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脂肪干細胞的共培養(yǎng)及其分化應(yīng)用概述

2011-02-09 09:36聶緒強陳懷紅唐寧卞卡
生物工程學(xué)報 2011年8期
關(guān)鍵詞:共培養(yǎng)干細胞分化

聶緒強,陳懷紅,唐寧,卞卡,3,4

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)穆拉德中藥現(xiàn)代化研究中心,上海 201203

2 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬二院,杭州 310009

3 上海市教委一氧化氮和炎癥醫(yī)學(xué)E-研究院,上海 201203

4 美國德克薩斯大學(xué)休斯敦醫(yī)學(xué)院綜合生物及藥理學(xué)系 德克薩斯大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所,休斯敦 TX77030

目前,組織工程與基因治療研究較多的靶細胞是造血干細胞 (Hematopoietic stem cells,HSCs) 和骨髓間充質(zhì)干細胞 (Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)。這兩種細胞都具備較強的體外增殖能力和分化能力。但它們主要分布在骨髓,由于成人骨髓量有限,而且抽取具有創(chuàng)傷及嚴重的并發(fā)癥等,故其應(yīng)用受到限制。自 Zuk等[1]首先報道成功分離培養(yǎng)人的脂肪干細胞以來,ADSCs逐漸成為各國科學(xué)家研究的熱點。來源于人及各種動物的ADSCs的培養(yǎng)也各異。本文就ADSCs的藥物化學(xué)誘導(dǎo)培養(yǎng)、共培養(yǎng)及其最新應(yīng)用等方面作一綜述。

1 ADSCs的來源及其標志

Zuk等[1]從人體脂肪組織中分離培養(yǎng)出成纖維樣細胞群,能在體外穩(wěn)定擴增,免疫熒光和流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn),這些細胞中大部分是中胚層,在一定條件下,可以向脂肪、軟骨、肌肉和成骨細胞分化,稱這些細胞為脂肪干細胞。細胞周期分析表明ADSCs G0/G1期79.1%,S期19.7%,G2/M期 1.3%,大部分細胞處于 G0/G1期,僅有少數(shù)細胞處于活躍的增殖期,說明只有機體受到損傷等應(yīng)激情況時,ADSCs的自我更新方式才會發(fā)生變化。

有關(guān) ADSCs特異性表面標志至今仍無統(tǒng)一認識,不同實驗室研究結(jié)果不盡相同,這種差異可能與細胞分離、培養(yǎng)和純化方法存在差異有關(guān)。流式細胞技術(shù)和免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)其中活化淋巴細胞粘附分子 (CD166)、血管細胞粘附分子 (CD106)、Thy21 (CD90)、5′-外切核酸酶 (CD73)、CD63、透明質(zhì)酸鹽 (CD44)、整合素 β1(C29) 等起初表達較低,隨著傳代其表達顯著增加;而干細胞相關(guān)表面標志CD34的表達一直很高。ADSCs一般不表達E2選擇素 (CD62)、神經(jīng)細胞粘附分子 (CD56) 等[2-7]。如用這些標志對ADSCs進行有效分選,可以得到較純的 ADSCs,將有助于對 ADSCs的進一步研究[8](表1)。

表1 ADSCs與BMSCs的表面標志比較[8-13]Table 1 Surface markers of ADSCs and BMSCs[8-13]

2 ADSCs的培養(yǎng)與分化

2.1 ADSCs的培養(yǎng)

ADSCs 可來源于人類、猴、犬、牛、豬、兔、豚鼠、大鼠、小鼠等,其培養(yǎng)方法大同小異。取腹股溝平行切下脂肪組織或吸脂手術(shù)的脂肪抽吸物,用PBS或者D-Hanks液沖洗,將脂肪組織剪成1 mm×1 mm×1 mm大小,加入0.1%的Ⅰ型膠原酶,37 ℃攪拌 40~60 min,1 000× g離心10 min,去上清,沉淀用PBS或者D-Hanks液洗,10%胎牛血清的DMEM (低糖,2 mmol/L谷氨酰胺,雙抗)稀釋,將細胞收集培養(yǎng)。24 h后換液,3 d換液1次,待細胞長滿 80%用 0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)

(圖 1)[13,18-21]。

2.2 ADSCs的分化潛能

ADSCs具有多項分化潛能,在不同的藥物及化學(xué)誘導(dǎo)劑條件下可以分化成成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞等不同的細胞。如圖 2、表 2所示。

圖1 ADSCs的取材及培養(yǎng)步驟Fig. 1 Processing of lipoaspirate and isolation of adiposederived stem cells.

