喬 鑫，黃紅霞，喬 宇，康 旭，李冬生,2,*

(1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430068；2.湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430068；3.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北 武漢 430064)

響應(yīng)面分析法優(yōu)化HS-SPME萃取黃豆醬揮發(fā)性成分工藝研究

喬 鑫1，黃紅霞1，喬 宇3，康 旭1，李冬生1,2,*

(1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430068；2.湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430068；3.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北 武漢 430064)

為了優(yōu)化黃豆醬揮發(fā)性風(fēng)味成分檢測的SPME萃取效率，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法和響應(yīng)面分析法對黃豆醬風(fēng)味萃取條件進(jìn)行優(yōu)化。先用Plackett-Burman設(shè)計(jì)從8種萃取因素中篩選出對總峰面積有顯著影響的因素，再用最陡爬坡試驗(yàn)及Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化。結(jié)果表明，萃取溫度、萃取時(shí)間和基體中的無機(jī)鹽添加量是影響總峰面積的顯著因素，優(yōu)化后的萃取條件為萃取溫度56℃、萃取時(shí)間42min、基體中的無機(jī)鹽添加量0.98g。在優(yōu)化條件下，與初始最大總峰面積12880000相比，總峰面積提高到13107129。

豆醬；響應(yīng)面法；條件優(yōu)化；HS-SPME

Abstract：In order to enhance the extraction efficiency of soybean paste flavor components, Plaekett-Burman design and response surface methodology were used to optimize extraction conditions. Eight factors were evaluated by Plackett-Burman design on the basis of total peak area and further optimization was performed by Box-Behnken experiments. Results showed that extraction temperature, extraction time and the addition amount of inorganic salts played important roles in the extraction of essential flavor components. The optimal extraction parameters were extraction temperature of 56 ℃, extraction time of 42 min and sodium chloride addition amount of 0.98 g. Under the optimal extraction condition, the total content of volatile flavor components was significantly improved according to the increase of total peak area from 12880000 to13107129.

Key words：soybean paste；response surface methodology；technology optimization；HS-SPME

黃豆醬(soybean paste)在我國有著悠久的歷史，是人民生活中不可缺少的調(diào)味品，風(fēng)味又是調(diào)味品至關(guān)重要的品質(zhì)特性，對其研究有著必要的意義[1]。但目前存在的主要問題之一是揮發(fā)性成分提取手段有局限性，很難真實(shí)反映產(chǎn)品氣味組成。近幾年頂空固相微萃取(HSSPME)作為一種新的揮發(fā)性物質(zhì)采樣技術(shù)被廣泛應(yīng)用，它通過吸附/脫附技術(shù)，主要富集樣品中的揮發(fā)和半揮發(fā)性成分，靈敏度高、重現(xiàn)性及線性好、操作簡單方便快速并能較真實(shí)地反映樣品特別是活體樣品的風(fēng)味組成[2-3]。Gianelli等[4]和徐琳娜等[5]對黃豆醬香氣成分的萃取做過研究，但黃豆醬萃取工藝的優(yōu)化研究還未見報(bào)道?；诖?，本研究采用頂空固相微萃取并結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化萃取條件，以提高黃豆醬香氣的萃取效率。

東北豆醬不僅在原料上為當(dāng)?shù)鼐x品種，而且醬香濃郁。本研究以東北知名醬業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)豆醬作為研究對象，通過因素篩選，最終選取萃取溫度、萃取時(shí)間和基體中的無機(jī)鹽添加量3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，利用響應(yīng)面法優(yōu)化黃豆醬香氣的最佳萃取工藝參數(shù)，以期為黃豆醬香氣成分研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑龍江省某知名醬業(yè)公司生產(chǎn)，樣品保存于密封袋中，4℃冷藏備用。

1.2 儀器與設(shè)備

固相微萃取(SPME)裝置：萃取頭DVB/CAR/PDMS 50/30μm(二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷) 美國Supelco公司；GC-2014AFSPL氣相色譜儀 日本島津公司；7890N/5975MSD風(fēng)味檢測氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國Agilent公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃豆醬揮發(fā)性成分的測定

稱取一定量醬醅，并與一定量無機(jī)鹽(NaC1)和一定去離子水體積混合均勻后加入15mL樣品瓶中，將樣品瓶放入一定溫度的水浴中平衡5min，再將已老化好的萃取針頭插入樣品瓶中，用手柄將石英纖維頭推出暴露到樣品瓶頂空氣體中，恒溫萃取一段時(shí)間，用手柄將纖維頭推回針頭內(nèi)，將萃取針頭拔出，插入GC-MS進(jìn)樣器中解析一定時(shí)間。

