王冬梅，李萬波，袁樹民，全雄志，張海濤，馬春梅，曹興水，張連峰

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，在人體多種組織中均有表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)生理狀態(tài)下的APP參與神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)損傷后修復(fù)與再生、突觸發(fā)生和學(xué)習(xí)記憶能力等，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要的生理作用［1］。而發(fā)生突變的APP與家族性阿爾茨海默癥（Alzheimer＇s disease，AD）關(guān)系密切，突變的APP通過淀粉樣加工途徑產(chǎn)生過多的Aβ，而Aβ也是AD中老年斑的主要成份。本文通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將人的APP695K595N/M596L轉(zhuǎn)入C57BL/6J小鼠體內(nèi)，構(gòu)建了神經(jīng)特異性表達(dá)人APP695K595N/M596L轉(zhuǎn)基因小鼠，并通過行為學(xué)及神經(jīng)病理學(xué)方法對該動物模型進(jìn)行評價。

1 材料和方法

1.1 APP表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因

本文所研究的PrP-hAPP695K595N/M596L突變轉(zhuǎn)基因動物模型由本所遺傳中心構(gòu)建，利用點突變方法使人APP695cDNA在596堿基和597堿基兩個位點產(chǎn)生G-C和A-C的突變，編碼氨基酸由賴氨酸突變?yōu)樘扉T冬酰胺，蛋氨酸突變?yōu)榱涟彼?，稱為瑞士突變。把APP基因克隆到小鼠阮蛋白啟動子（PrP）的下游構(gòu)建APP695K595N/M596L轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體。轉(zhuǎn)基因載體用Xba I線性化（寶生物工程有限公司），調(diào)整濃度至5 ng/μL，用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中（小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司，SCXK京2009-0007），用ICR小鼠作假孕體，制備轉(zhuǎn)基因小鼠。實驗中涉及動物的操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準(zhǔn)（GC-07-2055）。

1.2 PCR鑒定APP轉(zhuǎn)基因動物的基因表型

轉(zhuǎn)基因小鼠在出生9～14 d用剪趾法標(biāo)記，收集剪下的組織，用堿裂解法提取基因組DNA，用PCR檢測APP轉(zhuǎn)基因小鼠。PCR上游引物為5’-GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG-3’，下游引物為5’-CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCCG-3’（上海生物工程技術(shù)有限公司），PCR試劑購自寶生物工程有限公司。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 m in，94℃變性30 s，54℃退火30s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)。hAPP片段為344 bp。

1.3 Westernblotting鑒定APP基因在蛋白水平的表達(dá)

選用1月齡的轉(zhuǎn)基因陽性和同窩陰性小鼠，頸椎脫臼法犧牲小鼠，迅速取出腦組織置勻漿器中，加入1 m L的RIPA蛋白裂解液（碧云天公司），蛋白濃度通過BCA法測定（Pierce公司Pierce BCA Kit試劑盒），取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，隨后將蛋白電轉(zhuǎn)至醋酸纖維素NC膜上。膜先用5％脫脂牛奶中室溫封閉1 h，加入羊抗hAPP蛋白抗體（1：500稀釋，Santa Crutz），4℃雜交過夜。將膜轉(zhuǎn)移到HRP標(biāo)記的兔抗山羊抗體（1∶15 000，Pierce Biotechnology）中，室溫雜交1 h。將膜置于化學(xué)發(fā)光液中，曝光、顯影及定影。

1.4 APP695K595N/M596L轉(zhuǎn)基因小鼠模型的病理學(xué)動態(tài)觀察

選用5、7、9、11、12月齡APP695K595N/M596L小鼠及同月齡野生小鼠，頸椎脫臼法處死小鼠，取腦后用中性甲醛溶液固定24 h，取材、脫水、包埋、切片、thioflavin-S（購自美國Sigma公司）熒光檢測老年斑情況，光學(xué)顯微鏡（Nikon，日本）及熒光顯微鏡觀察（Olympus，日本）。

1.5 Morris水迷宮檢測APP695K595N/M596L轉(zhuǎn)基因小鼠的行為學(xué)變化

選用5、7、9、11月齡APP695K595N/M596L轉(zhuǎn)基因陽性小鼠每組10只及同月齡的野生型C57/6J小鼠每組10只，利用Morris水迷宮進(jìn)行小鼠行為學(xué)分析（Ethovision XT監(jiān)測分析軟件，Morris水迷宮系統(tǒng)，Noldus公司，荷蘭）。水迷宮實驗過程分為連續(xù)5天的隱藏平臺獲得實驗和第6天的空間探索實驗兩部分。每天訓(xùn)練4次，每次使小鼠在不同區(qū)域下水，水迷宮按東南西北分為1、2、3、4區(qū)域，平臺即第五區(qū)域，位于第4區(qū)域內(nèi)。每次游泳時間為60 s，每次訓(xùn)練間隔1 h左右。小鼠沒有找到平臺的按60 s計算潛伏期。平臺隱藏獲得實驗檢測小鼠學(xué)習(xí)獲得能力，空間探索實驗檢測小鼠空間記憶能力。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

