富昊偉,李友發(fā),馬興華,舒慶堯

(1嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 ,浙江嘉興 314016;2浙江大學(xué)核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,杭州 310029)

中國完成雜交水稻不育系、保持系和恢復(fù)系的“三系”配套,迄今已逾 30年?！叭怠辈挥祷謴?fù)性的遺傳研究20世紀(jì)80年代中期已基本完成,主要是以單株或主穗的結(jié)實(shí)率為恢復(fù)基因表現(xiàn)型的考查指標(biāo),多數(shù)研究認(rèn)為對(duì)野敗胞質(zhì)不育的主效恢復(fù)效應(yīng)由 2對(duì)主基因控制[1～4],這對(duì)恢復(fù)系的育種實(shí)踐起到了很好的指導(dǎo)作用。

“三系”不育系有一個(gè)普遍的現(xiàn)象:大量的保持系材料,最后轉(zhuǎn)育成的“不育系”,常常因育性不穩(wěn)定而不能成為有實(shí)用價(jià)值的不育系。即使生產(chǎn)上應(yīng)用較廣的不育系如Ⅱ -32A、龍?zhí)仄?A等,也出現(xiàn)了這種因育性不穩(wěn)定而導(dǎo)致的自交結(jié)實(shí)現(xiàn)象[5]。對(duì)這種現(xiàn)象的研究相對(duì)很少。雷捷成等在分析該類型保持系轉(zhuǎn)育不育系的測交 F1的花粉育性后,提出存在隱性的恢復(fù)基因,后來又進(jìn)一步修正為微效恢復(fù)基因,即 r基因[6,7]。其后游年順等進(jìn)一步認(rèn)為,微效恢復(fù)基因的表現(xiàn)型是轉(zhuǎn)不育系雜交 F1的花粉黑染現(xiàn)象,并提出黑染率 0.1%～10%是含微效恢復(fù)基因品種的表現(xiàn);同時(shí)還觀察到轉(zhuǎn)育不育系各世代的植株中經(jīng)常出現(xiàn)“嵌合體”現(xiàn)象,即一朵穎花的 6個(gè)花藥中,有1～2個(gè)可育花藥,推測微效恢復(fù)基因受隱性多基因控制[8,9]。上述研究對(duì)微效恢復(fù)基因表現(xiàn)型及遺傳特性認(rèn)識(shí)提供了有用信息。

本研究旨在通過對(duì)一些典型保持系材料在轉(zhuǎn)育“三系”不育系時(shí)各世代的育性觀察,探討微效恢復(fù)基因的 3種典型表現(xiàn)型特性,并探尋類似主效恢復(fù)基因遺傳研究中結(jié)實(shí)率這樣的量化指標(biāo),以為進(jìn)一步研究微效恢復(fù)基因的遺傳及分子標(biāo)記等打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

4組“三系”不育系和保持系應(yīng)用于本研究,分別為紫興05A,紫興05B;協(xié)青早 A,協(xié)青早B;黃玉 A,黃玉B;嘉浙 A,嘉浙 B。協(xié)青早A系商業(yè)應(yīng)用20多年的不育系,應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)常有育性波動(dòng),認(rèn)為含微效恢復(fù)基因。本研究應(yīng)用的各世代種子系引進(jìn)保持系后采用人工成對(duì)回交的方法獲得。嘉浙A,紫興05A,黃玉A系浙江大學(xué)或浙江嘉興農(nóng)科院選育,分別在 2000,2004,2005年通過浙江省技術(shù)鑒定[10～12]。在應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)嘉浙 A,黃玉A有不同程度的自交結(jié)實(shí),暗示含微效恢復(fù)基因,而紫興05A的不育性在生產(chǎn)上表現(xiàn)徹底敗育,研究前推測它不含微效恢復(fù)基因。

