張利國,周 杰,林建華,張 興

(1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院肝膽外科,廣州510515;2.河南省魯山縣人民醫(yī)院 467300)

肝細(xì)胞肝癌是一種嚴(yán)重危害人類生命健康的惡性腫瘤。其發(fā)病率居高不下,早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療可以提高患者的生存率,改善其預(yù)后[1]。而對肝腫瘤的早期診斷,目前采用的B超、CT掃描等手段通常難以實(shí)現(xiàn);檢測AFP可以作為腫瘤標(biāo)志物用于肝癌人群篩檢,但其陽性率和特異性較低,結(jié)果不夠理想,因而使用新的、更為敏感的肝癌標(biāo)志物就顯得非常的必要。作者應(yīng)用靈敏的熒光定量PCR技術(shù)分析肝細(xì)胞肝癌患者外周血中AFP mRNA、h-TERT m RNA的表達(dá)量作為腫瘤標(biāo)志物,達(dá)到對肝細(xì)胞肝癌的早期診斷,為臨床早期診斷提供更為合理的方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料 南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院肝膽外科2008年1～11月收治的肝癌患者,術(shù)前經(jīng)影像學(xué)、血清AFP檢測以及臨床資料證實(shí)為原發(fā)性肝癌,并行肝癌切除手術(shù)治療,術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)為肝細(xì)胞癌患者60例,其中男38例,女22例,患者平均年齡(51.2±10.4)歲;血清 AFP陽性(AFP≥200μg/L)40例(66.7%);腫瘤直徑大于或等于 5 cm者 36例(60%);肉眼及鏡下門靜脈癌栓14例(23.3%);肝內(nèi)轉(zhuǎn)移者16例(26.7%);肝外轉(zhuǎn)移者8例(13.3%);腫瘤細(xì)胞分化程度高、中、低度者分別為 20例(33.3%)、28例(46.7%)、12例(20%)。對照組為35例肝外良性病變者或健康人。

1.2 標(biāo)本采集 所有對象均于清晨空腹采集外周靜脈血5 mL,應(yīng)用含EDTA的抗凝劑抗凝。靜脈血采集后立即提取總RNA。

1.3 總RNA的提取與cDNA的合成 總RNA的提取按TRIZOL(invitrogen)說明書進(jìn)行操作?？俁NA提取后即進(jìn)行cDNA合成,反應(yīng)體系包括:(1)5×緩沖液4μL;(2)dNTP(10 mM)1μL;(3)隨機(jī)引物(50 uM)1μL;(4)RNasin(40 u/μL)1μL;(5)M-MLV(200 u/μL)1μL;(6)總 RNA 1～2μg;(7)加DEPC處理的三蒸水至20μL。在全自動PCR儀按照說明設(shè)定參數(shù),產(chǎn)物置于-20℃冰箱備用。

1.4 熒光定量 PCR檢測AFP mRNA、h-TERT mRNA方法的建立

表1 AFP mRNA和h-TERT mRNA在肝癌和對照組的相對表達(dá)量

1.4.1 引物的設(shè)計(jì)、合成 從GenBank中調(diào)出 AFP和h-TERT的 RNA序列,根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,跨內(nèi)含子序列。AFP上游引物:5′-AGA TAG CAA GAA GGC ATC CCT T-3′;下游引物:5′-CCT TTG TTT GGA AGC ATT CAA CTG 3′;h-TERT上游引物:5′-CGG AAG AGT GTC TGG AGC AA-3′;下游引物:5′-GGA TGA AGC GGA GTC TGG A-3′;GAPDH上游引物:5′-GGG TGT GAA CCA TGA GAA TG-3′;下游引物:5′-CCA AAG TTG TCA TGG ATG ACC T-3′;引物由上海英駿公司合成。

1.4.2 FQ-PCR定量分析 用real-time PCR儀(Bio-Rad公司)及SYBRGreenⅠ(北京百泰克公司)試劑,進(jìn)行熒光定量分析AFP mRNA 、h-TERT mRNA含量,并用GAPDH作為參照正?；Ｕ７謩e用AFP、h-TERT的cDNA樣品和GADPH樣品倍比稀釋做標(biāo)準(zhǔn)曲線,呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,r2分別是0.999、0.998和0.999。樣品管均外加 2個(gè)復(fù)管,結(jié)果取其均值,另設(shè)空白和陰性對照管。FQ-PCR反應(yīng)條件:93℃預(yù)變性2 min,93℃45 s,55℃120 s,共 45個(gè)循環(huán),反應(yīng)結(jié)束后熒光定量儀自動給出相關(guān)的結(jié)果和曲線。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以ΔCt為差異比較的基礎(chǔ),相對定量公式為 2-ΔΔCt;其中 ΔΔCt=ΔCt(未知樣品)-ΔCt(內(nèi)參),結(jié)果為倍數(shù)關(guān)系。Ct值反映了模板擴(kuò)增到一定量拷貝數(shù)時(shí)(處于指數(shù)上升期)所需反應(yīng)循環(huán)數(shù)大小。Ct值越大,參與反應(yīng)的起始的模板量就越小,反之則越大。用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間的比較和相關(guān)性統(tǒng)計(jì)均用χ2檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

以循環(huán)數(shù)Ct為縱坐標(biāo),以樣品各稀釋度的倍數(shù)值為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,觀察到各個(gè)指標(biāo)的擴(kuò)增效率基本一致,可以用2-△△CT分析數(shù)據(jù),結(jié)果見表 1。