利用SPSS16.0軟件統(tǒng)計分析，平臺隱藏獲得實驗中的逃避潛伏期采用多重測量的方差分析學(xué)習(xí)試驗；空間探索實驗中的各象限的游泳時間和穿越目標(biāo)次數(shù)采用單因素方差分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，差異顯著水平設(shè)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 APP表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因小鼠基因表型的鑒定

將人APP695K595N/M596L突變基因插入小鼠阮蛋白啟動子（mouse prion protein）的下游，構(gòu)建APP轉(zhuǎn)基因載體（圖1A）。顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，轉(zhuǎn)入到假孕受體ICR小鼠中，小鼠出生后9～14 d提取基因組DNA，用PCR檢測APP轉(zhuǎn)基因小鼠（圖1B）。

2.2 Westernblotting檢測APP基因在蛋白水平的表達(dá)

A： APP695K595N/M 596L轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體；B：轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR鑒定。注：1：空白對照；2：陰性對照；3：陽性對照； 4：DNA分子標(biāo)記DL2000；5-17：轉(zhuǎn)基因小鼠的DNA樣品。圖1 APP695K595N/M 596L基因表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR鑒定圖A：APP695K595N/M596L transgenic expression construct； B：PCR genotyping of APP695K595N/M 596L transgenic mice Note：1：Blank control；2：Negative control； 3：Positive control；4：DL2000 DNA marker； 5-17：Genomic DNA samples from transgenic mice.Fig.1 APP695K595N/M596L transgenic expressionconstruct and PCR genotyping of APP695K595N/M596L transgenic mice

分別提取首建鼠F1代陽性轉(zhuǎn)基因小鼠和同齡陰性對照小鼠的腦組織總蛋白，進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果顯示7號轉(zhuǎn)基因陽性小鼠腦腦組織中人APP蛋白表達(dá)量明顯高于同齡陰性對照小鼠（圖2），選取該品系的小鼠用于繁殖并進(jìn)行病理學(xué)和行為學(xué)分析。

注：WT：同窩陰性對照小鼠； F07：轉(zhuǎn)基因陽性品系；GAPDH：內(nèi)參圖2 人APP蛋白在APP695K595N/M596L轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中的表達(dá)Note：WT：The wild type mouse；F07：The transgenic line； GAPDH：Loading normalization.Fig.2 Expression of human APP695K595N/M596L in the brain tissues of trangenic mice

2.3 病理學(xué)檢驗

Thioflavin-S熒光結(jié)果均顯示5月、7月齡動物海馬區(qū)均未檢測到明顯老年斑出現(xiàn)，9月齡時轉(zhuǎn)基因陽性小鼠在海馬區(qū)出現(xiàn)老年斑，11月，12月呈年齡依賴性增多（圖3見彩插2）。

2.4 行為學(xué)結(jié)果

經(jīng)過檢驗前5 d學(xué)習(xí)有效，所有小鼠都能較快的找到平臺。隨后第6天撤出平臺，進(jìn)行空間探索實驗。Ethovision XT監(jiān)監(jiān)測分析軟件記錄小鼠在目標(biāo)區(qū)域（即第4從5區(qū)）的穿梭次數(shù)和停留時間。Morris水迷宮試驗發(fā)現(xiàn)5月、7月、9月、11月齡轉(zhuǎn)基因小鼠空間探索實驗結(jié)果與同月齡野生型小鼠相比有顯著差異，較同月齡野生型C57BL/6J小鼠學(xué)習(xí)及記憶能力降低（P＜0.05）（圖4～5）。