2005年春季在海南陵水、2005年夏季在浙江嘉興、2005年秋季在浙江嘉興、2006年春季在海南分別配置了紫興05A、協(xié)青早 A、黃玉 A、嘉浙 A與相應(yīng)保持系的高世代轉(zhuǎn)不育材料 BC8,BC9,BC10代種子(表 1)。需要說明的:一是協(xié)青早A系多年前引進(jìn),其轉(zhuǎn)育確切世代已無從查考,但肯定在 BC20以上,在表 1中參照紫興 05A等 3個(gè)材料的 BC8～BC10記錄;二是后 3組材料中 BC2代種子的獲得,在 BC1群體母本選株時(shí)均根據(jù)育種者的經(jīng)驗(yàn),盡可能選擇和輪回親本相似的單株和輪回親本雜交。

表1 4組不育系和保持系材料及各世代種子的配置

各組材料上一世代的種子均大半保留在冰箱,僅部分用于下一世代種子的繁殖。例如:紫興 05A/紫興05B是 2005年春季在海南收獲 20 g左右 F1代種子,其中 15 g貯存在 4℃冰箱,其余 5 g左右用于對(duì) BC1代種子的繁殖。下一世代種子的獲得均同此法。

1.2 方法

2007年夏季,表 1中的所有材料均種植在浙江省嘉興市農(nóng)科院試驗(yàn)區(qū)。每份材料均在30株以上,4月15日播種,5月12日移栽。田間管理注意肥水平衡,不缺肥不徒長,始穗期田間有淺水。

考查了不育系育性表現(xiàn)的 3種表現(xiàn)型,分別為自交套袋結(jié)實(shí)率、嵌合穎花率、黑染花粉率。具體的考查取樣及方法如下。

1.2.1 自交套袋

每份材料各種植30株。由于黃玉A、B的生育期較長,為了使其與其它各組材料基本在同一時(shí)段抽穗,黃玉 A/黃玉B及紫興05A/紫興05B二組材料4月 5日播種。其余5組材料4月30日播種。適時(shí)移栽,田間采用該季水稻常規(guī)肥水管理方法。抽穗階段逐日觀察植株的抽穗開花情況,每株植株的主穗抽出而尚未開花時(shí)(一般抽出 3～5 cm),用 7 cm×35cm的牛皮紙袋將穗套袋以隔斷外來花粉。在主穗套袋后 7 d,每株再套袋一個(gè)剛抽出未開花的遲分蘗穗(落腳穗)。均在套袋后20 d考查套袋自交結(jié)實(shí)率。

1.2.2 嵌合穎花率

上述材料每株植株均在抽穗階段選擇次于主穗的第二分蘗穗及7 d后的1個(gè)小分蘗穗。將該穗的每一朵穎花的6顆花藥均剝出來觀察花藥的顏色分離情況。6顆穎花全部為典型不育系瘦小乳白色花藥的為不育穎花;有1～6粒(含1粒)黃色飽滿花藥的,該朵穎花記為嵌合穎花。嵌合穎花占全部穎花的百分比,記為嵌合穎花率。

1.2.3 花粉育性

(1)隨機(jī)取樣的花粉育性。在上述觀察嵌合穎花率的取樣穗中,隨機(jī)在穗的上、中、下部各取 2朵穎花,每朵穎花隨機(jī)取 2～3個(gè)花藥混合后置于玻片上,加0.1%的 I2-IK溶液,用鑷子夾碎擠出花藥中的花粉。置于4×10倍的顯微鏡下觀察3個(gè)有代表性的視野,統(tǒng)計(jì)黑染花粉(即染敗和正?；ǚ壑?下同)的比例。

(2)選擇性取樣花藥的花粉育性。分別取在上述觀察中的兩類花粉觀察:一類為瘦小乳白色花藥,另一類為飽滿黃色的花藥。各挑取這樣的花藥5個(gè),混合置玻片上,加0.1%的I2-IK染色后,40倍顯微鏡下觀察3個(gè)有代表性的視野,統(tǒng)計(jì)黑染花粉的比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 不育系表現(xiàn)不同程度的可育性

4個(gè)高代不育系紫興 05A、協(xié)青早 A、黃玉 A、嘉浙A在3個(gè)世代的套袋自交結(jié)實(shí)率、嵌合穎花率、黑染花粉率的考查結(jié)果見表2。

