFU/mL的菌懸液，備用。

2.2 濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定杏香兔耳風(fēng)提取物的抑菌能力

參考姚淑敏[3]的方法并略有改進(jìn)，將配制好滅過菌的固體培養(yǎng)基溶化后倒入培養(yǎng)皿中，每皿20mL，待冷卻、凝固后，用無菌吸管分別加入0.1mL相應(yīng)的待試菌懸液，用無菌涂布器將菌液涂布均勻，制成含菌平板，置37℃恒溫箱中15min后取出，目的使瓊脂表面干燥，待用。選擇吸水性強(qiáng)的新華一號(hào)定性濾紙，用打孔器打成若干直徑為6mm的圓形濾紙片，分裝于潔凈干燥的小培養(yǎng)皿內(nèi)，50張/皿，干熱滅菌后，浸在提取液中，備用。在超凈臺(tái)里將平板平均分為6個(gè)區(qū)，對(duì)角設(shè)置對(duì)照組，用無菌鑷子鑷取浸有提取液的濾紙片貼在含菌平板上，用浸有無菌水的濾紙片作對(duì)照。每菌做3次重復(fù)，取其平均值。放入培養(yǎng)箱恒溫倒置培養(yǎng)，細(xì)菌置37℃培養(yǎng)24h，霉菌和酵母菌置28℃下培養(yǎng)48h，取出后測(cè)出濾紙片抑菌圈直徑大小，比較抑菌效果。

2.3 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

參照謝主蘭[4]的方法略有改動(dòng)，將配置的固體培養(yǎng)基在121℃、0.1 MPa條件下滅菌30min，當(dāng)滅菌培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí)，在無菌條件下準(zhǔn)確量取不同體積的提取液加入固體培養(yǎng)基中，配制成濃度5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.313%、0.156%、0.078%的杏香兔耳風(fēng)提取物系列培養(yǎng)基，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)。以不加提取物溶液的培養(yǎng)基為陰性對(duì)照。冷卻凝固后，每平皿加入0.1mL的菌懸液，涂勻，將細(xì)菌置于37℃下培養(yǎng)24h，霉菌和酵母菌置于28℃下培養(yǎng)48h，觀察生長(zhǎng)情況以不長(zhǎng)菌的最低提取物溶液濃度為該提取物的最低抑菌濃度。

2.4 抑菌或殺菌活性的初步探討[5]

用濾紙片法測(cè)定杏香兔耳風(fēng)提取物對(duì)四種細(xì)菌的抑菌或殺菌效果，37℃下恒溫培養(yǎng)24h后，再分別從平板透明抑菌圈中挑取一小塊瓊脂進(jìn)行液體培養(yǎng)18h后，再涂平板，于37℃下恒溫培養(yǎng)24h后，觀察各平板上菌落的生長(zhǎng)情況，有菌落生長(zhǎng)即表示提取液對(duì)細(xì)菌具有抑菌作用，無菌落生長(zhǎng)即表示提取液對(duì)細(xì)菌具有殺菌作用。

3 結(jié) 果

3.1 濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定杏香兔耳風(fēng)提取物的抑菌能力

3種杏香兔耳風(fēng)片提取物的抑菌作用結(jié)果見表1。由表1可知3種杏香兔耳風(fēng)提取物對(duì)供試細(xì)菌都有一定的抑制作用，其中杏香兔耳風(fēng)提取物A對(duì)大腸桿菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑達(dá)到（12.2±0.27）mm，其次為金黃色葡萄球菌、沙門菌、枯草芽孢桿菌。杏香兔耳風(fēng)提取物B對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)到（15.8±0.16）mm，其次為沙門菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌。闊瓣含笑對(duì)大腸桿菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑達(dá)到（19.0±0.36）mm，其次為沙門菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌。杏香兔耳風(fēng)提取物C對(duì)啤酒酵母有微弱的抑菌效果，抑菌圈直徑為（7.2±0.15）mm。杏香兔耳風(fēng)提取物A和杏香兔耳風(fēng)提取物B對(duì)霉菌和酵母菌以及杏香兔耳風(fēng)提取物C對(duì)霉菌都無明顯的抑菌作用。

表1 3種杏香兔耳風(fēng)提取物的抑菌效果

3.2 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

杏香兔耳風(fēng)提取物A、杏香兔耳風(fēng)提取物B和杏香兔耳風(fēng)提取物C對(duì)供試菌的最低抑菌濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2～4。表2～4中的數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，3種提取物對(duì)細(xì)菌的抑菌能力明顯大于酵母菌和霉菌。從表2可以看出，隨著提取物溶液濃度的增加，3種杏香兔耳風(fēng)提取物抑菌作用相應(yīng)增強(qiáng)，杏香兔耳風(fēng)提取物A對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門菌的最低抑菌濃度（MIC）為0.313%，對(duì)枯草芽孢桿菌為0.625%；杏香兔耳風(fēng)提取物A濃度較高時(shí)對(duì)酵母菌也有一定的抑菌作用，其MIC為10%。從表3可知，杏香兔耳風(fēng)提取物B對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為0.156%，對(duì)沙門菌的MIC為0.625%，對(duì)大腸桿菌和枯草桿菌的MIC為1.25%。由表4可以看出，杏香兔耳風(fēng)提取物C對(duì)大腸桿菌的MIC為0.156%，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和沙門菌的MIC分別為1.25%、0.625%和0.313%；對(duì)酵母菌的MIC為2.5%?？梢?種提取物在較低濃度下對(duì)細(xì)菌都有較明顯的抑制作用，在較高濃度時(shí)對(duì)酵母菌有一定的抑制作用，對(duì)霉菌基本無抑制。