各組間表達(dá)結(jié)果差異顯著,同時(shí)AFP mRNA、h-TERT mRNA在各組中的陽性表達(dá)也存在較大差異,結(jié)果見表2。

表2 AFPmRNA、h-TERT mRNA在兩組表達(dá)情況[n(%)]

在對照組35例中,無論是AFP mRNA還是h-TERT mRNA,幾乎沒有表達(dá),僅1例h-TERT mRNA表達(dá)陽性,而在肝細(xì)胞肝癌中二者都有明顯的表達(dá),兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。在肝細(xì)胞肝癌患者中,AFPmRNA和h-TERT mRNA的陽性檢出率分別為76.7%、83.3%,與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。進(jìn)一步分析它們表達(dá)的相關(guān)因素,有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與肝內(nèi)轉(zhuǎn)移者陽性率均為100%。其表達(dá)和血清中AFP的量以及腫瘤的分化程度沒有明顯相關(guān)性(P＞0.05),與門靜脈癌栓也密切相關(guān)(P＜0.05)。

3 討 論

由于mRNA不僅是基因在轉(zhuǎn)錄水平的表現(xiàn),也可作為細(xì)胞表型的標(biāo)志,能在細(xì)胞無任何形態(tài)變化的情況下判斷該細(xì)胞的表現(xiàn)型,因此,其作為肝細(xì)胞肝癌診斷指標(biāo)可以發(fā)現(xiàn)一些早期甚至是亞臨床期的肝細(xì)胞肝癌?，F(xiàn)采用外周血循環(huán)細(xì)胞RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR檢測腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)情況,由此判斷是否存在癌細(xì)胞,以達(dá)到早期診斷腫瘤的目的。在部分肝細(xì)胞肝癌患者中,由于AFP基因在表達(dá)過程中翻譯缺失而停止轉(zhuǎn)錄之后,血清AFP表達(dá)為陰性[2],而AFP mRNA則為陽性,故檢測AFP mRNA可對血清AFP陰性的患者做出早期診斷,彌補(bǔ)了現(xiàn)行單純以AFP作為診斷依據(jù)的不足。本研究也證實(shí),肝細(xì)胞肝癌患者 AFP陽性率為 66.7%,而AFP m RNA的陽性率為76.7%,是比AFP更加敏感的指標(biāo)。近年來,國內(nèi)外很多學(xué)者報(bào)道了RT-PCR法檢測外周血中AFP mRNA在肝癌診斷和鑒別診斷中的作用。石宏等[3]報(bào)道檢測患者外周血中癌細(xì)胞表達(dá)的AFP m RNA陽性率為76%,高于血清AFP陽性率64%,表明檢測AFP m RNA較 AFP靈敏度高,在部分血清AFP陰性的肝細(xì)胞肝癌患者,檢測外周血AFPm RNA有助于診斷的確立。Zhu等[4]的研究結(jié)果表明,外周血AFP m RNA在原發(fā)性肝癌患者中的檢出率為53.7%,AFP mRNA檢出率與血清AFP濃度之間無明顯關(guān)系。因此,檢測外周血AFP mRNA與血清AFP有互補(bǔ)性,對血清AFP陰性的部分PHC可做出診斷,提高診斷準(zhǔn)確率。本研究以單純的肝細(xì)胞肝癌為對象,排除了膽管細(xì)胞癌和混合細(xì)胞癌,故AFP mRNA的結(jié)果更高,達(dá)到 76.7%,陽性率也顯著提高。Tamaoki和Fausto[5]認(rèn)為在肝細(xì)胞肝癌患者中,AFP基因的表達(dá)再次被激活,其AFP m RNA的水平高于正常肝細(xì)胞的30～1 000倍。本實(shí)驗(yàn)證明,如果應(yīng)用更為靈敏的熒光定量PCR技術(shù),則肝細(xì)胞肝癌患者外周血中AFP m RNA的檢出率明顯增高,但總體陽性率仍不是非常滿意,存在偏低的問題。本研究的陽性率也只有76.7%,如果采取聯(lián)合檢測h-TERT m RNA則可以較好地解決這個(gè)問題。徐焰等[6]證實(shí),聯(lián)合檢測可以明顯提高肝癌的診斷率。h-TERT mRNA在良性疾病患者和健康人中幾乎不表達(dá),在惡性腫瘤患者中才會出現(xiàn)較高的表達(dá),是檢測惡性腫瘤的一個(gè)很好的標(biāo)志物。大多數(shù)惡性腫瘤端粒酶活性升高,檢測端粒酶的表達(dá)為惡性腫瘤的診斷和治療開辟了新的途徑,已成為診斷惡性腫瘤和判斷預(yù)后的重要指標(biāo)。Wang等[7-8]應(yīng)用熒光定量技術(shù)檢測外周血中h-TERT mRNA的表達(dá),結(jié)果顯示該項(xiàng)指標(biāo)在作為腫瘤標(biāo)志物的價(jià)值優(yōu)于AFP m RNA。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也說明,h-TERT m RNA是比AFP mRNA更敏感的指標(biāo),其陽性率達(dá)83.3%?？傮w來說,單純應(yīng)用一種作為檢驗(yàn)指標(biāo)還存在陽性率較低的問題,如果把兩者結(jié)合,則可以使肝細(xì)胞肝癌的檢出率提高到92.6%,比現(xiàn)行的檢測AFP的做法優(yōu)越,同時(shí)其特異性也達(dá)到97.2%,是非常理想的腫瘤診斷標(biāo)志物。

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