表2 ADSCs的分化誘導(dǎo)條件[13,20-25]Table 2 Conditions of ADSCs differentiated to special cell lineages[13,20-25]

圖2 ADSCs多向分化潛能[14-17]Fig. 2 Multiple lineage differentiation potential of ADSCs. Under specific and controlled culture conditions, ADSCs can be induced to express the phenotypic characteristics of chondrocytes, osteoblast, adipocytes, or neurons, and so on[14-17].

3 ADSCs的共培養(yǎng)

3.1 ADSCs共培養(yǎng)介紹

ADSCs除了通過不同的藥物化學(xué)物質(zhì)進行體外誘導(dǎo)分化的方法外,也可以采用成熟體細胞或細胞支架與其共培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)其定向分化。與試劑誘導(dǎo)相對,共培養(yǎng)方法亦稱為生物誘導(dǎo)。通常采用的共培養(yǎng)方式有單層共培養(yǎng) (Monolayer co-culture)、懸浮培養(yǎng) (Suspension culture)、間接共培養(yǎng) (亦稱分層滲透培養(yǎng)) (Transwell) 細胞團塊培養(yǎng) (Cell pellet)、細胞層培養(yǎng) (Cell sheet)、三維支架培養(yǎng)(Three-dimensional cell culture,TDCC)。其中單層培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、間接共培養(yǎng)為二維培養(yǎng),細胞團塊培養(yǎng)、細胞層培養(yǎng)、三維細胞支架培養(yǎng)為三維培養(yǎng)(圖3)。

3.2 ADSCs的二維培養(yǎng)

圖3 細胞共培養(yǎng)模型示意圖Fig. 3 Schematic diagram of cell co-culture model. (Ⅰ) A cell and B cell were co-cultured directly. (Ⅱ) A cell and B cell were co-cultured indirectly. (Ⅲ) Transwell chamber.

Zhang等[26]用新西蘭大白兔的ADSCs與軟骨細胞共培養(yǎng),2周后成功地將ADSCs誘導(dǎo)成軟骨樣細胞。Cousin等[27]通過將 ADSCs與胰腺腫瘤細胞體外共培養(yǎng),成功地利用 ADSCs介導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡,并且在體內(nèi)實驗和體外實驗都得到了證實,預(yù)測ADSCs可以作為治療胰腺瘤的細胞替代療法。張勇等[28]將ADSCs與病理狀態(tài)下軟骨細胞共培養(yǎng)后,ADSC可以被誘導(dǎo)成軟骨樣細胞,且發(fā)現(xiàn)高濃度血清三維培養(yǎng)可以增強這種誘導(dǎo)作用。Lei等[29]通過Transwell共培養(yǎng)的方法檢測了 ADSCs對鼓膜成纖維細胞增殖的影響,通過Transwell細胞遷移實驗檢測ADSCs對鼓膜成纖維細胞遷移速度的影響,激光共聚焦顯微鏡下評估各項檢測指標。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADSCs可能通過旁分泌作用促進鼓膜成纖維細胞增殖和遷移,將有利于鼓膜纖維層的修復(fù),為ADSCs最終應(yīng)用于臨床治療鼓膜穿孔提供了有意義的實驗依據(jù)。Zhang等[30]將ADSCs與pcDNA3.0-FGF10 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚來源的 MSC (pcDNA3.0-FGF10-MSC) 共培養(yǎng),將其分別種植在半透膜細胞培養(yǎng)池(Cell culture inserts) 多孔膜的外側(cè)和內(nèi)側(cè),通過監(jiān)測轉(zhuǎn)錄因子C/EBP-α、C/EBP-β和PPAR-γ的表達情況以及裸鼠背部皮下混合注射ADSCs與pcDNA3.0-FGF10-MSC的體內(nèi)實驗來研究 FGF10的促成脂作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著共培養(yǎng)時間的延長,半透膜細胞培養(yǎng)池內(nèi)的ADSCs形態(tài)逐漸發(fā)生變化,胞內(nèi)脂滴隨著時間的延長而增大、增多,對照組的ADSCs沒有明顯改變,油紅O染色也得到進一步證實,通過共培養(yǎng)的方法第一次從功能獲得的角度證明了 FGF10對ADSCs的促成熟作用。Li等[31]將ADSCs與血旺細胞 (Schwann cells,SCs) 通過Transwell共培養(yǎng),用免疫分析、Western blotting、RT-PCR等分別檢測ADSCs的形態(tài)、蛋白表達、基因等,發(fā)現(xiàn) ADSCs與SCs共培養(yǎng),SCs可以將其誘導(dǎo)向神經(jīng)細胞分化,共培養(yǎng)7 d后開始顯現(xiàn),可以穩(wěn)定保持 14 d。