(1)紫興 05A/紫興 05B。 BC8,BC9,BC10套袋自交結(jié)實(shí)率、嵌合穎花率主穗、遲分蘗穗均為0。該材料因沒有嵌合花藥,花粉育性檢測均是隨機(jī)取樣,主穗的黑染花粉率均為0;僅在遲分蘗穗的鏡檢花粉中發(fā)現(xiàn)極少量染敗花粉,各世代的黑染花粉率分別為 0.021%,0.014%和 0.018%,這和筆者選用該材料前歷次觀察試驗(yàn)(數(shù)據(jù)未給出)一致。

(2)協(xié)青早 A/協(xié)青早 B。 BC8,BC9,BC10主穗的套袋自交率介于 0.86%～1.12%,遲分蘗穗的套袋自交結(jié)實(shí)率介于 2.16%～2.97%;嵌合穎花率主穗介于10.30%～11.32%,遲分蘗穗介于16.88%～17.32%;隨機(jī)取樣的主穗黑染花粉率在 0.27%～0.36%,遲分蘗穗在 0.17%～0.21%;分類取樣中專門選擇嵌合穎花中飽滿黃花藥檢測的主穗黑染花粉率為 4.85%～5.21%,遲分蘗穗為6.09%～6.48%。

(3)黃玉 A/黃玉B。3個(gè)世代的主穗和遲分蘗穗的套袋自交結(jié)實(shí)率分別介于1.59%～2.00%和2.16%～2.97%;嵌合穎花率分別介于 22.59%～23.40%和30.09%～30.34%;隨機(jī)取樣的黑染花粉率則分別介于0.22%～0.37%和0.59%～0.83%。

(4)嘉浙 A/嘉浙 B。各世代的主穗和遲分蘗穗的套袋自交結(jié)實(shí)率分別介于1.47%～1.54%和2.89%～3.19%;嵌合穎花率分別介于 38.69%～40.83%和53.62%～57.35%;隨機(jī)取樣的黑染花粉率分別介于1.09%～1.42%和 2.61%～3.58%;飽滿黃花藥檢測的黑染花粉率分別為 15.98%～16.28%和 19.23%～21.44%。

表2 微效恢復(fù)基因各表現(xiàn)型在4個(gè)高代不育系中的表現(xiàn)

對(duì)上述 4組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,有如下發(fā)現(xiàn):(1)紫興05B各轉(zhuǎn)育世代檢測的各項(xiàng)指標(biāo)均為 0或趨向 0,因此認(rèn)為紫興05B不含微效恢復(fù)基因。而協(xié)青早B、黃玉B、嘉浙 B均有不同程度的套袋自交結(jié)實(shí)率、嵌合穎花率和黑染花粉率,且同一材料的這 3項(xiàng)指標(biāo)世代間表現(xiàn)穩(wěn)定,沒有顯著差異,由此推斷它們是含有微效恢復(fù)基因的保持系。(2)協(xié)青早 A、黃玉 A、嘉浙 A在套袋自交結(jié)實(shí)率和隨機(jī)取樣的花粉黑染率上無明顯差異,暗示套袋自交結(jié)實(shí)率和隨機(jī)取樣的黑染花粉率不能有效區(qū)分這3個(gè)材料微效恢復(fù)基因表達(dá)的不同。但在分類黃花藥取樣的黑染花粉率和嵌合穎花率兩個(gè)指標(biāo)上,三者之間存在顯著差異,可以有效區(qū)分三者的不同。(3)無論主穗或是遲分蘗穗,3項(xiàng)表現(xiàn)型指標(biāo)在3個(gè)材料中表現(xiàn)的共同特點(diǎn)是,嵌合穎花率>分類取樣中飽滿黃花藥的黑染花粉率>套袋自交率>隨機(jī)取樣的黑染花粉率。(4)嵌合穎花率的數(shù)值和套袋自交率或隨機(jī)取樣的黑染花粉率相比,存在10倍以上的數(shù)量級(jí)差異。以3個(gè)轉(zhuǎn)不育世代主穗平均值作比較,協(xié)青早 B的套袋自交結(jié)實(shí)率、黑染花粉率和嵌合穎花率分別為 1.01%,10.90%,0.33%;黃玉 B的分別為 1.77%,23.10%,0.31%;嘉浙 B的分別為1.50%,39.88%,1.23%。

