趙萌，徐青，于繼云，余云舟

1 北京交通大學(xué)生命科學(xué)與生物工程研究院，北京 100044

2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

3 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京 100071

HIV (Human immunodeficiency virus) 屬于慢病毒屬，是一種潛伏期極長的逆轉(zhuǎn)錄病毒，它可以通過感染 CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞 (DC)等使機(jī)體免疫系統(tǒng)受損，最終導(dǎo)致患者艾滋病(AIDS) 的發(fā)生。艾滋病的蔓延對(duì)全世界人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展構(gòu)成了巨大的威脅，而目前尚無能夠徹底治療艾滋病的藥物和預(yù)防的疫苗。HIV通過一系列連續(xù)的過程進(jìn)入宿主細(xì)胞，HIV病毒主要表面蛋白gp120首先與細(xì)胞表面的分子CD4結(jié)合，使HIV外膜復(fù)合物發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，然后與細(xì)胞表面的趨化因子輔助受體CCR5或CXCR4結(jié)合，使病毒與宿主細(xì)胞膜接近和融合[1-2]。近些年在對(duì)于艾滋病人的治療中發(fā)現(xiàn)HIV-1抗原刺激DC所誘導(dǎo)的免疫可以控制血漿病毒載量并有效殺傷 HIV-1感染的細(xì)胞，并且研究發(fā)現(xiàn)成熟的DC可以增強(qiáng)機(jī)體T細(xì)胞對(duì)于HIV-1的免疫應(yīng)答[3]。Flt3-L可以極大刺激DC增殖、分化和成熟，在 DC靶向疫苗的研究中可以增強(qiáng)DC對(duì)HIV抗原遞呈作用[4-5]。趨化因子Mip-3α直接參與了DC細(xì)胞和T細(xì)胞的定向遷移，近期的研究發(fā)現(xiàn)Mip-3α還具有抗 HIV-1活性[6-7]。本研究中，首先設(shè)計(jì)了一個(gè)包含CD4和CCR5與gp120結(jié)合的主要功能結(jié)構(gòu)區(qū)及Flt3-L和Mip-3α分子的融合基因，目的是通過融合基因表達(dá)的CD4和CCR5與HIV表面蛋白gp120的雙重結(jié)合，捕獲病毒分子，從而阻斷病毒進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，然后通過Mip-3α對(duì)DC的趨化作用，將捕獲的病毒分子靶向 DC，從而抑制和清除病毒。其次我們體外合成了全長的基因分子，并分別構(gòu)建了包含 pABK-CKR5-CD4/ Flt3-L-Mip-3α (pABK-HIV-MF) 和pABK-CKR5-CD4 (pABK-HIV-MT) 的真核表達(dá)載體。pABK-HIV-MF表達(dá)的是全長的融合基因，而構(gòu)建 pABK-HIV-MT的目的是輔助性檢測 CKR5和 CD4的融合蛋白與gp120在體外是否能夠有效結(jié)合。最后，我們?cè)谡婧思?xì)胞中成功地表達(dá)了所構(gòu)建的載體，為下一步研究融合蛋白對(duì)HIV-1的拮抗及靶向DC清除作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎 293細(xì)胞、真核表達(dá)載體 pABK和pVAX-1-s-CD4為本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根公司。

1.2 方法

1.2.1 pABK-HIV-MT和pABK-HIV-MF真核表達(dá)載體的構(gòu)建

全長融合基因序列由北京擎科生物技術(shù)公司合成，合成的基因DNA連接在T-EASY載體上。擴(kuò)增HIV-MT和 HIV-MF融合基因的上游引物均包含BamHⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物均包含XbaⅠ的酶切位點(diǎn)，引物均由生工生物工程上海有限公司合成，引物序列參照表1。PCR、質(zhì)粒提取、DNA酶切、連接和轉(zhuǎn)化等操作方法參照相關(guān)試劑說明書和《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[8]。實(shí)驗(yàn)中的連接酶，DNA限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XbaⅠ購自New England Biolabs公司；2×Pfu PCR MasterMix，轉(zhuǎn)染用小量及中量質(zhì)粒提取試劑盒購自天根公司。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人胚腎 293細(xì)胞的培養(yǎng)使用 Freestyle?293 Expression Medium (Gibico)，待細(xì)胞密度生長至1×109個(gè)/L時(shí)，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染試劑使用293fectin?(Invitrogen)，按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.2.3 RT-PCR檢測HIV-MF在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄

轉(zhuǎn)染 48 h后收獲轉(zhuǎn)染 HIV-MF質(zhì)粒的人胚腎293細(xì)胞，每孔加入TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。取細(xì)胞總RNA 5 μL，按照Invitrogen SuperScript?III Reverse Transcriptase (Invitrogen) 的產(chǎn)品說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。引物序列參照表1，其中GAPDH特異性上下游引物和Oligo(dT)20購自東洋紡公司。

1.2.4 間接免疫熒光

轉(zhuǎn)染后24 h，取轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的人胚腎293細(xì)胞懸液1 mL移入6孔板，4 ℃、4 000 r/min離心5 min，沉淀細(xì)胞，在?20 ℃用5%醋酸 (溶于甲醇) 固定細(xì)胞；1% BSA (含0.5% Triton-100) 孵育10 min，PBS洗3次；1% BSA封閉1 h后，加入1∶250稀釋的兔抗人CD4一抗 (Santa Cruz)，37 ℃孵育1 h；PBS洗3次后，加溶于1%伊文氏藍(lán)及1% BSA中1∶200稀釋的 FITC-山羊抗兔二抗 (中杉金橋)，37 ℃孵育0.5 h，PBST洗3次；在熒光鏡下觀察并照相。

1.2.5 ELISA

轉(zhuǎn)染后72 h，取細(xì)胞懸液，離心，分別分離上清與細(xì)胞沉淀。上清使用0.45 μm濾膜過濾后可直接作樣品，細(xì)胞總蛋白的提取參照細(xì)胞裂解液(Promega) 說明書。將蛋白樣品分別與 PBS等體積混合后，加入96孔板中，每孔100 μL，每組樣品設(shè)2個(gè)平行，4 ℃包被過夜后，2% BSA封閉2 h；PBS洗2次后，每孔加入100 μL的1∶100稀釋兔抗人CD4一抗，37 ℃孵育1 h；PBST洗4次后，每孔加入50 μL的1∶2 000稀釋HRP-山羊抗兔二抗 (中杉金橋)，37 ℃孵育1 h；PBST洗4次，PBS洗1次后OPD室溫顯色10 min，用BioRad酶聯(lián)儀檢測492 nm和630 nm的A值。

1.2.6 Western blotting

轉(zhuǎn)染后 72 h，收集細(xì)胞，采用細(xì)胞裂解液(Promega) 提取胞內(nèi)總蛋白。將蛋白樣品與電泳上樣緩沖液混合后沸水煮5 min，立即置于冰上5 min，短暫離心。細(xì)胞總蛋白的上樣量為每泳道20 μg，10% SDS-PAGE膠分離樣品，200 mA濕轉(zhuǎn)2 h至PVDF膜上；室溫封閉2 h后，將膜與5%脫脂奶粉1∶5 000稀釋的鼠抗 His標(biāo)簽一抗 (中杉金橋) 和1∶10 000稀釋的鼠抗β-Tubulin一抗 (Abmart) 4 ℃共同孵育過夜；PBST洗膜3次，將膜與1：10 000稀釋的 HRP-山羊抗鼠二抗 (Santa Cruz) 室溫孵育1 h，PBST洗膜3次后；加入ECL試劑，室溫反應(yīng)5 min，暗室曝光，顯影，定影。