1.3.2 萃取頭老化

將DVB/CAR/PDMS 50/30μm固相微萃頭在氣相色譜的進(jìn)樣口老化至無雜峰，老化溫度270℃，老化時(shí)間1h[6]。

1.3.3 GC-MS參數(shù)條件

色譜柱：RTX-1毛細(xì)管色譜柱(30.0m×0.25mm，0.25μm)；升溫條件：柱溫40℃保持1min，以5℃/min上升到130℃，保持1min，再以8℃/min上升到250℃，保持1min；進(jìn)樣口溫度為250℃；FID檢測器溫度為300℃；載氣N2，流速30mL/min；燃?xì)釮2，流速300mL/min；助燃?xì)饪諝猓魉?00mL/min；分流比5.0。

1.4 優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 Plackett-Burman

設(shè)計(jì)在優(yōu)化初期利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法[7]，對影響固相微萃取的8個(gè)因素進(jìn)行考察。萃取溫度(X1)、萃取時(shí)間(X2)、解析時(shí)間(X3)、攪拌速度(X4)、樣品質(zhì)量(X5)、去離子水體積(X6)、基體中的無機(jī)鹽添加量(X7)、pH值(X8)，分別作為PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)的8個(gè)因素，每個(gè)因素取兩個(gè)水平，即低水平(－1)和高水平(+1)，總峰面積作為響應(yīng)值Y[8]。

1.4.2 最陡爬坡試驗(yàn)

響應(yīng)面擬合方程只有在考察的緊接鄰域里才充分近似真實(shí)結(jié)果，故只有先逼近最大目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量區(qū)域后才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程[9]。根據(jù)PB試驗(yàn)篩選出的對峰面積影響顯著的因素，以各顯著因素的正負(fù)效應(yīng)確定最陡爬坡試驗(yàn)的路徑(包括變化方向和變化步長)，快速的逼近最大響應(yīng)區(qū)域。

1.4.3 Box-Behnken設(shè)計(jì)

以PB試驗(yàn)篩選得到的對總峰面積影響顯著的因素作為設(shè)計(jì)因素，以最陡爬坡試驗(yàn)得出的濃度作為中心點(diǎn)，根據(jù)相應(yīng)的試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)后，使用SAS 9.0對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響因素的篩選

按照Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對影響固相微萃取萃取條件的8個(gè)因素進(jìn)行考察，Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)[8]及結(jié)果見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Design and results of Plackett-Burman experiments

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素水平編碼及影響效果Table 2 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

由2.1節(jié)可知，萃取溫度有高度顯著影響；萃取時(shí)間有顯著影響；基體中無機(jī)鹽添加量、解析時(shí)間、攪拌速度、樣品質(zhì)量、去離子水體積、pH值對總峰面積均無顯著影響，但一般可信度大于90%可作為主要影響因素[11]，基體中無機(jī)鹽添加量屬主要影響因素。萃取溫度和萃取時(shí)間對總峰面積有顯著正效應(yīng)，而基體中的無機(jī)鹽添加量有顯著負(fù)效應(yīng)，這3個(gè)因素有待進(jìn)一步研究。根據(jù)萃取溫度、萃取時(shí)間和基體中無機(jī)鹽添加量這3個(gè)因素效應(yīng)大小的比率設(shè)定它們的變化方向及步長進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，設(shè)計(jì)及結(jié)果處理見表3。由表3可知，隨萃取溫度、萃取時(shí)間、基體中無機(jī)鹽添加量的變化，總峰面積呈先上升后下降，當(dāng)萃取溫度55℃、萃取時(shí)間40min、基體中的無機(jī)鹽添加量0.8g時(shí)，所對應(yīng)的總峰面積達(dá)到最大值，故以條件3為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)，進(jìn)行下一步優(yōu)化試驗(yàn)。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of the steepest ascent experiments

2.3 最佳萃取條件的優(yōu)化[12-14]

2.3.1 響應(yīng)面分析因素水平的選取

在最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)，運(yùn)用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[15]，選擇黃豆醬揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)提取條件對總峰面積影響顯著的3個(gè)因素，萃取溫度(X1)、萃取時(shí)間(X2)和基體中無機(jī)鹽添加量(X3)，做三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表4。