2.2 不同表現(xiàn)型的可量化特點(diǎn)

套袋自交結(jié)實(shí)率是考查最方便的,也是主效恢復(fù)基因研究中應(yīng)用最多的育性考查指標(biāo),很自然地會(huì)推測其能否作為微效恢復(fù)基因的可量化指標(biāo)。從表2可以看出,套袋自交結(jié)實(shí)率作為不育系育性的表現(xiàn)型,有兩個(gè)特點(diǎn):一是結(jié)實(shí)率的絕對(duì)值很小,在 10-2數(shù)量級(jí),其二是標(biāo)準(zhǔn)差較大。以BC8代為例,協(xié)青早 A,黃玉 A,嘉浙 A的主穗套袋自交結(jié)實(shí)率分別為 0.86±0.55%,2.00± 0.73%,1.47± 1.31%,遲分蘗穗分別為 2.89±1.32%,2.97± 1.68%,3.13± 1.62% 。 BC9,BC10世代的數(shù)據(jù)也有相同趨勢。此外,考種實(shí)踐也證實(shí),該數(shù)量級(jí)的自交結(jié)實(shí)率,絕大部分套袋稻穗的結(jié)實(shí)谷粒在0～3粒之間,其表達(dá)的結(jié)實(shí)率變化的范圍相當(dāng)狹窄。此外,即使在嵌合穎花率達(dá)到40.83%的嘉浙A的BC8的30個(gè)套袋自交穗中,仍有 3個(gè)穗的自交結(jié)實(shí)率為 0,占觀察數(shù)據(jù)的10%。協(xié)青早A的BC8套袋自交結(jié)實(shí)率為0的有7個(gè),占23.3%(數(shù)據(jù)未列出)。由此可以認(rèn)為,群體的平均套袋自交結(jié)實(shí)率雖然一定程度上定性反映了微效恢復(fù)基因的表現(xiàn),但在需要考查單個(gè)植株的表現(xiàn)型(這在遺傳研究分離群體時(shí)是必需的),套袋自交結(jié)實(shí)率會(huì)出現(xiàn)根本性的偏差,因此不能作為微效恢復(fù)基因遺傳研究的可量化指標(biāo)。

隨機(jī)取樣的黑染花粉率,與套袋自交結(jié)實(shí)率的數(shù)據(jù)具有相似之處,即絕對(duì)數(shù)值較小,而標(biāo)準(zhǔn)差較大。同樣以協(xié)青早 A、黃玉 A、嘉浙 A的 BC8代主穗的隨機(jī)取樣黑染花粉率為例,3組觀察值分別為0.36±0.77%,0.33±0.60%,1.17±1.00%。其它各世代也有類似的趨勢,因此也不宜作為微效恢復(fù)基因遺傳研究的可量化指標(biāo)。

但是,分類取樣中專取飽滿黃花藥觀察的黑染花粉率表現(xiàn)不同,協(xié)青早 A,黃玉 A,嘉浙 A的BC8代主穗的分類取樣黑染花粉率分別為5.01±1.05%,10.56±1.46%,16.19±2.09%,數(shù)據(jù)的絕對(duì)值較隨機(jī)取樣的黑染花粉率有數(shù)量級(jí)的增加,標(biāo)準(zhǔn)差也相對(duì)減小,其遲分蘗穗的觀察數(shù)據(jù)也是相同的趨勢,分別為 6.13±1.29%,12.15± 1.42%,9.96± 2.28%(表 2)。可見 ,專取黃花藥觀察的黑染花粉率已初步具備作為可量化指標(biāo)的特點(diǎn)。其缺陷可能在于實(shí)際操作中如果大樣本觀察,以水稻的單穗為100粒計(jì),對(duì)一個(gè)穗所有穎花中的飽滿黃花藥進(jìn)行花粉鏡檢,工作量就比較大,更不用說一個(gè)群體中的所有穗的穎花鏡檢的工作量了。