2 結(jié)果

2.1 HIV-1拮抗并靶向 DC的融合基因的設(shè)計(jì)和合成

本實(shí)驗(yàn)中我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)能夠捕獲HIV-1并靶向DC的融合基因，包含CD4等4個(gè)分子，其中CD4和CCR5能夠與HIV-1特異性結(jié)合，可以阻斷HIV的膜蛋白gp120與靶細(xì)胞表面受體結(jié)合，而Mip-3α分子可以募集DC，F(xiàn)lt3-L分子則能夠刺激DC的增殖。在4個(gè)不同的分子間，加入了連接序列，避免所表達(dá)分子間的相互作用。另外，為了方便融合蛋白的檢測和純化，我們?cè)谌诤匣?3末端加入了 6個(gè)組氨酸構(gòu)成的標(biāo)簽。在GenBank中獲取了對(duì)應(yīng)基因的核酸序列，各序列詳細(xì)信息見表 2。融合基因全長2 232 bp，序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析 (www.expasy. org) 表明融合基因?qū)?yīng)蛋白的分子量約84 kDa。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

表2 HIV-MF融合基因中各組分信息Table 2 Information of each component in HIV-MF

圖1 HIV-MF融合基因結(jié)構(gòu)Fig. 1 Component included in HIV-MF.

2.2 真核表達(dá)載體的鑒定

電泳結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒 pABK-HIV-MT和pABK-HIV-MF用BamHⅠ和XbaⅠ酶切后，條帶分別與載體和目的片段大小一致 (圖 2)。測序分析表明重組質(zhì)粒序列正確，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 HIV-MF的轉(zhuǎn)錄結(jié)果

圖2 重組質(zhì)粒pABK-HIV-MT和pABK-HIV-MF的酶切鑒定Fig. 2 Digestion of pABK-HIV-MT and pABK-HIV-MF. M: DNA marker; 1: pABK-HIV-MT plasmid; 2: pABK-HIV-MT digested with BamH I/Xba I; 3: pABK-HIV-MF plasmid; 4: pABK-HIV-MF digested with BamH I/Xba I.

用重組質(zhì)粒pABK-HIV-MF轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞，RT-PCR檢測重組質(zhì)粒在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。pABK-HIV-MF重組質(zhì)粒在2 244 bp左右有擴(kuò)增條帶，轉(zhuǎn)染 pABK-HIV-MF組和 pABK空載體組有GAPDH的擴(kuò)增條帶，以水為模板的空白對(duì)照組和未添加反轉(zhuǎn)錄酶處理的所有樣品 (圖略) 均無對(duì)應(yīng)擴(kuò)增條帶，表明pABK-HIV-MF在細(xì)胞中得到了特異的轉(zhuǎn)錄。

2.4 融合基因表達(dá)的間接免疫熒光檢測結(jié)果

間接免疫熒光檢測結(jié)果顯示陽性對(duì)照 (轉(zhuǎn)染pVAX-1-s-CD4真核表達(dá)載體) 及轉(zhuǎn)染 pABKHIV-MT和pABK-HIV-MF的人胚腎293細(xì)胞在鏡下觀察有染色 (圖 4)，而未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組沒有染色，表明融合基因HIV-MT和HIV-MF在細(xì)胞中得到了特異表達(dá)。

圖3 HIV-MF融合基因的RT-PCR產(chǎn)物Fig. 3 RT-PCR product of HIV-MF. M: DNA marker; 1: amplification of water by GAPDH primer; 2: amplification of water by specific primer; 3: amplification of pABK group by GAPDH primer; 4: amplification of pABK group by specific primer; 5: amplification of pABK-HIV-MF group by GAPDH primer; 6: amplification of pABK-HIV-MF group by specific primer.

