鄧西川 黃 偉 戴 維 胡曉莉 沈旭東 楊致邦*

（1 重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心病原生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016；2 西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 402460；3 重慶醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)五年制2007級(jí)4班，重慶 400016）

大量研究已經(jīng)表明，幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，HP）是人類常見(jiàn)的感染病原之一，是多種胃疾病的生物致病因素，也是發(fā)生胃癌的重要危險(xiǎn)因素，世界衛(wèi)生組織已將其列為第一類生物致癌因子[1]，防治HP感染具有重要的臨床意義。

近年來(lái)，許多研究已經(jīng)證實(shí)口服卵黃免疫球蛋白（immunoglobulin yolk，IgY）可通過(guò)被動(dòng)免疫有效防治胃腸道感染性疾病[2,3]，但在胃內(nèi)，由于受到高酸性和高胃蛋白酶的生態(tài)環(huán)境的影響，使其應(yīng)用受到限制。提高IgY對(duì)酸和蛋白酶的耐受性對(duì)口服IgY的開發(fā)具有重要意義。硫糖鋁（sucralfate）作為抗消化性潰瘍的制劑已在臨床廣泛應(yīng)用。該藥對(duì)胃黏膜具有黏附性，可與許多大分子物質(zhì)如黏液、糖脂蛋白等結(jié)合；并可與胃黏膜表面的黏液結(jié)合形成復(fù)合的膠狀物，起到黏膜保護(hù)作用[4]。

HP在胃內(nèi)定植的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是黏附，其黏附素（Helicobacter pylori adhesin A，HpaA）具有黏膜結(jié)合特性，由黏附素受體系統(tǒng)介導(dǎo)與宿主細(xì)胞發(fā)生特異性黏附，從而使HP定植于胃內(nèi)[5]。本文制備抗HP的重組HpaA特異性IgY，將適當(dāng)比例的硫糖鋁加入HpaA IgY中，以提高HpaAIgY對(duì)酸和蛋白酶的耐受性，通過(guò)體外試驗(yàn)評(píng)價(jià)硫糖鋁對(duì)HpaA IgY的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

H.pylori重組菌DH5α-hpaA-pQE30為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[6]并保存，Ni2+-NTA親合層析柱為Qiagen公司產(chǎn)品；30周齡立克體雞由西南農(nóng)業(yè)大學(xué)榮昌分校生物中心提供，常規(guī)飼養(yǎng)；HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG、羊抗人IgG購(gòu)自Southern Biotech公司；檢測(cè)血中抗HP特異性IgG的Western blot試劑盒購(gòu)自上海元谷科技發(fā)展公司；HP選擇培養(yǎng)基、LA培養(yǎng)基、ELISA試驗(yàn)中的抗原包被液、酶稀釋液、顯色劑等為本室配制；HpaA（+）血清為本實(shí)驗(yàn)室從HP陽(yáng)性的患者血清篩選；胃蛋白酶購(gòu)自Amresco公司產(chǎn)品；硫糖鋁混懸液購(gòu)自上海旭東海普制藥公司。

1.2 方法

1.2.1 制備重組HpaA抗原

將表達(dá)菌DH5α-hpaA-pQE30接種于LA培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)16h。再轉(zhuǎn)種于LA培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至細(xì)菌濃度達(dá)到A600＝0.6時(shí)，用1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h；再將菌液4℃、8500r/min離心10min；收集沉淀物超聲碎菌，4℃、8500r/min離心45min；加入包涵體裂解液裂解2h，4℃、8500r/min離心45min，取上清液，用Ni2+-NTA樹脂親和層析純化。純化物用12%SDS-PAGE分析，用Bradford法測(cè)定純化物的蛋白含量；用Western blot鑒定重組蛋白的抗原性；將重組蛋白免疫家兔，用間接ELISA法檢測(cè)其血清的抗hpaA效價(jià)以鑒定其免疫原性；-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 制備抗重組HpaA的IgY

以純化的重組hpaA為抗原，參照黃進(jìn)等[7]的方法，將重組hpaA與等量完全弗氏佐劑充分研磨乳化后接種洛曼母雞[6]。初次接種劑量為100μg/只；15d后進(jìn)行第2次接種，200μg/只；以后每隔1個(gè)月進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，計(jì)量為300μg/只，共接種2次。在末次接種后1周開始收集雞蛋，取出蛋黃液混合后，先用水稀釋，再用氯仿粗提hpaAIgY，飽和硫酸銨法純化，最后過(guò)濾除菌。純化蛋白用12%SDS-PAGE分析，Bradford法測(cè)定IgY蛋白含量，間接ELISA法測(cè)定hpaAIgY效價(jià)，-20℃保存。