3.3 ADSCs的三維培養(yǎng)

Tang等[32]用成年兔皮下脂肪分離培養(yǎng)脂肪干細胞,與自體脫鈣骨基質(zhì)復(fù)合后三維培養(yǎng),細胞在脫鈣骨基質(zhì)表面和孔隙內(nèi)黏附生長良好,并能繼續(xù)增殖和分泌胞外基質(zhì)。結(jié)果提示 ADSCs與脫鈣骨基質(zhì)復(fù)合后三維培養(yǎng)增殖良好。Hao等[33]利用Ⅰ型膠原凝膠均勻包埋 ADSCs后將其與聚乳酸聚乙醇酸-β-磷酸三鈣支架 (PLGA-β-TCP) 材料復(fù)合,以增加細胞在材料表面的附著,有效改善 ADSCs與支架材料的復(fù)合方式,并觀察其異位成骨情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過應(yīng)用Ⅰ型膠原凝膠來實現(xiàn)脂肪干細胞與PLGA-β-TCP多孔支架材料的均勻復(fù)合,能夠有效促進 ADSCs在材料孔隙中的成骨分化及均質(zhì)骨組織形成。Tian等[34]用 3月齡的日本大耳兔的ADSCs在體外殼聚糖-藻酸鹽凝膠三維支架誘導(dǎo)培養(yǎng)下,成功分化成髓核樣細胞,產(chǎn)生與髓核樣細胞相同的胞外基質(zhì),且發(fā)現(xiàn)低氧狀態(tài)下誘導(dǎo)效果較好。Nieto-Aguilar等[35]將人的ADSCs在三維新型纖維蛋白瓊脂糖腳手架上進行誘導(dǎo)分化,用組織化學(xué)、免疫熒光分析等技術(shù)證明三維纖維蛋白瓊脂糖生物材料與 ADSCs有高度的生物相容性,完全能夠支持ADSCs向軟骨、成骨、成脂、神經(jīng)系分化。

4 ADSCs的應(yīng)用

4.1 ADSCs在動物模型上的應(yīng)用

ADSCs在各疾病動物模型上用來干預(yù)治療糖尿病、肝臟損傷修復(fù)、膀胱重建、2型糖尿病陽痿、心肌梗死、腦梗、認知功能障礙、中風(fēng)、椎間盤修復(fù)、膠質(zhì)母細胞瘤治療、骨缺損、創(chuàng)傷后血管新生、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肌腱修復(fù)、唇腭裂、心力衰竭、結(jié)腸炎、尿失禁等[36-48]。

4.1.1 ADSCs在心血管疾病動物模型中的應(yīng)用

西班牙學(xué)者Perán等[38]首次將ADSCs轉(zhuǎn)變?yōu)樾募〖毎?,既重新編程了成熟的干細胞,又能改善心臟病的治療。Zhang等[39]將ADSCs與纖維蛋白膠復(fù)合后注射到心肌梗塞大鼠的左心室壁上,術(shù)后4周就發(fā)現(xiàn)大鼠的心臟功能相較于單獨使用 ADSCs組的大鼠有明顯提高 (P<0.01),提示聯(lián)合ADSCs與纖維蛋白膠復(fù)合在臨床組織工程治療心肌梗塞上會有很大的前景。

4.1.2 ADSCs在組織工程動物疾病模型中的應(yīng)用

McIntosh等[40]利用ADSCs促進大鼠脊柱融合,Zhu等[41]用 ADSCs接種到兔膀胱無細胞基質(zhì)(Bladder acellular matrix grafts,BAMGs) 中,24周后各種指標數(shù)據(jù)表明成功地實現(xiàn)了兔膀胱的重建。Cui等[42]將ADSCs作為種子細胞放于網(wǎng)狀支架中,成功地修復(fù)了狗的顱骨損傷,為臨床治療顱骨損傷提供了新的途徑,Jing等[43]提出可以利用 ADSCs的骨分化特性來完整地修復(fù)牙齒,免除老年人牙齒缺失之苦。