2.5 融合基因表達(dá)的ELISA檢測結(jié)果

因?yàn)檎婧吮磉_(dá)載體pABK中帶有一段信號(hào)肽，可以使得表達(dá)的蛋白分泌到細(xì)胞外，所以細(xì)胞上清中會(huì)有表達(dá)的蛋白。我們采用間接ELISA法進(jìn)一步驗(yàn)證融合基因HIV-MT和HIV-MF在細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)上清中的表達(dá)情況。通過包被細(xì)胞總蛋白和培養(yǎng)上清，用CD4作為一抗孵育，每個(gè)樣品組設(shè)2個(gè)平行孔。同時(shí)設(shè)置多組對(duì)照組：一抗對(duì)照 (不加二抗只加一抗)，二抗對(duì)照 (不加一抗只加二抗)，陰性對(duì)照(未轉(zhuǎn)染組)。如圖5所示，轉(zhuǎn)染pABK-HIV-MT和pABK-HIV-MF的培養(yǎng)上清和細(xì)胞內(nèi)總蛋白CD4抗體檢測結(jié)果呈陽性，未處理組和所有對(duì)照組呈陰性，表明融合蛋白在人胚腎 293細(xì)胞中得到了特異表達(dá)，并且分泌到了細(xì)胞外。

2.6 HIV-MF的Western blotting結(jié)果

為了進(jìn)一步檢測HIV-MF在人胚腎293細(xì)胞中的表達(dá)及估計(jì)其蛋白分子量的大小，我們用抗 His標(biāo)簽和抗β-Tubulin內(nèi)參抗體對(duì)轉(zhuǎn)染HIV-MF真核表達(dá)載體后人胚腎 293細(xì)胞的胞內(nèi)總蛋白進(jìn)行了Western blotting分析，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染HIV-MF真核表達(dá)載體組存在特異性條帶和內(nèi)參條帶，而對(duì)照組只見內(nèi)參條帶 (圖6)，其結(jié)果確定了HIV-MF融合基因在人胚腎293細(xì)胞中獲得了正確的表達(dá)。

3 討論

目前美國FDA批準(zhǔn)用于治療HIV-1的藥物主要是逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑，這兩種藥物在使用中均有不良反應(yīng)，很難抑制病毒的復(fù)制，且極易導(dǎo)致病毒變異，出現(xiàn)耐藥。而HIV進(jìn)入/融合抑制類藥物由于不受耐藥性影響，成為非常有吸引力的藥物研制方向。HIV通過外膜蛋白 gpl20與靶細(xì)胞表面的CD4受體及趨化因子受體CCR5和CXCR4結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞，因此與 gpl20結(jié)合的高度保守區(qū)域?yàn)?HIV進(jìn)入/融合抑制類藥物作用提供了靶點(diǎn)。其中，PRO542是由CD4的Dl～D2區(qū)和天然抗體IgG2的保守區(qū)融合而成的重組蛋白，正處于Ⅱ期臨床研究階段。另一種抗CD4的單克隆抗體Ibalizumab可阻斷HIV-1與細(xì)胞表面受體CD4結(jié)合，在一期臨床實(shí)驗(yàn)中也獲得了較好的抗病毒效應(yīng)。而 Maraviroc作為第一個(gè)CCR5拮抗劑已于2007年8月被美國FDA批準(zhǔn)上市[9-10]，隨訪結(jié)果顯示Maraviroc具有良好的安全性和抗病毒效應(yīng)[11]。

圖4 融合基因的間接免疫熒光檢測結(jié)果Fig. 4 Immunofluorescent assay of the fusion gene expressing in cells. (A) Transfected with plasmid pABK-HIV-MT. (B) Transfected with plasmid HIV-MF. (C) Transfected with plasmid pVAX-1-s-CD4 (positive control). (D) Untreated group (negative control).

圖5 融合蛋白表達(dá)的ELISA檢測結(jié)果Fig. 5 ELISA analysis of the fusion gene in cells. 1: culture medium of HEK293 transfected with plasmid pABK-HIV-MT; 2: culture medium of HEK293 transfected with plasmid pABK-HIV-MF; 3: intracellular protein of HEK293 transfected with plasmid pABK-HIV-MT; 4: intracellular protein of HEK293 transfected with plasmid pABK-HIV-MF; 5: untransfected group.