表4 響應(yīng)面分析因素及水平Table 4 Factors and levels of response surface design

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化方案

表5為響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)號1～12是析因試驗(yàn)，試驗(yàn)號13～15是中心試驗(yàn)。15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)3次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。RSM軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，回歸分析結(jié)果見表6。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)結(jié)果Table 5 Design and results of response surface experiments

表6 回歸方程方差分析Table 6 Variance analysis of regression equation

2.3.3 因素間的交互作用分析

圖1結(jié)果顯示了基體中的無機(jī)鹽添加量取中心水平時(shí)，萃取溫度和萃取時(shí)間對總峰面積的交互作用。從等高線圖接近圓形可知交互作用不顯著，隨著萃取溫度延長和萃取時(shí)間的增加，總峰面積在不斷的增大，當(dāng)萃取溫度和萃取時(shí)間升高到一定程度后，響應(yīng)值值達(dá)到最大；萃取溫度和萃取時(shí)間繼續(xù)升高時(shí)，總峰面積又會隨之下降。說明萃取溫度過高或過低和萃取時(shí)間過大或過小都不能使響應(yīng)值達(dá)到最大值，只有它們?nèi)〉侥硞€(gè)適中值時(shí)，才可使總峰面積達(dá)到最大值。

圖1 萃取溫度(X1)和萃取時(shí)間(X2)對總峰面積(Y)的相應(yīng)面圖和等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between extraction temperature and extraction time on total content of volatile flavor compounds

圖2 萃取溫度(X1)和無機(jī)鹽添加量(X3)對總峰面積(Y)的相應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between extraction temperature and inorganic salt addition amount on total content of volatile flavor compounds

圖2結(jié)果顯示了萃取時(shí)間取中心水平時(shí)，萃取溫度和基體中的無機(jī)鹽添加量對總峰面積的交互作用。從等高線圖接近橢圓形可知交互作用顯著，在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)總峰面積隨萃取溫度的增加呈現(xiàn)出先增加后略減小的趨勢。原因可能是溫度過低，未達(dá)到豆醬部分風(fēng)味物質(zhì)的沸點(diǎn)，高沸點(diǎn)的風(fēng)味物質(zhì)無法揮發(fā)出來，總峰面積相對較少；隨溫度升高，萃取頭萃取分析能力降低，從而導(dǎo)致萃取頭固有吸附組分會發(fā)生解吸[17]，總峰面積發(fā)生減少現(xiàn)象。

圖3 萃取時(shí)間(X2)和無機(jī)鹽添加量(X3)對總峰面積(Y)的相應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between extraction time and inorganic salt addition amount on total content of volatile flavor compounds

圖3結(jié)果顯示了萃取溫度取中心水平時(shí)，萃取時(shí)間和基體中的無機(jī)鹽添加量對總峰面積的交互作用。從等高線圖接近橢圓形可知交互作用顯著，萃取時(shí)間影響顯著，在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，萃取時(shí)間的增加總峰面積呈明顯的先增加后略減小的趨勢。而基體中的無機(jī)鹽添加量的增大，總峰面積緩慢增大后基本保持不變。原因可能是無機(jī)鹽添加量增加有利于豆醬樣品中風(fēng)味物質(zhì)的揮發(fā)，但到達(dá)一定程度后，豆醬樣品中無機(jī)鹽處于飽和狀態(tài)[12]，于是總峰面積基本保持恒定。

2.4 豆醬揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取回歸模型的建立及檢驗(yàn)

對各因素回歸擬合后，得到回歸方程：

所得的回歸方程能較好的預(yù)測豆醬揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取隨各參數(shù)的變化規(guī)律，可以利用該回歸方程確定最佳提取條件。對回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)等于零，聯(lián)立方程組解得：X1=0.14，X2=0.18，X3=1.8，即可換算得到萃取溫度55.75℃、萃取時(shí)間41.8min、基體中的無機(jī)鹽添加量0.98g?？紤]到實(shí)際操作的便利，確定豆醬揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取條件為萃取溫度56℃、萃取時(shí)間42min、基體中的無機(jī)鹽添加量0.98g。由回歸方程預(yù)測豆醬揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取條件理論總峰面積可達(dá)13107129。

表7 豆醬中鑒定出的揮發(fā)性化合物Table 7 Identified volatile flavor compounds in soybean paste