嵌合穎花現(xiàn)象是可比較簡便地觀察的表現(xiàn)型。只需剝開穎殼,則不育系中黃花藥(通常較肥大)和水漬狀的乳白花藥是能直觀區(qū)分的。其次,在4個(gè)不同材料之間,嵌合穎花率有明顯層次差異。以BC8～BC103個(gè)世代的平均值為例,紫興05A主穗和遲分蘗穗均為0;協(xié)青早 A分別為 10.90%和 17.09%;黃玉 A分別為23.10%和30.23%;嘉浙 A分別為 39.88%和55.01%(表 2)。彼此之間差異均達(dá)顯著水平,說明嵌合穎花率能有效區(qū)分不同類型材料微效恢復(fù)基因的表現(xiàn)。再次,嵌合穎花率的數(shù)據(jù)絕對(duì)值也是 3個(gè)指標(biāo)中最大的,且標(biāo)準(zhǔn)差較小,具有穩(wěn)定性。更重要的是,由于一朵穎花有6個(gè)花藥,而嵌合穎花定義為只要有1個(gè)以上花藥為飽滿黃花藥即為嵌合穎花,實(shí)際操作中可以避免如花粉鏡檢時(shí)取樣的誤差,實(shí)現(xiàn)全樣本檢測,避免取樣誤差。還有一點(diǎn),從對(duì)嵌合穎花中飽滿黃花藥和瘦小乳白花藥的分類花粉育性觀察中發(fā)現(xiàn),瘦小乳白花藥中不含黑染花粉,黑染花粉完全來自飽滿黃花藥(表2)。這就進(jìn)一步說明嵌合穎花中的黃花藥確是微效恢復(fù)基因的表現(xiàn)型載體。

綜上所述,我們認(rèn)為嵌合穎花率具備了作為微效恢復(fù)基因研究中可量化指標(biāo)的條件,是最合適的可量化指標(biāo)。

3 討 論

從生物學(xué)角度看,套袋自交結(jié)實(shí)率的影響因素包含了花粉發(fā)育、開花、受精及其環(huán)境影響的生理、生態(tài)等諸多因素,并不是恢復(fù)性的真實(shí)反映。而花粉育性反映的是花粉不育性的遺傳特性,應(yīng)是研究恢復(fù)性的關(guān)鍵數(shù)據(jù)。本研究證實(shí)可作微效恢復(fù)基因表現(xiàn)型量化指標(biāo)的嵌合穎花,在某種程度是介于上述兩個(gè)指標(biāo)之間的一個(gè)指標(biāo)。它是黑染花粉的載體,是微效恢復(fù)基因花粉育性的體現(xiàn),但又可以穎花為單位進(jìn)行考查,具有操作上的簡便性。雖然嵌合穎花這種表現(xiàn)型并不是本研究首次提出,如游年順等提出的“嵌合花粉囊”[9],與“嵌合穎花”是同一個(gè)概念,但他們未曾就該指標(biāo)是否可用于量化進(jìn)行分析,更未曾應(yīng)用該指標(biāo)對(duì)微效恢復(fù)基因的遺傳規(guī)律進(jìn)行研究,因此該量化指標(biāo)的重新提出,對(duì)微效恢復(fù)基因的遺傳研究是一個(gè)有力的推進(jìn)。

本研究還發(fā)現(xiàn)嵌合穎花率在主穗和遲分蘗穗之間有一定差異,一般表現(xiàn)為遲分蘗穗的嵌合穎花率較主穗為高,這可能和主穗和遲分蘗穗花粉發(fā)育時(shí)期不同的環(huán)境有關(guān)。

此外,我們應(yīng)用嵌合穎花率這個(gè)指標(biāo)對(duì)嘉浙 B的微效恢復(fù)基因的遺傳進(jìn)行的研究已初步完成,結(jié)果將后續(xù)報(bào)道。

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