3.3 抑菌或殺菌活性的初步探討

由表5可知，杏香兔耳風(fēng)提取物A和杏香兔耳風(fēng)提取物B對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草桿菌有殺菌作用，而對(duì)大腸桿菌和沙門菌可能是抑菌作用；杏香兔耳風(fēng)提取物C對(duì)四種細(xì)菌可能都是抑菌作用。

4 討 論

對(duì)一種未知抑菌物質(zhì)中有效成分抗菌效力的測(cè)定，通常是借鑒抗生素微生物檢定法，即利用物質(zhì)抑制或殺死細(xì)菌或真菌的程度作為客觀指標(biāo)來衡量物質(zhì)中有效成分效力的一種方法。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理的不同，檢定法一般分為稀釋法、比濁法和瓊脂擴(kuò)散法。稀釋法包括液體稀釋法和固體稀釋法，現(xiàn)在已不用來測(cè)定抗菌物質(zhì)的效價(jià)，而以之測(cè)定抗菌物質(zhì)的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度。該方法程序繁瑣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦受多種因素影響，即使控制實(shí)驗(yàn)條件一致，也會(huì)因逐級(jí)稀釋造成的誤差、物質(zhì)分散的不均勻，導(dǎo)致所得的MIC值可能會(huì)有偏差。瓊脂平板擴(kuò)散法是利用抗菌物質(zhì)在瓊脂中擴(kuò)散使其周圍的細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制而形成抑菌圈，根據(jù)抑菌圈大小來判斷細(xì)菌和真菌對(duì)抑菌物質(zhì)的敏感程度，得出抗菌物質(zhì)的抑菌作用大小和抗菌譜的一種方法。此法簡(jiǎn)便、易操作，但因抑菌圈大小受多種因素影響，如培養(yǎng)基成分、pH值、瓊脂來源和濃度、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、藥效、藥液濃度等，即使控制條件一致，也會(huì)因不同菌種生長(zhǎng)到肉眼可見所需時(shí)間不同、不同物質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)不同，因而精確度不夠高，一般只能用于定性或初步判斷其作用強(qiáng)弱。因此本實(shí)驗(yàn)采用稀釋法和擴(kuò)散法共同對(duì)杏香兔耳風(fēng)提取物的抑菌效果進(jìn)行檢測(cè)，以求達(dá)到一個(gè)更加準(zhǔn)確的結(jié)果。

表2 杏香兔耳風(fēng)提取物A對(duì)供試菌的最低抑菌濃度（MIC）

表3 杏香兔耳風(fēng)提取物B對(duì)供試菌的最低抑菌濃度（MIC）

表4 杏香兔耳風(fēng)提取物C對(duì)供試菌的最低抑菌濃度（MIC）

表5 3種杏香兔耳風(fēng)提取物的抑菌或殺菌的初步探討

由表1～5可知，3種杏香兔耳風(fēng)提取物對(duì)所選的細(xì)菌都有較強(qiáng)的抑菌作用，其中杏香兔耳風(fēng)提取物A對(duì)大腸桿菌抑菌效果最好，杏香兔耳風(fēng)提取物B對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，杏香兔耳風(fēng)提取物C對(duì)大腸桿菌的抑菌效果最好，其抑菌圈直徑分別為（12.2±0.27）、（15.8±0.16）、（19.0±0.36）mm，最低抑菌濃度分別為 0.313%、0.156%、0.156%。但是3種杏香兔耳風(fēng)提取物對(duì)酵母菌的抑制作用不強(qiáng)，對(duì)霉菌基本無抑制作用。杏香兔耳風(fēng)提取物A和杏香兔耳風(fēng)提取物B對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草桿菌殺菌作用，而對(duì)大腸桿菌和沙門菌可能是抑菌作用；杏香兔耳風(fēng)提取物C對(duì)4種細(xì)菌可能都是抑菌作用。因此，3種杏香兔耳風(fēng)提取物具有良好的臨床開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

[1] 沈萍,范秀容,李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M] .北京：高等教育出版社,1999.

[2] 范秀容,李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M] .2版.北京：高等教育出版社,1989.

[3] 姚淑敏.蘆薈提取物抑菌作用的研究[J] .食品科學(xué),2002,23(4)：137-139.

[4] 謝主蘭,吳文龍.榕樹葉抑菌作用的試驗(yàn)研究[J] .食品研究與開發(fā),2004,23(2)：7-9.

[5] 胡靜麗.楊梅葉提取物抑菌作用的研究[D] .杭州：浙江大學(xué),2002.