1.2.3 強(qiáng)酸下硫糖鋁對(duì)HpaAIgY的保護(hù)作用觀察

參照Kyong AL[8]的方法，用pH值分別為1.5、2.0、3.0的磷酸二氫鈉緩沖液將hpaA IgY稀釋后，分別加入10%～60%的硫糖鋁（體積百分比），使IgY終濃度為1mg/mL；37℃維持2h后，立即加入適量的NaOH（2mol/L）中和，將pH值調(diào)至7.0，ELISA法測(cè)定IgY的A450值。將含1mg/mL pH7.0的IgY稀釋液37℃維持2h作為參照，以IgY試驗(yàn)液的A450值與參照IgY的A450值之比測(cè)算IgY的剩余抗體活性，用（AR/AC）%表示。與同樣條件處理但未加硫糖鋁的IgY液為對(duì)照，評(píng)價(jià)硫糖鋁對(duì)hpaA IgY的保護(hù)作用。

1.2.3.1 硫糖鋁對(duì)胃蛋白酶裂解HpaAIgY的保護(hù)作用觀察

參照Kyong AL[8]的方法，用pH 2.0、pH 3.0的磷酸二氫鈉緩沖液將hpaA IgY稀釋后，分別加入終濃度為0.02mg/mL的胃蛋白酶，再分別加入10%、30%、50%的硫糖鋁，使IgY終濃度為1mg/mL；37℃維持4h，立即加入適量的NaOH（2mol/L），將pH值調(diào)至7.0，ELISA法測(cè)定IgY的A450值。以同樣條件處理的未加胃蛋白酶和硫糖鋁，pH7.0含1mg/mL的hpaA IgY稀釋液作參照，并按前述方法計(jì)算其剩余抗體活性。以同樣條件處理加胃蛋白酶未加硫糖鋁的IgY液為對(duì)照，評(píng)價(jià)硫糖鋁對(duì)胃蛋白酶裂解hpaA IgY的保護(hù)作用。

1.2.3.2 反復(fù)凍融下硫糖鋁對(duì)特異性IgY的保護(hù)作用

用pH7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋hpaA IgY，再分別加入10%、30%、50%的硫糖鋁，使IgY的終濃度為1mg/mL，4℃反復(fù)凍融7次，每次間隔1h；以未凍融處理、未加硫糖鋁、在4℃存放的同樣稀釋度的IgY為參照，ELISA法檢測(cè)IgY的A450值，并按前述方法計(jì)算其剩余抗體活性。以同法處理的不加硫糖鋁的IgY液為對(duì)照，評(píng)價(jià)在反復(fù)凍融條件下硫糖鋁對(duì)hpaA IgY的保護(hù)作用。

2 結(jié) 果

2.1 重組hpaA抗原的制備

表達(dá)的重組hpaA蛋白經(jīng)SDS-PAGE后凝膠掃描圖象軟件分析，破碎菌的上清與沉淀在相對(duì)分子質(zhì)量30000處均可見(jiàn)明顯的外源蛋白的表達(dá)帶，約占全菌的70%。經(jīng)純化后可見(jiàn)單一條帶，純度達(dá)90%以上，見(jiàn)圖1。Bradford法測(cè)定重組蛋白含量為1.08mg/mL。Western blot鑒定在相對(duì)分子質(zhì)量30000處出現(xiàn)相應(yīng)的條帶，大小與預(yù)期的一致（圖2）。ELISA法測(cè)得免疫后兔抗血清與VacA抗原反應(yīng)的效價(jià)為1∶1280。

圖1 重組HpaA蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析

圖2 重組HpaA蛋白的Western blot分析

2.2 抗重組hpaA特異性IgY的制備

蛋黃液純化濃縮后，測(cè)得其hpaA IgY的蛋白含量為6.4mg/mL；經(jīng)SDS-PAGE分析，在相對(duì)分子質(zhì)量65000和25000處分別可見(jiàn)兩條條帶，與IgY重鏈和輕鏈的分子質(zhì)量相符（圖3），IgY的兩重鏈及兩輕鏈之和與總相對(duì)分子質(zhì)量180×103相符合。凝膠掃描圖象軟件分析其純度為72.0%。ELISA法測(cè)得I其效價(jià)為1∶12800。

2.3 各種保護(hù)作用的觀察

2.3.1 強(qiáng)酸下硫糖鋁對(duì)特異性IgY的保護(hù)作用

在強(qiáng)酸條件下，加入硫糖鋁后抗體活性明顯提高，并隨硫糖鋁濃度增高而提高。在pH 1.5條件下，未含硫糖鋁的hpaA IgY的抗體活性僅能維持30.5.%；含30%硫糖鋁的IgY的剩余抗體活性為35.4%，含50%硫糖鋁的IgY可使剩余抗體活性提高到48.2%，含60%硫糖鋁的IgY可使剩余抗體活性提高到65.8%。在pH 2.0條件下，未加硫糖鋁之IgY剩余抗體活性為35.6%，含30%硫糖鋁的IgY可使剩余抗體活性提高到85.4%，含50%的硫糖鋁的IgY幾乎可完全保持其抗體活性。在pH 3.0條件下，不加硫糖鋁的IgY抗體活性能保持64.8%，30%硫糖鋁即可使IgY抗體活性保持87.3%，而50%以上濃度的硫糖鋁幾乎可完全保持IgY的抗體活性（圖4）。