3 討論

全球預(yù)計有3 700萬癡呆癥患者，阿爾茨海默病是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性疾病，疾病早期出現(xiàn)軸突病變（軸突腫脹，軸突運輸障礙）以及突觸功能缺陷，晚期臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶減退和認(rèn)知障礙，主要神經(jīng)病理特征是大腦皮質(zhì)萎縮、神經(jīng)細(xì)胞喪失，細(xì)胞外存在大量由淀粉樣蛋白組成的老年斑（senile plaques，sp）、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維絲纏結(jié)（neurofibrillary tangles，nfts）以及皮質(zhì)動脈和小動脈的血管淀粉樣變性［2］。在家族性A D家系中最早發(fā)現(xiàn)的突變基因是淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein），其后發(fā)現(xiàn)的突變基因還包括早老素（presenilin），轉(zhuǎn)脂蛋白（apoe），tau蛋白等。

A：5月齡野生小鼠與轉(zhuǎn)基因模型小鼠尋找隱藏平臺的潛伏期比較；B：7月齡野生小鼠與轉(zhuǎn)基因模型小鼠尋找隱藏平臺的潛伏期比較；C：9月齡野生小鼠與轉(zhuǎn)基因模型小鼠尋找隱藏平臺的潛伏期比較；D：11月齡野生小鼠與轉(zhuǎn)基因模型小鼠尋找隱藏平臺的潛伏期比較；E：5-11月齡野生小鼠與轉(zhuǎn)基因模型小鼠第4天尋找隱藏平臺的潛伏期差值比較。* P＜0.05圖4 不同年齡小鼠水迷宮實驗分析A：Comparison of escape latency between transgenic and controlmice at 5-month old age；B：Comparison of escape latency between transgenic and controlmice at 7-month old age；C：Comparison of escape latency between transgenic and controlmice at 9-month old age；D：Comparison of escape latency between transgenic and controlmice at11-month old age；E：Comparison of average value of the 4th day escape latency between transgenic and controlmice at 5-11-month old ages.* P＜0.05Fig.4 Determination of escape latency in hidden platform acquisition training of the mice at different ages

目前在家族性A D病人中已鑒別出多個A P P基因的突變位點，這些突變使得APP代謝途徑發(fā)生異常改變，是家族性A D的主要病因。本文所研究的瑞士突變帶來的蛋白構(gòu)象變化使A P P蛋白更容易被β-分泌酶切割，導(dǎo)致其通過淀粉樣代謝途徑生成的Aβ增多，增多的Aβ異常聚集，形成老年斑，進(jìn)而影響認(rèn)知行為。

神經(jīng)特異性啟動子通常在進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療和神經(jīng)生物學(xué)研究方面具有非常重要的意義［3］。其中，小鼠朊蛋白（mouse prion protein，PrP），人血小板源性生長因子（p latelet-derived grow th factor，PDGF），鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶IIα（calcium/calmodulin-dependent protein kinase IIα，CaMKIIα），小鼠甲狀腺素-1（thyroxine-1，Thy-1）是研究者經(jīng)常使用的神經(jīng)組織特異啟動子。Thy-1和CaMKIIα啟動子能夠使下游目的基因在海馬、胼胝體、前皮層神經(jīng)元內(nèi)特異性高表達(dá)［4，5］，而PDGF和PrP啟動子可以使目的基因在小腦、大腦、脊索的神經(jīng)元廣泛高表達(dá)［6，7］。PrP啟動子更為突出的優(yōu)點是在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中也具有活性，而其余3個啟動子不具有這樣的功能［6-7］。所以我們選擇PrP啟動子，在其下游插入突變的APP基因建立阿爾茨海默?。ˋlzheimer＇s disease，AD）動物模型。

圖5 Morris水迷宮空間探索實驗結(jié)果比較A：Comparison of target zone duration between 5-11-month old transgenic and controlmice；B：Comparison of target zonefrequency between 5-11-month old transgenicand controlmice.*P＜0.05Fig.5 Results of 6th day probe trial testing by Morris watermaze

在9月齡時，該轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬區(qū)出現(xiàn)老年斑，11月，12月呈年齡依賴性增多，這和hsiao等［7］報道的結(jié)果相一致。Morris水迷宮結(jié)果顯示5月齡轉(zhuǎn)基因小鼠與同月齡野生小鼠有差異，說明5月齡轉(zhuǎn)基因小鼠在出現(xiàn)明顯老年斑之前就出現(xiàn)了學(xué)習(xí)記憶能力障礙。與此相一致，臨床上AD患者神經(jīng)病理學(xué)改變之前，就會出現(xiàn)輕度的認(rèn)知障礙［8］。研究發(fā)現(xiàn)：神經(jīng)元功能活動調(diào)控產(chǎn)生的內(nèi)源性Aβ可能是正常機(jī)體對神經(jīng)元持續(xù)興奮的反應(yīng)，通過從對神經(jīng)元興奮性的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，控制神經(jīng)元興奮毒性的發(fā)生［9，10］。而當(dāng)可溶性的Aβ過多，聚集成的Aβ寡聚體，能夠破壞海馬腦片及動物的長時程增強(qiáng)效應(yīng)（long-term potentiation，LTP），降低海馬的樹突棘密度；干擾與記憶相關(guān)的即刻早期基因的表達(dá)；通過破壞神經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起神經(jīng)元功能障礙、變性、死亡，直接影響大腦學(xué)習(xí)記憶［11-13］。Morris水迷宮尋找平臺隱藏實驗中第3天是檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力是否存在差異的關(guān)鍵時間點，本實驗中發(fā)現(xiàn)11月齡轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠相比，在第4天仍然存在差異，說明轉(zhuǎn)基因體小鼠學(xué)習(xí)記憶能力呈現(xiàn)漸進(jìn)性加重。