4.1.3 ADSCs在代謝性疾病動物模型中的應(yīng)用

Ohmura等[44]將ADSCs和胰島細胞一起移植到1型糖尿病C57BL/6J小鼠中,結(jié)果顯示胰島細胞的存活率及其分泌胰島素的功能都大大提高。Lin等[45]將人或大鼠的ADSCs移植到1型糖尿病大鼠模型的腎小囊內(nèi)后,實驗動物出現(xiàn)血糖降低、葡萄糖耐量提高、皮膚光滑、白內(nèi)障減少等表現(xiàn),故表達胰十二指腸同源盒基因-1 (Pancreatic duodenal homeobox 1 gene,Pdx1) 的ADSCs可用于治療糖尿病。

4.1.4 ADSCs在勃起功能障礙疾病動物模型中的應(yīng)用

美國加州大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Garcia等[46]向肥胖的2型糖尿病 ZDF陽痿大鼠陰莖中注射大鼠自體的ADSCs,注射3周后就發(fā)現(xiàn)ADSCs能夠很好地存活,陰莖背根內(nèi)神經(jīng)源型一氧化氮合酶 (Neuronal nitric oxide synthase,nNOS) 也明顯增加,并且明顯改善了糖尿病陽痿大鼠的勃起功能障礙,預(yù)測ADSCs用來治療糖尿病陽痿是一種很有前景的療法。Huang等[47]將 ADSCs注射入高脂血癥大鼠(Hyperlipidemic rats,HR) 陰莖海綿體后,其nNOS的表達及海綿體壓力 (Intracavernous pressure,ICP)都較對照組高。Albersen等[48]也證明ADSCs能有效改善神經(jīng)性勃起功能障礙 (Neurogenic erectile dysfunction,NED) 大鼠的陰莖勃起情況。

4.2 ADSCs在臨床上的應(yīng)用

目前,ADSCs除了在各個動物模型上的應(yīng)用取得了一定的成效,而且已經(jīng)開始在臨床上大量應(yīng)用于組織工程、心血管疾病、代謝性疾病、腦病[49-58]等 (表3)。

4.2.1 ADSCs在臨床心血管疾病上的應(yīng)用

來自荷蘭埃拉斯莫斯大學(xué)的杜克斯博士的科研小組[51]把心臟病人腹部脂肪的 ADSCs注射進他們的心臟以后,減少了心臟的損傷、同時也增加了血流,干細胞注射進心臟以后經(jīng)過 6個月,病人心臟接受帶氧血液的能力提高,心臟左心室送出的血液也增加了3.5倍,SPECT顯像證明接受ADSCs注射的病人心泵的能力增加了5.7%,核磁掃描也顯示患者的平均心肌疤痕面積由原來的 31.6%下降到15.4%,這一研究成果發(fā)布在2010年美國心臟協(xié)會科學(xué)年會上。

4.2.2 ADSCs在臨床組織工程上的應(yīng)用

ADSCs在組織修復(fù)過程中可以調(diào)節(jié)周圍組織中的生長激素和細胞因子如VEGF,ICG-1等防治細胞凋亡[52],Kim等[53-54]也證明ADSCs可以分泌各種皮膚生長因子如纖維細胞生長因子 (Basic fibroblast growth factor,bFGF) 等來促進成纖維細胞繁殖,并具有抗光老化、抗氧化、抗皺、抗紫外輻射等作用。Garcia-Olmo等[55]研究小組用ADSCs來治療病人復(fù)雜性肛瘺已經(jīng)進入到Ⅱ期臨床實驗。Yoshimura等[56]用人的ADSCs移植入15名乳房萎縮、大小不一或需要隆胸的患者乳房中,3D檢查顯示ADSCs的存活率達到40%~80%,12個月后,左右乳房大小均衡對稱,乳房X光檢測,被修復(fù)的乳房自然柔軟完全無鈣化,無囊腫現(xiàn)象,無明顯的注射疤痕。

表3 ADSCs目前的臨床研究Table 3 Ongoing human clinical trials of adipose-derived stem cells

續(xù)表3

4.2.3 ADSCs在臨床代謝性疾病上的應(yīng)用

最近的臨床研究顯示[57],肌內(nèi)注射ADSCs對糖尿病足和閉塞性動脈硬化癥也有一定的療效。在注射ADSCs的6個月后,從臨床上看,患者的靜息疼痛得到了緩解,無痛行走的距離明顯延長,而且并未發(fā)現(xiàn)任何并發(fā)癥。Vanikar等[58]將ADSCs誘導(dǎo)成胰島樣細胞移植入11名 (7名男性,4名女性)持續(xù)患有 1~24年不等的糖尿病患者中,術(shù)后隨訪23個月,發(fā)現(xiàn)患者的外源性胰島素用量從以前的1.14 units/(kg BW·d) 下降到0.63 units/(kg BW·d),HbA1c也從8.47%下降到7.39%,平均血清C-肽從0.1 pg/L增加到0.37 pg/L,患者的平均體重增加了2.5 kg,而且患者無不適或副反應(yīng)。