2.3.2 硫糖鋁對(duì)胃蛋白酶裂解特異性IgY的保護(hù)作用

在pH 2.0 、3.0和0.02mg/mL胃蛋白酶濃度條件下，加硫糖鋁的hpaA IgY抗體的剩余活性隨硫糖鋁的濃度增高而提高。在pH 2.0 時(shí)，不加硫糖鋁的IgY抗體的剩余活性為20.1%，含10%、30%、50%硫糖鋁IgY的剩余活性分別為62.8%、71.6%、82.5%。在pH 3.0 時(shí)，不加硫糖鋁的IgY抗體的剩余活性為42.4%，含10%、30%、50%硫糖鋁IgY的剩余活性分別為75.6、87.4%、94.5%（圖5）。與不加硫糖鋁比較，差異有顯著性（P＜0.01）。

圖3 純化后IgY的SDS-PAGE分析

圖4 在pH 1.5、2.0和3.0條件下加入0%～60%硫糖鋁hpaA IgY的剩余抗體活性

2.3.3 反復(fù)凍融下硫糖鋁對(duì)特異性IgY的保護(hù)作用

經(jīng)反復(fù)凍融后，未含硫糖鋁的IgY的剩余抗體活性下降至62.4%，加入硫糖鋁后，隨所含硫糖鋁濃度的增高，其剩余抗體活性也提高。含10%硫糖鋁的IgY可使其剩余抗體活性提高到70.6%，含30%硫糖鋁的IgY可使其剩余抗體活性提高到82.7%，50%硫糖鋁可提高到89.3%（圖6）。

圖5 在pH 2.0、3.0和0.02mg/mL的胃蛋白酶條件下加入10%、30%和50%硫糖鋁的hpaA IgY的剩余抗體活性

圖6 反復(fù)凍融下硫糖鋁對(duì)HpaA IgY的保護(hù)作用

3 討 論

高酸性和含高濃度的胃蛋白酶是胃內(nèi)生態(tài)環(huán)境最主要的特點(diǎn)。陳劍秋等[9]對(duì)健康成人胃內(nèi)24h pH值的動(dòng)態(tài)檢測(cè)表明，胃內(nèi)pH值的基線為（1.63±0.34），當(dāng)進(jìn)食時(shí)pH值升高，胃內(nèi)食物排空后降至基線水平。正常成人胃內(nèi)的胃蛋白酶濃度為0.02 mg/mL，胃蛋白酶作用的最適pH為1.5～2.2，最適溫度為37 ℃左右。因此，防治HP感染的制劑在胃內(nèi)必須耐受高酸性和高蛋白酶的作用才能奏效。

Kyong等[10]的報(bào)道表明，當(dāng)pH＜3時(shí)，IgY的抗體活性可降低50%，在pH 2.0條件下4h，IgY幾乎完全失活。在pH3.0條件下，加入30%山梨醇可顯著提高IgY的穩(wěn)定性，加入50%山梨醇可完全維持IgY的抗體活性。Xiao等[11]用殼聚糖-藻酸鹽微膠囊包裹IgY，將膠囊置于pH3.0～6.0的模擬胃液中試驗(yàn)，其結(jié)果可使IgY活性維持到61.36%～74.61%。本文的結(jié)果表明，在IgY液中加入硫糖鋁，可顯著提高IgY在酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性，其保護(hù)作用明顯優(yōu)于糖類，也優(yōu)于用殼聚糖-藻酸鹽微膠囊包裹IgY。30%～50%硫糖鋁可在胃內(nèi)pH 2.0和含0.02mg/mL胃蛋白酶的模擬胃液環(huán)境中有效保護(hù)IgY的活性，提高IgY抗凍融力。

硫糖鋁是一種含8個(gè)硫酸根的蔗糖硫酸酯鋁鹽（C12H30Al8O5lS8xAl（OH）3yH20），其硫酸蔗糖部分在堿性的氫氧化鋁分子之間交聯(lián)，為立體結(jié)構(gòu)的橋形復(fù)合物，黏附性強(qiáng)，帶負(fù)電荷，能與多種帶正電荷的化學(xué)基團(tuán)或大分子物質(zhì)結(jié)合，如黏液、糖脂蛋白以及藥物、金屬等；也可與胃十二指腸黏膜表面的黏液結(jié)合，形成復(fù)合的膠狀物，對(duì)黏膜起到保護(hù)作用[4,12]。硫糖鋁遇酸解離之后，其氫氧化鋁凝膠可發(fā)揮抗酸作用，不僅可緩解強(qiáng)酸環(huán)境，也可破壞胃蛋白酶作用的最適酸性環(huán)境。而且，硫糖鋁本身可與胃蛋白酶絡(luò)合，直接、持續(xù)地抑制胃蛋白酶的活性。用硫糖鋁作為IgY的保護(hù)劑，不僅可降低胃酸和胃蛋白酶對(duì)IgY的破壞作用，還可發(fā)揮硫糖鋁本身對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用，是比較理想的IgY保護(hù)劑。因此，制備含硫糖鋁的hpaA特異性IgY有望使IgY在胃內(nèi)發(fā)揮更加有效的預(yù)防HP感染的作用。

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