綜上，本文報道的PrP-APP695K595N/M596L轉(zhuǎn)基因小鼠在5月齡開始出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力缺陷和漸進(jìn)性加重。在9月齡出現(xiàn)老年斑并呈年齡依賴性增多。該轉(zhuǎn)基因小鼠的病理表型可以再現(xiàn)人類AD患者的漸進(jìn)性病理表型，是具有應(yīng)用價值的阿爾茨海默病小鼠轉(zhuǎn)基因動物模型。PrP-hAPP695K595N/M596L轉(zhuǎn)基因小鼠與PDGF-hAPP770V717I、PDGF-hAPP695V642I/K595N/M596L［14］、PDGF-hAPP695K595N/M596L轉(zhuǎn)基因小鼠相比，由于PrP啟動子在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中也具有活性，使得該轉(zhuǎn)基因小鼠可用于阿爾茨海默病神經(jīng)炎癥機(jī)制方面的研究，具有更廣泛的用途。

［1］Kim D，Tsai LH.Bridging physiology and pathology in AD［J］.Cell，2009，137（6）：997-1000.

［2］Stokin GB，Lillo C，F(xiàn)alzone TL，et al.Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer＇s disease［J］.Science，2005，307（5713）：1282-8.

［3］Ulrich VM.Gene therapy methods in bone and joint disorders.Evaluation of the adeno-associated virus vector in experimental models of articular cartilage disorders，periprosthetic osteolysis and bone healing［J］.Acta Orthop（Suppl），2007，78（325）：1-64.

［4］Moechars D，Dewachter I，Lorent K，et al.Early phenotypic changes in transgenic mice that overexpress different mutants of amyloid precursor protein in brain［J］.JBiol Chem，1999，274 （10）：6483-92.

［5］Ryan KA，Pimplikar SW.Activation of GSK-3and phosphorylation of CRMP2 in transgenic mice expressing APP intracellular domain［J］.JCell Biol，2005，171（2）：327-35.

［6］Sasahara M，F(xiàn)ries JW，Raines EW，et al.PDGF B-chain in neurons of the central nervous system，posterior pituitary，and in a transgenic model［J］.Cell，1991，64（1）：217-27.

［7］Hsiao K，Chapman P，Nilsen S，et al.Correlative memory deficits，Abeta elevation，and amyloid plaques in transgenic mice［J］.Science，1996，274（5284）：99-102.

［8］Mesulam M，Shaw P，Mash D，et al.Cholinergic nucleus basalis tauopathy emerges early in the aging-MCI-AD continuum［J］.Ann Neurol，2004，55（6）：815-828.

［9］Priller C，Bauer T，Mitteregger G，et al.Synapse formation and function is modulated by the amyloid precursor protein［J］.J Neurosci，2006，26（27）：7212-7221.

［10］Abramov E，Dolev I，F(xiàn)ogel H，et al.Amyloid-beta as a positive endogenous regulator of release probability at hippocampal synapses［J］.Nat Neurosci，2009，12（12）：1567-76.

［11］LesnéS，Koh MT，Kotilinek L，et al.A specific amyloid-beta protein assembly in the brain impairs memory［J］.Nature，2006，440（7082）：352-357.

［12］Selkoe DJ.Soluble oligomers of the amyloid beta-protein impair synaptic plasticity and behaviour［J］.Behav Brain Res，2008，192（1）：106-113.

［13］Townsend M，Mehta T，Selkoe DJ.Soluble Abeta inhibits specific signal transduction cascades common to the insulin receptor pathway［J］.J Biol Chem，2007，282（46）：33305 -312.

［14］方瑾，馬春梅，黃瀾，等.London/Swedish雙突變APP轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18（5）：24 -27.