5 問題及前景展望

ADSCs最大的一個優(yōu)點便是含量豐富。實驗表明吸脂手術(shù)吸取的每 100 mL的脂肪組織中,ADSCs 的數(shù)量相當于等量骨髓中 BMSCs的 40倍,且成纖維細胞集落形成單位 (Colony-forming unit-fibroblast,CFU-F) 試驗中表明,ADSCs中干細胞數(shù)目至少是骨髓的500多倍[59-60],而且ADSCs比其他的干細胞分化時間要短,是目前生長最快的干細胞[61]。隨著肥胖癥患者的增多,人類脂肪開始“富余”,并漸成為累贅。臨床上脂肪抽吸術(shù)后脂肪組織大多丟棄,造成了寶貴干細胞的大量浪費。手術(shù)廢棄物組織再造再利用,說明ADSCs又是一個廉價的干細胞來源。ADSCs有可能成為一種廉價、可大量獲得的自體干細胞,同時不存在醫(yī)學(xué)倫理學(xué)和免疫排斥等問題。

目前,美國斯坦福大學(xué)的Sun等[62]研究人員在ADSCs和皮膚成纖維細胞中分別加入能夠編碼4種轉(zhuǎn)錄因子的基因 (Oct4、Sox2、Klf4、c-MYC) 后,約有萬分之一的皮膚成纖維細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎喙δ芨杉毎?(Induced pluripotent stem cells,iPS),而轉(zhuǎn)變?yōu)閕PS細胞的脂肪干細胞比例達到千分之二,是前者的20倍。利用脂肪干細胞培育的iPS細胞也通過了有關(guān)測試,它們能夠分化成人體內(nèi)的神經(jīng)細胞、肌肉細胞以及腸上皮細胞等,而且所轉(zhuǎn)變的 iPS細胞安全性更高,將來有望利用ADSCs培育人體所需的各種器官。

但是 ADSCs的研究甚至整個干細胞的研究目前都存在以下一些問題:1) 尚無法直接鑒定。常用的鑒定方法都是通過體外誘導(dǎo)多向分化,然后逆推之,才能得知是否為相應(yīng)的干細胞;2) ADSCs移植后,在體內(nèi)的遷移、轉(zhuǎn)歸不清楚。我們以前的研究[63-64]表明,炎癥期間一些細胞趨化因子具有使全身白細胞游走并遷移到創(chuàng)傷小鼠的創(chuàng)面,一氧化氮凝膠可以顯著促進皮膚干細胞的形成。那么,ADSCs移植后,是否也具有類似炎癥細胞的趨向遷移性?中醫(yī)中藥是我國的瑰寶,是否也有相關(guān)的中藥或中藥制劑能夠促進 ADSCs的形成與表達?ADSCs與中藥或中藥制劑對一些疾病的治療是否具有協(xié)同作用?中藥或中藥制劑能否提高 ADSCs的靶向性和有效性?3) 特異性標志物。不同的研究,不同的來源,不同的分化,ADSCs的標志物不同,因此亟需找到 ADSCs的特異性標志物。4) 目前國內(nèi)外ADSCs的研究主要在體外和動物體內(nèi)進行,如何將ADSCs的研究從實驗動物走向人體,且ADSCs培養(yǎng)條件是一種優(yōu)化過的環(huán)境,經(jīng)過這樣培養(yǎng)的ADSCs移植入人體后能否適應(yīng)體內(nèi)環(huán)境并保持強勢增長,ADSCs在實驗動物和人體內(nèi)的生長誘導(dǎo)環(huán)境是否相同,如果相異,相異點在哪里?這些都值得進一步地研究探討。

總之,隨著生物化學(xué)、材料化學(xué)、分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)等的發(fā)展,ADSCs與體細胞共培養(yǎng),誘導(dǎo) ADSCs定向分化已成為確實可行有研究前景的技術(shù),相信對 ADSCs共培養(yǎng)技術(shù)及機制的深入研究,將會模擬建立更為真實的生物體微環(huán)境培養(yǎng)系,應(yīng)用于ADSCs的分化誘導(dǎo),為組織工程、再生醫(yī)學(xué)以及各種人類疾病提供種子細胞。

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