圖6 融合蛋白HIV-MF表達(dá)的Western blotting鑒定Fig. 6 Western blotting of fusion protein HIV-MF in cells. 1: intracellular protein of HEK293 transfected with plasmid pABK-HIV-MF; 2: untreated group.

根據(jù)上述的研究結(jié)果，本研究中我們?cè)O(shè)計(jì)的融合基因HIV-MF理論上可以通過CD4和CCR5與HIV表面蛋白gp120的雙重結(jié)合，捕獲病毒分子，然后通過Mip-3α對(duì)DC的趨化作用，將捕獲的病毒分子靶向DC，從而抑制和清除病毒，而Flt3-L分子則可以刺激DC的增殖、分化和成熟，增強(qiáng)DC對(duì)HIV抗原遞呈作用。本研究采用多種不同的方法來檢測HIV-MF在細(xì)胞中的表達(dá)情況，不同的檢測方法得到了一致的結(jié)果，說明含融合基因的真核表達(dá)載體已被成功構(gòu)建并在細(xì)胞中獲得了正確的表達(dá)，為研究融合蛋白對(duì)HIV-1的的拮抗及靶向DC的作用奠定了基礎(chǔ)。下一步我們將純化融合蛋白HIV-MT和 HIV-MF，首先在體外檢測它們是否可與 gp120結(jié)合，然后驗(yàn)證其對(duì)HIV的捕獲以及HIV-MF分子是否可以募集，并刺激DC的增殖和分化。

REFERENCES

[1] Yu Y, Xiao GF, Li M, et al. Molecular mechanism of the entry of HIV-1 into cells and the related drug research. Prog Biochem Biophys, 2003, 30(1): 13?18.余勇, 肖庚富, 李敏, 等. 人類免疫缺陷病毒-1進(jìn)入細(xì)胞的分子機(jī)制及相關(guān)藥物的研究. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2003, 30(1): 13?18.

[2] Weber J. The pathogenesis of HIV-1 infection. Br Med Bull, 2001, 58(1): 61?72.

[3] Huang XL, Fan Z, Borowski LA, et al. Dendritic cells reveal a broad range of MHC class I epitopes for HIV-1 in persons with suppressed viral load on antiretroviral therapy. PLoS One, 2010, 5(9): e12936.

[4] Bozzacco L, Trumpfheller C, Huang Y, et al. HIV gag protein is efficiently cross-presented when targeted with an antibody towards the DEC-205 receptor in Flt3 ligand-mobilized murine DC. Eur J Immunol, 2010, 40(1): 36?46.

[5] Gamvrellis A, Leong D, Hanley JC, et al. Vaccines that facilitate antigen entry into dendritic cells. Immunol Cell Biol, 2004, 82(5): 506?516.

[6] Yue HL, Peng DZ. Structure and function of CCL20. Immunol J, 2004, 20(3): 100?102.岳海嶺, 彭代智. CCL20的結(jié)構(gòu)與功能. 免疫學(xué)雜志, 2004, 20(3): 100?102.

[7] Ghosh M, Shen Z, Schaefer TM. CCL20/MIP3α is a novel anti-HIV-1 molecule of the human female reproductive tract. Am J Reprod Immunol, 2009, 62(1): 60?71.

[8] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

[9] Kuritzkes DR. HIV-1 entry inhibitors: an overview. Curr Opin HIV AIDS, 2009, 4(2): 82?87.

[10] Alkhatib G. The biology of CCR5 and CXCR4. Curr Opin HIV AIDS, 2009, 4(2): 96?103.

[11] Hardy WD, Gulick RM, Mayer H, et al. Two-year safety and virologic efficacy of maraviroc in treatmentexperienced patients with CCR5-tropic HIV-1 infection: 96-week combined analysis of MOTIVATE 1 and 2. J Acquir Immune Defic Syndr, 2010, 55(5): 558?564.