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：在上述響應(yīng)面分析結(jié)果確定的最佳條件下進(jìn)行3次萃取實(shí)驗(yàn)，得到豆醬揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的平均總峰面積為13001025，與預(yù)測值13107129基本一致，說明該方程與實(shí)際情況擬合很好，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性，說明響應(yīng)面法適用于對豆醬揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

2.5 醬樣品中揮發(fā)性風(fēng)味成分的分析檢驗(yàn)

采用優(yōu)化后的固相微萃取條件并結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用測定了豆醬樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味成分。豆醬樣品中各揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類及相對含量見表7。

根據(jù)表7，豆醬樣品中共鑒定出36種揮發(fā)性風(fēng)味成分，這些成分包括酯類、醛類、酸類、醇類、酮類、酚類和含氮化合物等幾類物質(zhì)，可見此優(yōu)化方法能較完全地萃取豆醬樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味成分。從單個(gè)風(fēng)味化合物檢出頻次看，典型風(fēng)味化合物苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、棕櫚酸甲酯、安息香醛、風(fēng)信子醛[18]和4-乙基愈創(chuàng)木酚[6]均被檢測到，且檢測量較高。

酯類易揮發(fā)，人嗅覺對此類物質(zhì)也比較敏感，因而酯類是發(fā)酵食品風(fēng)味的重要組分；本優(yōu)化方法共檢出9種酯類，且這些酯類物質(zhì)的氣味強(qiáng)度適中，溫和厚重，是豆醬香味的底蘊(yùn)。醛類物質(zhì)的閾值一般較低，對食品整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)較大；檢出的7種風(fēng)味化合物無論種類還是總相對含量均較高。醇類化合物的風(fēng)味閾值較高，對整體風(fēng)味貢獻(xiàn)較小，此方法僅檢測出苯乙醇。酚類及含氮化合物由于其風(fēng)味閾值很低，對黃豆醬的整體風(fēng)味貢獻(xiàn)很大，兩類物質(zhì)各檢出5種風(fēng)味物質(zhì)。酸類、酮類及烷烴類為“風(fēng)味物質(zhì)前體庫”，在后熟期間再經(jīng)一系列復(fù)雜的發(fā)酵代謝和生化反應(yīng)，這三類物質(zhì)檢出種類相對不多。該優(yōu)化方法簡便、快速、經(jīng)濟(jì)安全、無溶劑、選擇性好且靈敏度高，集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體，大大加快了分析檢測的速度，對大分子物質(zhì)的吸附能力較強(qiáng)，能較好地體現(xiàn)出黃豆醬本身的風(fēng)味特征，適于分析黃豆醬風(fēng)味物質(zhì)的組成。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)證明響應(yīng)面方法對豆醬揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取是非常有效的工具，Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)能對影響總峰面積的各因素效應(yīng)進(jìn)行評價(jià)并能有效地找出主要因素，最陡爬坡法能充分接近最大響應(yīng)面區(qū)域，B o x-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)能建立主要因素影響總峰面積的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對該模型進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn)，優(yōu)化了內(nèi)在因素水平，找出最佳值。該研究經(jīng)響應(yīng)面方法優(yōu)化，得出豆醬揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取的最佳工藝條件為萃取溫度56℃、萃取時(shí)間42min、基體中的無機(jī)鹽添加量0.98g。在優(yōu)化條件下經(jīng)3次萃取實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，預(yù)測值與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)平均值接近，與初始最大總峰面積12880000相比，總峰面積有所提高，達(dá)到13107129；且優(yōu)化方法能較好地體現(xiàn)出黃豆醬本身的風(fēng)味特征，適于分析黃豆醬風(fēng)味物質(zhì)的組成。

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Optimization of HS-SPME Extraction for Volatile Flavor Compounds from Soybean Paste by Response Surface Methodology

QIAO Xin1，HUANG Hong-xia1，QIAO Yu3，KANG Xu1，LI Dong-sheng1,2,*
(1. College of Bioengineering, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China；2. Food Fermentation Engineering and Technology Research Center of Hubei, Wuhan 430068, China；3. Institute of Agricultural Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064, China)

TS207.3

A

1002-6630(2010)22-0069-06

2010-07-23

湖北省科技廳重大攻關(guān)項(xiàng)目(鄂財(cái)企發(fā)[2007]119號)

喬鑫(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：qiaoxinspring@163.com

*通信作者：李冬生(1961—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：dongshengli86@163.com